LABORATORIUM

BIOTECHNOLOGII II

SPRAWOZDANIE

ĆWICZENIE nr 3

TEMAT: IMMOBILIZOWANE BIOKATALIZATORY

WYDZIAŁ: BIOTECHNOLOGII I NAUK O ŻYWIENIU CZŁOWIEKA

KIERUNEK: BIOTECHNOLOGIA

ROK AKADEMICKI: 2012/2013

DATA WYKONANIA ĆWICZENIA : 29.03.2012

DZIEŃ TYGODNIA : CZWARTEK

GODZINA : 8.15 – 12.00

SKŁAD GRUPY

IMIĘ I NAZWISKO	NUMER ALBUMU
Ewa Majda
Marta Cichoń
Olga Fronczyk
Michał Orzechowski	178387

OCENA Z SPRAWOZDANIA …………………

UWAGI PROWADZĄCEGO: …………………………………………….…..………………………………….………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………

PODPIS ……………………

1. CEL ĆWICZENIA

• Poznanie metody immobilizacji drobnoustrojów w alginianie wapnia.

• Sprawdzenie stabilności matrycy alginianowej w różnych środowiskach.

• Określenie efektywności działania immobilizowanej β-fruktofuranozydazy (w żelu alkohol poliwinylowy (PVA)-alginian) w reakcji hydrolizy sacharozy.

2. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

2.1. Immobilizacja drobnoustrojów metodą pułapkowania w alginianie wapnia.

Połączono 3% alginianu sodu z zawiesiną komórek drożdży Saccharomyces ceravisiae w stosunku 1:1 (po 10 cm³) i dokładnie wymieszano. Następnie za pomocą strzykawki z igłą wkroplono zawiesinę komórek do 1% oziębionego roztworu chlorku wapnia cały czas delikatnie mieszając zawartość zlewki za pomocą mieszadła magnetycznego. Powstałe sferyczne formy alginianu wapnia pozostawiono do utwardzenia. Po około 30 minutach kuleczki odsączono, przemyto wodą destylowaną i przeniesiono do roztworu soli fizjologicznej.

Następnie jednakowe porcje immobilizowanych drożdży (5 kuleczek) umieszczono w probówkach zawierających odpowiednio: wodę, 0,15M roztwór cytrynianiu sodu, fosforan (2% K₂HPO₄), wersanian sodowo-potasowy (2%NaCl z 0,2% EDTA) i pozostawiono je w tych środowiskach na ok. 30 minut, często i energicznie mieszając. Wyniki obserwacji zestawiono w tabeli nr.1.

Tabela 1. Stabilność matrycy alginianowej w różnych środowiskach.

Odczynnik	Rozmiękczenie kulek	Rozpuszczenie kulek	Zmętnienie roztworu	Osad
woda	-	-	-	-
EDTA	+	-	-	-
K2HPO4	+	+	+	+
cytrynian	+	+	+	-

2.2. Zastosowanie immobilizowanej β-fruktofuranozydazy do hydrolizy sacharozy.

Wskazaną przez prowadzącego porcję preparatu immobilizowanej w żelu PVA-alginian β-fruktofuranozydazy (4 kuleczki katalizatora 2) umieszczono w buteleczke o objętości ok. 100 cm³. Po dodaniu 10cm³ 3%-owego roztworu sacharozy buteleczkę zakręcono i wraz z próbą materiałową zawierającą tylko roztwór sacharozy umieszczono w termostatowanej wstrząsarce o temperaturze 40^oC. Po dokładnie 30 minutach oznaczono ilość cukrów redukujących powstałych w efekcie hydrolizy metodą Samogoy -Nelsona.

Określenie stężenia cukrów redukujących w hydrolizatach sacharozy (metoda

Samogoya-Nelsona) :

Po 1cm³ odpowiednio rozcieńczonych hydrolizatów sacharozy pobrano do probówek i po czym do każdej dodano 1cm³ odczynnika miedzowego (próby właściwe). Równolegle wykonano próbę odczynnikową zawierająca wodę destylowaną i odczynnik miedziowy. Następnie wszystkie próbki wstawiono do wrzącej łaźni wodnej. Po 10 minutach schłodzono próbki w strumieniu zimnej wody, dodano po 1 cm³ roztworu Nelsona i dokładnie wymieszano do zaniku pęcherzyków gazu. Po 10 minutach zmierzono absorbancje prób (właściwej i materiałowej) wobec odczynnikowej przy długości fali 520 nm. Analizy wykonano w dwóch powtórzeniach.

Wyniki pomiarów wszystkich grup zestawiono w tabeli nr 2.

Tabela 2. Zestawienie wyników uzyskanych przez wszystkie grupy.

Biokatalizator nr.	Masa 5ciu kulek biokatalizatora mB [mg]	Stężenie inwertazy z żelu Cin [µg/g]	Udział białka w preparacie inwertazy Cbiałk [g/g]	Rozcieńczenie próby do analizy R	A520	A520 śr
1	80	27	0,264	5	0,275 0,360 0,290 0,350	0,319
2	75	25	0,264	5	0,270 0,240	0,255
Próba materiałowa (3% sacharoza)	1	0,280

3. OBLICZENIA

Obliczenie stężenia cukrów redukujących korzystając ze wzoru :

K -- 0,5[μmol_glukozy/cm³]- współczynnik obliczony na podstawie krzywej wzorcowej

ΔE₅₂₀-- różnica absorbancji między badaną próbą (właściwą lub materiałową), a próbą odczynnikową

R -- rozcieńczenie

dla preparatu 1

$$C_{WL} = K \bullet E_{520} \bullet R = 0,5 \bullet 0,319 \bullet 5 = 0,798\left\lbrack \frac{\text{μmol}_{\text{glukozy}}}{\text{cm}^{3}} \right\rbrack$$

dla preparatu 2

$$C_{WL} = K \bullet E_{520} \bullet R = 0,5 \bullet 0,255 \bullet 5 = 0,638\left\lbrack \frac{\text{μmol}_{\text{glukozy}}}{\text{cm}^{3}} \right\rbrack$$

Obliczenia dla próby materiałowej:

$$C_{\text{MAT}} = K \bullet E_{520} \bullet R = 0,5 \bullet 0,280 \bullet 1 = 0,140\left\lbrack \frac{\text{μmol}_{\text{glukozy}}}{\text{cm}^{3}} \right\rbrack$$

Stężenie cukrów redukujących uwolnionych podczas procesu hydrolizy przy udziale immobilizowanej inwertazy wynosi :

dla preparatu 1

$$C = C_{WL} - C_{\text{MAT}} = 0,798 - 0,140 = 0,658\left\lbrack \frac{\text{μmol}_{\text{glukozy}}}{\text{cm}^{3}} \right\rbrack$$

$$C = C_{WL} - C_{\text{MAT}} = 0,638 - 0,140 = 0,498\left\lbrack \frac{\text{μmol}_{\text{glukozy}}}{\text{cm}^{3}} \right\rbrack$$

Obliczenie aktywności β-fruktofuranozydazy immobilizowanej w żelu alginianowo-poliwynylowym zestalonym jonami Ca²⁺ i usieciowionym aldehydem glutarowym :

aktywność biokatalizatora

Δc- stężenie cukrów redukujących uwolnionych podczas procesu hydrolizy przy udziale immobilizowanej inwertazy

V=10cm³ - ilość roztworu sacharozy poddawana hydrolizie

T- czas

m_bioka - masa biokatalizatora (żelu)

dla preparatu 1

$$A_{\text{biokat}} = \frac{C \bullet V}{t \bullet m_{\text{biokat}}} = \frac{0,658 \bullet 10}{30 \bullet 0,08} = 2,740\left\lbrack \frac{\text{μmol}_{\text{CR}}}{min \bullet g_{\text{biokat}}} \right\rbrack$$

dla preparatu 2

$$\mathbf{A}_{\mathbf{\text{biokat}}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{C \bullet V}}{\mathbf{t \bullet}\mathbf{m}_{\mathbf{\text{biokat}}}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{0,}\mathbf{49}\mathbf{8 \bullet 10}}{\mathbf{30 \bullet 0,08}}\mathbf{= 2,}\mathbf{075}\left\lbrack \frac{\mathbf{\text{μmol}}_{\mathbf{\text{CR}}}}{\mathbf{min \bullet}\mathbf{g}_{\mathbf{\text{biokat}}}} \right\rbrack$$

aktywność właściwa immobilizowanej inwertazy

dla preparatu 1

$$A_{WL} = \frac{A_{\text{biokat}} \bullet 10^{6}}{0,264 \bullet 27} = \frac{2,74 \bullet 10^{6}}{0,264 \bullet 27} = 3,844 \bullet 10^{5}\left\lbrack \frac{\text{μmol}}{min \bullet g_{bialka}} \right\rbrack$$

dla preparatu 2

$$A_{WL} = \frac{A_{\text{biokat}} \bullet 10^{6}}{0,264 \bullet 27} = \frac{2,075 \bullet 10^{6}}{0,264 \bullet 25} = 3,144 \bullet 10^{5}\left\lbrack \frac{\text{μmol}}{min \bullet g_{bialka}} \right\rbrack$$

Aktywność immobilizowanych preparatów inwertazy (biokatalizator 1 i 2) zastawiono w tabeli 3.

Tabela 3. Aktywność immobilizowanych preparatów inwertazy (biokatalizator 1 i 2).

Biokatalizator	CWŁ	CMAT	Δc	ABIOK	AWŁ
Jednostka
1	0,798	0,140	0,658	2,740	3,844·10^5
2	0,638		0,498	2,075	3,144·10^5

4. WNIOSKI

4.1. Immobilizacja drobnoustrojów metodą pułapkowania w alginianie wapnia.

Matryca alginianowa jest najbardziej stabilna w środowisku wodnym. W czasie 30 minutowej obserwacji sferycznych form alginianu wapnia nie zauważono żadnych zmian fizycznych. Lekkie zmiękczenie kuleczek w roztworze EDTA związanie jest dużym powinowactwem tego odczynnika do jonów dwuwartościowych. Wersenian sodowo-potasowy wnika do struktury nośnika i destabilizuje ją w wyniku chelatowania jonów Ca²⁺. Silne mieszanie nie powoduje rozpuszczenia kuleczek, tylko ich rozpad co stopniowo prowadzi do uwolnienie komórek drożdży. Kłaczkowaty osad w probówce z K₂HPO₄ to słabo rozpuszczalna sól wapniowa. Fosforan naruszył matryce algnianową i spowodował uwolnienie komórek Saccharomyces ceravisiae (zmętnienie roztworu). W probówce zawierającej kwas cytrynowy zaobserwowano szybkie rozpuszczenie się kuleczek i wzrost mętności roztworu. Stąd wniosek, że algininian wapnia mało odporny na działanie kwasów organicznych.

W przemyśle zastosowanie odpowiedniego nośnika w immobilizacji komórek bakterii lub drożdży warunkuje zachowanie swoistości substratu i aktywności immobilizowanej biomasy przez dłuższy czas.

Po immobilizacji następuje wydłużenie czasu przechowywania i zwiększenie stabilności preparatów enzymatycznych. Aktywność preparatów nowych jest dość duża. Preparaty starsze (kilkuletnie) zachowują pewną aktywność, jednak jest ona niższa niż aktywność preparatów przygotowanych później.