W doświadczeniu badany będzie wpływ postaci biokatalizatora na przebieg reakcji redukcji acetofenonu do fenyloetanolu. Dojdzie zatem do biotransformacji, za którą odpowiedzialny będzie enzym pochodzący z mikroorganizmu, a konkretnie z drożdży.

Ćwiczenie jest przykładem bioredukcji prochiralnego ketonu jakim jest acetofenon.

Drożdże

• grzyby jednokomórkowe

• organizmy saprofityczne

• rozmnażają się głównie przez pączkowanie

• optimum temperatury dla wzrostu wynosi 25 -

• optimum pH - 6,5

• przeprowadzają fermentację alkoholową

• stosowane jako biokatalizatory m.in. w piwowarstwie, winiarstwie, gorzelnictwie
  i piekarnictwie.

Zalety drożdży jako biokatalizatorów:

• możliwość użycia całych komórek bez konieczności wyodrębniania enzymów

• nie wymagają szczególnych pożywek, ponieważ może je stosować w postaci liofilizowanej (suchej)

• w czasie reakcji rzadko ulegają zakażeniu innymi organizmami, dlatego nie trzeba dbać
  o bardzo sterylne warunki

• drożdże redukują związki w środowisku lekko kwaśnym lub obojętnym

• nie wymagają stosowania kofaktora

• są tanie i łatwo dostępne.

Na zajęciach stosowany szczep Saccharomyces cerevisiae, w postaci:

1. drożdży prasowanych – są to drożdże, które namnaża się na medium wzrostowym po czym prasuje w bloki. Prasowane drożdże piekarskie w formie świeżej biomasy komórkowej charakteryzują się wysoką aktywnością i łatwością użycia. Wadą ich jest stosunkowo szybka utrata trwałości , która nie pozwala na ich dłuższe magazynowanie

2. drożdży suszonych – to drożdże, które mogą być w postaci proszku lub granulatu. W wyniku suszenia otrzymuje się materiał biologicznie aktywny o zawartości 8% wody. W porównaniu do drożdży prasowanych wykazują znacznie dłuższą trwałość

3. drożdży liofilizowanych – czyli drożdże suszone w obniżonej temperaturze pod zmniejszonym ciśnieniem. Tak zabezpieczone drożdże mogą być przechowywane najdłużej z pośród tych 3 rodzajów.

Reakcje biologicznie katalizowane a chemicznie

Biosynteza związków asymetrycznych z zastosowaniem biokatalizatorów stanowi bardzo efektywną metodę syntezy związków chemicznych. Jej stosowanie pozwala uzyskiwać wysokie wydajności. Wszystkie chiralne związki organiczne produkowane przez organizmy żywe istnieją tylko w postaci jednego z dwóch możliwych enancjomerów . Dzięki czemu pomiar aktywności optycznej staje się bardzo prostą metodą umożliwiającą rozróżnienie ich, od sztucznie syntetyzowanych mieszanin racemicznych. Ponadto procedury takich redukcji cechuje prostota wykonania, oraz łatwy dostęp do bardzo taniego i zarazem efektywnego biokatalizatora.

Natomiast synteza chemiczna czystego stereoizomeru wymaga często pokonania wielu trudności związanych właśnie z niskimi wydajnościami chemicznymi i optycznymi reakcji, ewentualną racemizacją produktów w kolejnych etapach reakcji czy też szkodliwością używanych odczynników dla środowiska. Nie bez znaczenia są też zazwyczaj wysokie koszty chiralnych reagentów.

W literaturze chemicznej można znaleźć wiele przykładów zastosowania biokatalizatorów do otrzymywania produktów chiralnych. Przykładem może być bioredukcja acetofenonu za pomocą enzymów z marchwi zwyczajnej.

Stereochemia – stereo selektywność

Stereoizomery - izomery przestrzenne, związki chemiczne, w których atomy połączone są w tych samych sekwencjach, a różnią się jedynie ułożeniem przestrzennym.

Katalityczna aktywność enzymów ogranicza się zazwyczaj do jednego typu reakcji, dającej jeden produkt, natomiast powstawanie produktów ubocznych przypisuje się działaniu innych enzymów. Z trójwymiarowej i asymetrycznej budowy miejsc aktywnych enzymów wynika stereoselektywność, w tym enancjoselektywność, katalizowanych reakcji. Można więc otrzymywać tylko jeden stereoizomer (enancjomer) lub mieszaninę z przewagą jednego z nich.

Mechanizm działania większości związków biologicznie czynnych (m. in. leków) polega na wiązaniu się ze swoistymi receptorami o określonej strukturze przestrzennej, które mogą oddziaływać tylko ze związkami o budowie im komplementarnej. Dlatego też stereoizomery mogą różnić się między sobą pod względem właściwości farmakologicznych i skuteczności działania. Bywa, że jeden ze stereoizomerów nie wykazuje w ogóle aktywności biologicznej lub wręcz powoduje groźne w skutkach działanie niepożądane.

Optycznie czyste związki mogą pochodzić ze źródeł naturalnych, jak również mogą być otrzymywane metodami chemicznymi. W przypadkach, w których jest to możliwe, dokonuje się rozdziałów mieszanin racemicznych wykorzystując na przykład preferencje krystalizacji poszczególnych stereoizomerów, lub też stosując metody adsorpcyjne, elektroforezy kapilarnej czy rozdziału kinetycznego. Jeśli efektywny rozdział racematu nie jest możliwy, starania idą w kierunku syntezy konkretnego stereoizomeru. Wykorzystuje się w tym wypadku strategie polegające na dobudowywaniu do cząsteczki półproduktu optycznie 2 czynnych składników (tzw. chironów) na pewnym etapie syntezy z retencją lub inwersją konfiguracji, lub też wykorzystuje się prochiralne substraty ulegające syntezie asymetrycznej z zastosowaniem chiralnych reagentów, katalizatorów, związków pomocniczych lub odpowiedniego, chiralnego środowiska.

Rekacja:

enzym:

Dehydrogenaza alkoholowa (EC 1.1.1.1) – enzym z grupy oksydoreduktaz przyspieszający przekształcanie się aldehydu octowego w etanol lub odwrotnie. Może także katalizować podobne przemiany innych alkoholi i odpowiadających im aldehydów i ketonów.

(?) Dehydrogenaza fenyloetanolowa (oksydoreduktaza) PEDH - jest homotetramerycznym enzymem o masie cząsteczkowej 108 kDa. Katalizuje zależne od NAD+ utlenienie (S)-1-fenyloetanolu do acetofenonu lub zależną od NADH stereospecyficzną redukcję acetofenonu do (S)-1-fenyloetanolu.

Acetofenon (fenyloetanon)

Organiczny związek chemiczny, należący do grupy ketonów, jest to keton fenylowo-metylowy, będący najprostszym przykładem ketonu alkilo-aromatycznego. Jest to ciecz trudno rozpuszczalna w wodzie, łatwo rozpuszczalna w rozpuszczalnikach organicznych (etanol, eter, benzen, chloroform). Posiada dość intensywny, przyjemny zapach kojarzący się z zasuszonymi różami.

(S)Fenyloetanol

Produktem przedstawionej syntezy jest (S)-(-)-1-fenyloetanol. Jest to substancja naturalna, występująca w wielu roślinach. Wchodzi ona na przykład w skład olejku różanego, jednego z najstarszych stosowanych leczniczo olejków aromatycznych. 1-Fenyloetanol działa silnie przeciwbólowo, a jego pochodne są poszukiwanymi półproduktami do syntezy nowych leków oraz znajdują zastosowanie jako smakowe i zapachowe dodatki do produktów spożywczych i kosmetycznych.

TLC

Chromatografia cienkowarstwowa jest szybką i wygodną metodą jakościowego badania składu mieszanin substancji oraz ilościowego oznaczania zawartości poszczególnych składników. Zastosowanie znajduje przede wszystkim dla związków organicznych.

Zasada rozdziału TLC

Na płytkę chromatograficzną, pokrytą odpowiednio dobraną fazą stacjonarną, stanowiącą cienką jednolitą warstwę na szklanym, plastikowym lub aluminiowym podłożu, nanosi się w punkcie startu mieszaninę substancji. Składniki mieszaniny oddziaływują z nośnikiem i zostają przez niego związane z różną siłą. Płytkę umieszcza się następnie w komorze chromatograficznej w której znajduje się faza ruchoma ― odpowiednio dobrany rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników. Faza ruchoma zwilżając sorbent tworzy z nim układ dwufazowy. W każdym fragmencie rozwijanego w ten sposób chromatogramu ustala się stan równowagi, zależny dla każdego ze składników od jego powinowactwa do obu faz. Składniki rozdzielanej mieszaniny o większym powinowactwie do fazy ruchomej rozpuszczają się w niej w większym stopniu i wraz z nią są przenoszone na nową porcję sorbentu. W wyniku ustalania się szeregu kolejnych stanów równowagi substancje słabiej związane z fazą stacjonarną „przewędrują” wraz z rozpuszczalnikiem dłuższą drogę, niż substancje związane słabiej. Miarą przebytej drogi jest tzw. współczynnik Rf substancji. W określonych warunkach identyczne substancje będą się zachowywać tak samo i „odbędą” taką samą drogę na fazie stacjonarnej (= wzdłuż płytki chromatograficznej).