LABORATORIUM BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁOWEJ
Kierunek:
Biotechnologia
Specjalność:
Agrobiotechnologia
Studium:
dzienne
ĆWICZENIE NR 16
PRODUKCJA IMMOBILIZOWANEGO
KATALIZATORA METODĄ PUŁAPKOWANIA I
MIKROKAPSUŁKOWANIA.
UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNO – PRZYRODNICZY
W
YDZIAŁ
T
ECHNOLOGII I
I
NśYNIERII
C
HEMICZNEJ
Katedra InŜynierii Chemicznej i Bioprocesowej
B
YDGOSZCZ
Laboratorium biotechnologii przemysłowej.
Ć
wiczenie nr 16.
2
1. Wprowadzenie
Tradycyjnie prowadzi się procesy biosyntezy lub biotransformacji za pomocą
enzymów natywnych lub zawiesiny komórek drobnoustrojów. Tego typu rozwiązania
procesowe mają szereg wad i z tego względu immobilizowane (unieruchomione)
biokatalizatory znajdują coraz szersze zastosowanie w biotechnologii przemysłowej.
Immobiliozowane biokatalizatory otrzymuje się z materiału biologicznego w postaci całych
komórek, struktur podkomórkowych lub enzymów.
Zastosowanie biokatalizatora w postaci immobilizowanych komórek ma następujące
zalety:
•
Wysoka koncentracja komórek w jednostce objętości bioreaktora prowadzi do wzrostu
produktywności
•
Istnieje moŜliwość prowadzenia ciągłego procesu w kontrolowanych warunkach
•
Łatwe wydzielanie i oczyszczanie produktów
•
Mniejsze niebezpieczeństwo zakaŜenia przy krótkich czasach przebywania roztworu
reakcyjnego w bioreaktorze
Występują takŜe pewne wady przy tym rozwiązaniu procesowym:
•
Utrudniony dopływ substratów i odpływ produktów na skutek oporów dyfuzyjnych
•
Zakłócenie procesów metabolicznych w przypadku uŜycia Ŝywych komórek
•
Nakłady na produkcję immobilizowanego enzymu
Znanych jest wiele metod immobilizacji materiału biologicznego. Dobór odpowiedniej
metody zaleŜy od wymogów jakie musi spełnić immobilizowany biokatalizator w danym
procesie .
Immobilizacje materiału biologicznego moŜna uzyskać przez następujące metody:
1.
Agregację fizyczna lub chemiczną
2.
Wiązanie z nośnikiem poprzez adsorpcję lub wiązanie kowalencyjne,
3.
Pułapkowanie (inkluzję) w sieci polimerowej lub kapsułkowanie.
Agregację uznaje się za jeden z najprostszych sposobów immobilizacji. JeŜeli chodzi
o metody fizyczne to stosuje się je w praktyce tylko dla komórek mikroorganizmów, które
wykazują w określonych warunkach tendencję do tworzenia agregatów (flokuł). Agregację
chemiczna realizuje się przez działanie na materiał biologiczny substancjami zawierającymi
dwie grupy funkcyjne (aldehyd glutarowy, karbodiimidy itd.). Z reguły występują trudności
przy kontrolowaniu wielkości cząstek agregatów, a ponadto ich wytrzymałość mechaniczna
jest często niewystarczająca.
Wiązanie z nośnikiem jest metodą immobilizacji o znacznie większym, praktycznym
znaczeniu. Podstawowe wymagania w odniesieniu do materiałów jako nośników są
następujące:
- trwałość chemiczna i biologiczna,
Laboratorium biotechnologii przemysłowej.
Ć
wiczenie nr 16.
3
- odporność na ścieranie,
- duŜa powierzchnia właściwa,
- dogodna postać z technologicznego punktu widzenia( np. kuliste granulki maja małe
opory przepływu przez złoŜe,
- niska cena.
Nośniki do immobilizacji dzieli się na nieorganiczne i organiczne. Do nośników
nieorganicznych zalicza się: krzemionkę, tlenki metali (np. glinu, tytanu), szkło porowate,
materiały ceramiczne, naturalne glinokrzemiany, bentonit. Jako nośniki organiczne stosuje się
następujące materiały:
- polisacharydy (celuloza, dekstran, agaraza, chitozan itd.)
- polimery syntetyczne (poliakryloamid, poliuretany, poliamidy, itd.)
- jonowymienne Ŝywice polimerowe (Amberlit, Duolit),
- kolagen.
Immobilizację całych komórek prowadzi się bardzo często przez inkluzję
(pułapkowanie) w polimerach. Stosowane są polimery syntetyczne (poliakryloamid,
poliuretany, poliamidy itd.) lub pochodzenia naturalnego (agar, alginiany, chitozan, karagen
itd.). W trakcie polimeryzacji polimerów syntetycznych często dochodzi do dezaktywacji
materiału biologicznego. Zaletą polimerów naturalnych są łagodne warunki podczas
immobilizacji.
Immobilizowane komórki drobnoustrojów stosuje się obecnie do prowadzenia szeregu
procesów biotechnologicznych. Taka forma biokatalizatora pozwala na wielokrotny wzrost
produktywności w porównaniu do tradycyjnych metod fermentacyjnych. WaŜną zaletą
immobilizowanych biokatalizatorów jest moŜliwość uciąglenia procesów przez zastosowanie
bioreaktorów ze złoŜem stałym lub fluidalnym.
1.1. Immobilizacja metodą inkluzji
W metodzie inkluzji uzyskuje się najtrwalsze związanie materiału biologicznego
z nośnikiem. Istota tej metody polega na tym, Ŝe materiał biologiczny znajduje się
w trójwymiarowej sieci splecionych łańcuchów polimerowych. Średnica porów musi być
mniejsza od średnicy cząstek materiału biologicznego. Z drugiej strony pory muszą być na
tyle duŜe, aby zapewnić swobodną dyfuzję substratów i produktów. Zwykle uzyskiwane
nośniki mają strukturę o znacznej porowatości. Przykładowo porowatość Ŝeli pochodzących
od kwasu akrylowego wynosi od 50% do 90%.
Nośniki syntetyczne uzyskuje się przez polimeryzację w bloku lub metodą emulsyjną.
W celu przeprowadzenia immobilizacji przygotowuje się mieszaninę reakcyjną, która zawiera
następujące składniki: materiał biologiczny, monomer, czynnik sieciujący (jeŜeli jest to
Laboratorium biotechnologii przemysłowej.
Ć
wiczenie nr 16.
4
niezbędne) i wodny roztwór buforowy. W niektórych przypadkach wprowadza się do
mieszaniny dodatki, chroniące materiał biologiczny przed dezaktywacją. Następnie do
mieszaniny dodaje się czynniki inicjujące polimeryzację (nadsiarczany, fotoinicjatory).
Polimeryzacja trwa zwykle od kilku minut do kilku godzin i ma charakter rodnikowy.
Ze względu na wydzielające się ciepło mieszanina reakcyjna musi być chłodzona.
Spolimeryzowany Ŝel z materiałem biologicznym rozdrabnia się mechanicznie i dlatego
otrzymywane cząstki charakteryzują się duŜą niejednorodnością pod względem rozmiarów
i kształtów.
W niektórych przypadkach lepszym rozwiązaniem jest zastosowanie polimeryzacji
emulsyjnej. Podczas procesu łatwiej odprowadzać ciepło, a uzyskiwane granulki
biokatalizatora mają kształt kulisty i ich wytrzymałość mechaniczna jest kilkakrotnie większa,
niŜ uzyskanych przez mechaniczne rozdrobnienie spolimeryzowanego bloku. W metodzie
emulsyjnej stosuje się jednak rozpuszczalniki organiczne (toluen, chloroform), które mogą
oddziaływać negatywnie na materiał biologiczny.
Zastosowanie polimerów pochodzenia naturalnego jako nośników pozwala na
wyeliminowanie wielu wad, które występują przy otrzymywaniu nośników syntetycznych.
Podstawową zaletą polimerów naturalnych są bardzo łagodne warunki podczas immobilizacji
materiału biologicznego. Z drugiej strony takie biokatalizatory mają równieŜ pewne wady.
Najczęściej ich wytrzymałość mechaniczna jest mniejsza i moŜe to powodować szereg
problemów przy realizacji procesu w skali przemysłowej.
1.2. Immobilizacja metodą kapsułkowania
Kapsułkowanie jest metodą polegają na otaczaniu materiału biologicznego (tzw.
rdzenia) cienką, półprzepuszczalną błoną, przez którą mogą dyfundować małocząsteczkowe
substraty i metabolity, natomiast niemoŜliwa jest migracja komórek. Rdzeń moŜe stanowić od
10 % do 90 % ogólnej masy kapsułki, moŜe być jednoskładnikowy bądź stanowić mieszaninę
w postaci stałej, ciekłej lub gazowej. Membrana moŜe mieć budowę jedno- lub
wielowarstwową i moŜe być wytworzona ze związków naturalnych bądź syntetycznych, np.
Ŝ
elatyny, gumy arabskiej, tłuszczów, pochodnych celulozy, Ŝywic, polietylenu, alginianów i
innych.
Obecnie kapsułkowanie znalazło zastosowanie w immobilizacji komórek
zwierzęcych, roślinnych, bakterii, glonów oraz grzybów. Ze względu na średnicę, kapsułki
dzieli się na: nanokapsułki (poniŜej 0,2 µm), mikrokapsułki (0,2 – 5000 µm) oraz
Laboratorium biotechnologii przemysłowej.
Ć
wiczenie nr 16.
5
mikrokapsułki (powyŜej 5000 µm). Kształt mikrokapsułek zaleŜy od metody kapsułkowania,
a takŜe od rodzaju substancji wchodzących w skład rdzenia i błony. Najczęściej wytwarza się
kapsułki idealne sferycznie, poniewaŜ istnienie tzw. ogonków moŜe w przypadku ich
oderwania doprowadzić do wycieku wolnych komórek z rdzenia.
1.3. Alginiany
Alginiany naleŜą do polisacharydów najczęściej stosowanych do immobilizacji
komórek mikroorganizmów. Kwas alginowy lub jego sole (alginiany) otrzymuje się
z brunatnych alg morskich. Alginiany są zbudowane z długich prostych łańcuchów kwasu
β
-D-mannuronowego
i
kwasu
α
-L-guluronowego,
połączonych
wiązaniami
1
→
4-glikozydowymi. W wodorostach alginiany pełnią funkcje strukturalne, podobnie jak
celuloza w roślinach i występują w postaci mieszaniny soli sodowej, wapniowej
i magnezowej. Ekstrakcja alginianów odbywa się w ten sposób, Ŝe wodorosty poddaje się
działaniu ługu sodowego, a następnie oddziela się części nierozpuszczalne poprzez filtrację.
Roztwór alginianu sodowego jest dalej oczyszczany i suszony w suszarkach rozpyłowych.
Alginiany są szeroko stosowane w przemyśle spoŜywczym jako czynniki zagęszczające,
stabilizujące, emulgujące i Ŝelujące. Roztwory alginianów Ŝelują pod wpływem jonów
dwuwartościowych (poza Mg
2+
) i trójwartościowych. Właściwości otrzymanych Ŝeli są ściśle
skolerowane z budową i długością bloków zawierających jednostki kwasu guluronowego (G-
bloki) w łańcuchu polimerowym. Zaproponowano model “egg-box”, opisujący Ŝelowanie
bloków kwasu guluronowego (rys.1). Wielowartościowe jony, a w szczególności jony
wapniowe, tworzą chelatujące kompleksy z blokami G zawierającymi ponad 20 jednostek
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
Rys.1. Schemat modelu Ŝelowania alginianów pod wpływem jonów Ca
2+
Zastosowanie alginianów ograniczone jest brakiem stabilności Ŝelu, gdy występują
w środowisku reakcji substancje wykazujące znaczne powinowactwo wobec jonów Ca
2+
.
Laboratorium biotechnologii przemysłowej.
Ć
wiczenie nr 16.
6
2. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest
a)
zapoznanie się z metodą otrzymywania immobilizowanego biokatalizatora przez
pułapkowanie komórek droŜdŜy w Ŝelu alginianu wapnia
b)
zapoznanie się z metodą immobilizacji komórek droŜdŜy w alginianie wapnia metodą
kapsułkowania
c)
wyznaczenie współczynnika efektywności otrzymanego biokatalizatora na podstawie
badań jego aktywności.
3. Część doświadczalna
pompa infuzyjna
zlewka
statyw
mieszadełko
magnetyczne
strzykawka
Rys. 2. Zestaw do produkcji granulek/kapsułek
Laboratorium biotechnologii przemysłowej.
Ć
wiczenie nr 16.
7
3.1. Produkcja biokatalizatora metodą pułapkowania
Produkowane będą granulki biokatalizatora przez pułapkowanie (inkluzję) komórek
droŜdŜy Saccharomyces cerevisiae w Ŝelu alginianu wapnia. Najpierw naleŜy przygotować
roztwór alginianu sodu o stęŜeniu 2% mas. Następnie odmierza się 15ml wody destylowanej
do zlewki, wprowadza się 5-15g wilgotnych droŜdŜy piekarskich (dokładną wielkość próbki
droŜdŜy poda prowadzący ćwiczenia) i miesza w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny.
Następnie do 5g zawiesiny naleŜy stopniowo wprowadzić około 25g roztworu alginianu i
dokładnie wymieszać. Do Ŝelowania będzie stosowany roztwór CaCl
2
o stęŜeniu 1% mas. i w
ilości 50ml, który powinien być wcześniej przygotowany.
Przygotowaną zawiesinę naleŜy pobierać strzykawką, którą następnie montuje się w
pompie infuzyjnej. Pod strzykawką umieszcza się w zlewce roztwór Ŝelujący: CaCl
2
o
stęŜeniu 1% mas. i w ilości 50ml. Po uruchomieniu pompy infuzyjnej krople zawierające
alginian i komórki droŜdŜy wpadają do roztworu w zlewce i Ŝelują. Po zakończeniu
wkraplania naleŜy odczekać około 15 min, aby doprowadzić do całkowitego zŜelowania
granulek biokatalizatora. Po upływie tego czasu granulki naleŜy odsączyć na sitku i po
przemyciu H
2
O
(dest)
są one gotowe do dalszych badań.
3.2. Produkcja biokatalizatora metodą kapsułkowania
Kapsułkowanie droŜdŜy Saccharomyces cerevisiae będzie przeprowadzane metodą
jednostopniową w 1% alginianie sodu o niskiej lepkości. W tym celu naleŜy odwaŜyć 12g
wilgotnych droŜdŜy piekarskich i zmieszać je z 3ml 4% CaCl
2
, który powinien być wcześniej
przygotowany. Następnie naleŜy odmierzyć do 100ml zlewki około 50ml alginianu sodu.
Przygotowaną zawiesinę droŜdŜy naleŜy pobrać strzykawką zaopatrzoną w igłę o
ś
rednicy 1,2mm, którą następnie montuje się w pompie infuzyjnej. Pod strzykawką umieszcza
się na mieszadełku zlewkę z alginianem i ustawia obroty mieszadełka tak, aby powstał
niezbyt duŜy lej i aby krople zawiesiny trafiały na jego brzeg. Po uruchomieniu pompy
infuzyjnej krople wpadają do alginianu. W momencie zetknięcia się jonów Ca
2+
z zawiesiny z
alginianem następuje jego Ŝelowanie na zewnętrznej warstwie kropli. W celu uformowania
kulistej kapsułki z równomierną otoczką konieczne jest zastosowanie odpowiednio
dobranych, łagodnych obrotów. Wkraplanie naleŜy prowadzić tylko przez 2 minuty, gdyŜ
przy zbyt duŜej ilości kropel zawiesiny w alginianie moŜe następować ich zlepianie. Po
zakończeniu wkraplania pozostawić zlewkę jeszcze przez 6 min. na mieszadełku, odsączyć na
Laboratorium biotechnologii przemysłowej.
Ć
wiczenie nr 16.
8
sitku i kilkukrotnie przepłukać otrzymane kapsułki wodą wodociągową. Następnie Kapsułki
naleŜy przenieść do 60ml 1% CaCl
2
i mieszać jeszcze przez 15 min. Po upływie tego czasu
kapsułki naleŜy ponownie odsączyć na sitku i po przemyciu H
2
O
(dest)
są one gotowe do
dalszych badań.
3.3. Określanie kontrakcji objętości kropli na skutek Ŝelowania
W celu określenia kontrakcji objętości kropli wyznacza się najpierw masę 10 kropli
roztworu, a przy obliczaniu objętości pojedynczej kropli przyjmuje się, Ŝe gęstość zawiesiny
droŜdŜy wynosi ρ = 1050 kg/m
3
. Objętość pojedynczej granulki/kapsułki oblicza się na
podstawie pomiaru średnic 10 szt. granulek za pomocą mikroskopu. Współczynnik kontrakcji
ψ
obliczamy z zaleŜności:
g
k
V
V
=
ψ
gdzie:
k
V
- objętość pojedynczej kropli [mm
3
],
g
V
- objętość pojedynczej granulki [mm
3
].
3.4. Wyznaczanie współczynnika efektywności biokatalizatora
Immobilizowane komórki droŜdŜy zawierają enzym- katalazę, która katalizuje
rozkład nadtlenku wodoru na tlen i wodę. Na szybkość reakcji rozkładu nadtlenku wodoru
przez immobilizowany biokatalizator maja wpływ opory związane z dyfuzja substratu w
porach granulek bądź dyfuzji przez błonę kapsułek. W związku z tym w inŜynierii
bioreaktorowej stosuje się współczynnik efektywności biokatalizatora, definiowany jako
stosunek rzeczywistej szybkości reakcji do szybkości reakcji bez oporów dyfuzyjnych.
Do pomiarów naleŜy przygotować dwie próbki biokatalizatora wskazanego przez
prowadzącego o masach po 2g. W oznaczeniach będzie uŜyty wcześniej przygotowany
roztwór nadtlenku wodoru , którego stęŜenie naleŜy oznaczyć metodą mangometryczną
(próbba „0”). Do zlewki zawierającej 2g biokatalizatora wlewa się 100 ml roztworu nadtlenku
wodoru o znanym stęŜeniu i uruchamia mieszadło magnetyczne. Po 20 min pobiera się dwie
próbki roztworu reakcyjnego i oznacza stęŜenie pozostałego nadtlenku wodoru przez
Laboratorium biotechnologii przemysłowej.
Ć
wiczenie nr 16.
9
miareczkowanie roztworem nadmanganianu potasu. Uzyskany rzeczywisty stopień przemiany
α
rz
obliczamy z zaleŜności:
0
1
0
C
C
C
k
rz
−
=
α
(1)
gdzie: C
0
- początkowe stęŜenie H
2
O
2
, obliczone jako średnia arytmetyczna z
dwóch oznaczeń,
C
k1
- stęŜenie H
2
O
2
po czasie 20 min, obliczone jako średnia arytmetyczna
z dwóch oznaczeń.
Granulki drugiej próbki biokatalizatora naleŜy mechanicznie rozetrzeć, aby w trakcie
badań aktywności nie występowały opory dyfuzji. Do zlewki zawierającej 2g roztartych
granulek naleŜy wlać 100 ml roztworu nadtlenku wodoru o znanym stęŜeniu i uruchomić
mieszadło magnetyczne. Po 20 minutach pobiera się dwie próbki roztworu reakcyjnego i
oznacza się stęŜenie nadtlenku wodoru. Maksymalny stopień przemiany α
max
obliczamy z
zaleŜności:
0
2
0
max
C
C
C
k
−
=
α
(2)
gdzie:
C
k 2
- stęŜenie H
2
O
2
po czasie 20 min rozkładu przez katalazę zawartą w
komórkach droŜdŜy uwolnionych z granulek/kapsułek.
Współczynnik efektywności biokatalizatora η obliczamy z zaleŜności:
max
α
α
η
rz
=
(3)
3.5. Oznaczanie stęŜenia H
2
O
2
metodą manganometryczną
Przy oznaczaniu stęŜeń nadtlenku wodoru dla kaŜdej próbki naleŜy przygotować
kolbki Erlenmayera z 10ml H
2
O
(dest)
i 5ml 5N kwasu siarkowego. Pobrana po odpowiednim
czasie próbka, po wprowadzeniu do tak przygotowanego roztworu zostaje zakwaszana, co
powoduje natychmiastowe zatrzymanie reakcji. NaleŜy ją wówczas miareczkować 0,0125M
roztworem nadmanganianu potasu do uzyskania trwałej, malinowej barwy roztworu.
Nadmanganian potasowy utlenia nadtlenek wodoru zgodnie z równaniem reakcji:
2KMnO
4
+ 5H
2
O
2
+ 4 H
2
SO
4
→ 2MnSO
4
+ 5 O
2
+ 8H
2
O + 2KHSO
4
Laboratorium biotechnologii przemysłowej.
Ć
wiczenie nr 16.
10
2
2
4
3
2
5
1
1000
O
molaH
MKMnO
cm
−
−
Obliczenia naleŜy wykonać według następującej kolejności:
a)
oblicz ile gramów KMnO
4
zuŜyto podczas miareczkowania próby,
b)
oblicz na podstawie w/w reakcji ile gramów H
2
O
2
odpowiada wcześnie
obliczonym gramom KMnO
4
,
c)
znając ile gramów H
2
O
2
było w badanej próbie oblicz stęŜenie H
2
O
2
.
4. Literatura
1.
Chmiel, Biotechnologia, Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa
1994.
2.
U.E. Viesturs, I.A. Szmite, A.W.śilewicz, Biotechnologia. Substancje biologicznie
czynne, technologia, aparatura, WNT, Warszawa 1992.
3.
S. Russel, Biotechnologia, PWN, Warszawa 1990.
4.
R. Dembczyński, T. Jankowski, Unieruchamianie komórek drobnoustrojów metodą
kapsułkowania – stan obecny i moŜliwości rozwoju tej metody. śywność. Nauka.
Technologia. Jakość 4, 2004, 5 – 17.