MITOCHONDRIA I PEROKSYSOMY

Zarówno mitochondria jak i peroksysomy nie uczestniczą w szlaku przepływu błon. Oznacza to, że (1) ich błony mają unikatowy charakter, odmienny od pozostałych błon w komórce, (2) białka zarówno błonowe jak i wyposażenia wewnętrznego są produkowane na wolnych rybosomach w cytoplazmie (w mitochondriach także na własnych rybosomach, p. dalej) i wbudowywane do organelli na drodze importu posttranslacyjnego oraz (3) organelle te mogą się namnażać jedynie przez podział i nie są tworzone de novo (w szczególnych przypadkach nie dotyczy to peroksysomów, p. dalej).

Mitochondria

Możemy je podzielić:

- ze względu na kształt organelli:

• pałeczkowate lub kuliste - jest to powszechnie występująca forma,

• bardzo wydłużone (do kilkudziesięciu μm) i rozgałęzione (rzadziej,

np. w nabłonku jelitowym, fibroblastach, w kom. mięśnia sercowego);

- ze względu na kształt grzebieni:

• lamelarne (grzebienie w formie fałdów - powszechne)

• tubularne (grzebienie w formie rurek - w komórkach produkujących steroidy)

Przedziały mitochondrialne

1. Błona zewnętrzna: stosunek białek do lipidów 1:1; zawiera

• specyficzne kanały o zmiennej przepuszczalności (VDAC - voltage-dependent anionic channel, dawniej zwane porynami).

VDAC może mieć dwa skrajne stany czynnościowe: otwarty, o wysokiej przepuszczalności i selektywny dla anionów oraz zaknięty (niezupełnie) o niskiej przepuszczalności i selektywny dla kationów; zaobserwowano również stany pośrednie. W stanie otwartym VDAC umozliwia przechodzenie przez błonę również większych cząsteczek, o masie do 5 kDa.

VDAC:

- reguluje transport AMP, ADP i ATP do/z mitochondriów

- reguluje transport jonów Ca²⁺ do/z mitochondriów, a także pomiędzy mitochondriami oraz

pomiędzy mitochondriami a siateczką śródplazmatyczną (może dochodzić do kontaktu organelli)

- wiąże białka proapoptotyczne i uczestniczy w zapoczątkowaniu zjawisk zwi azanych z procesem apoptozy, zachodzących na terenie mitochondriów

• translokony zawierające receptory dla odcinków sygnałowych białek mitochondrialnych (p. dalej);

2. Przestrzeń międzybłonowa: wąska, zawiera kinazy nukleotydów, niekiedy obie błony mitochondrialne stykają się ze sobą (miejsca kontaktowe dla importu białek, p. dalej).

3. Błona wewnętrzna: > 80% białek, specyficzny lipid (kardiolipina); błona zawiera:

• łańcuch oddechowy (jego składnik, oksydaza cytochromowa, jest markerem tej błony)

• kompleksy syntazy ATP (F₀-F₁ ATPaza) w formie "grzybków"

• liczne białka transportowe, dzięki czemu jej przepuszczalność jest wysoce selektywna.

4. Macierz: zawiera mtDNA, mtRNA, rybosomy mitochondrialne, enzymy aparatu genetycznego, cyklu Krebsa, β-oksydacji kwasów tłuszczowych, złogi fosforanów wapniowych (ciałka gęste).

Produkcja ATP

Wymaga ona współpracy układów enzymatycznych:

• enzymów cyklu Krebsa i β-oksydacji kwasów tłuszczowych zlokalizowanych

w macierzy, dostarczających substratów dla

• kompleksów łańcucha oddechowego zlokalizowanych w wewnętrznej błonie mit.

• syntazy ATP w "grzybkach"

Teoria chemiosmotyczna. Energia wydzielana w trakcie transportu elektronów wzdłuż łańcucha oddechowego zużywana jest na pompowanie H⁺ z macierzy do przestrzeni międzybłonowej (3 składniki łańcucha pełnią funkcję pompy protonowej). Powstały gradient elektrochemiczny (protonowy), odpowiedzialny również za zmianę potencjału wewn. błony mitochondrialnej (do -200 mV po stronie macierzy), wykorzystywany jest do syntezy ATP, a także napędza procesy wymagajace energii zachodzące w obrębie tej błony (transport aktywny, import białek).

Protony powracają do macierzy przez hydrofilny transporter w „nóżce” grzybka, a wyzwolona w tym procesie energia pozwala na syntezę ATP w „główce” grzybka.

Grzybek mitochondrialny (kompleks syntazy ATP). Składa się z "nóżki" (F₀), zawierającej transporter protonowy oraz z "główki" (F₁), zbudowanej z trzech dimerów białkowych, z których każdy składa się z podjednostki α i β.

Całość działa jak "turbina molekularna": przepływające protony wprawiają "nóżkę" w ruch obrotowy względem nieruchomej "główki". W obrębie każdego z trzech dimerów budujących "główkę" znajduje się "kieszeń" wiążąca ADP i P_i. Jej zmiany konformacyjne wywołane obrotem "nóżki" prowadzą do ekspozycji aminokwasów hydrofobowych, co przesuwa resztę fosforanową (P_i) w pobliże cząsteczki ADP i wymusza połączenia się w ATP; następnie główka wraca do pierwotnej konformacji, uwalniając powstałe ATP, na którego miejsce wchodzi nowe ADP i P_i. Przy każdym obrocie "nóżki" cykl się powtarza. Grzybek mitochondrialny produkuje ok. 100 cząsteczek ATP na sekundę.

Łańcuch oddechowy. Zbudowany jest z trzech głównych kompleksów :

 kompleksu dehydrogenaz NADH,

 kompleksu cytochromów b-c1,

 kompleksu oksydazy cytochromowej

Wg teorii przypadkowych zderzeń, poszczególne kompleksy nie są na stałe powiązane ze sobą, tylko "pływają" oddzielnie w dwuwarstwie lipidowej błony wewnętrznej. Ich wzajemne zderzenia i łączenie się w odpowiedniej kolejności powoduje "włączanie się" funkcji łańcucha oddechowego w różnych rejonach błony.

Inne funkcje mitochondriów

1. β-oksydacja kwasów tłuszczowych - mitochondria są odpowiedzialne za rozkład kwasów tłuszczowych o krótkich i średnich łańcuchach.

2. Ostatnie etapy syntezy hormonów sterydowych - w komórkach sterydogennych występują tzw. mitochondria tubularne (z grzebieniami w formie rurek), posiadajace enzymy odpowiedzialne za te procesy.

3. Gromadzenie Ca²⁺ w ciałkach gęstych. Uruchamianie tych magazynów następuje (1) w warunkach ekstremalnych, podczas degeneracji i śmierci komórki, m.in. w degenerujących chondrocytach w czasie kostnienia na podłożu chrzęstnym, co zapoczątkowuje mineralizację, (2) najnowsze badania sugerują wydzielanie Ca²⁺ również w normalnych warunkach, pod wpływem wzrostu poziomu cytoplazmatycznego Ca²⁺ - co stanowiłoby mechanizm wzmacniania sygnału.

4. Produkcja ciepła w tkance tłuszczowej brunatnej. W błonie wewnętrznej mitochondriów adipocytów wielopęcherzykowych znajdują się dodatkowe kanały protonowe (białko UCP-1 -termogenina) nie związane z grzybkami. Przepływ protonów przez te kanały powoduje wyzwolenie energii w formie ciepła.

5. Rola w procesie apoptozy. Sygnał apoptotyczny powoduje związanie się białek Bax i Bcl2 (specyficznych białek uczestniczących w apoptozie) z zewnętrzną błoną mitochondrialną, co prowadzi do znacznego wzrostu przepuszczalności obu błon mitochondrialnych i przechodzenia cytochromu c do cytozolu. Tam cytochrom c aktywuje kaspazy - proteazy odpowiedzialne za degradację struktur komórkowych.

Aparat genetyczny mitochondriów

Zawiera (w mitochondriach ludzkich):

● mtDNA: pętlowy (16 569 par zasad), pozbawiony histonów, “ekonomiczny” genom (ok. 80% to odcinki kodujące). W kilku przypadkach kod genetyczny mtDNA jest odmienny od uniwersalnego:

UGA (STOP) w mitochondriach tryptofan,

AUA (Ile) w mitochondriach metionina,

AGA, AGG (Arg) w mitochondriach STOP

W pojedynczym mitochondrium jest kilkanaście kopii DNA.

● mt-mRNA, mt-tRNA

● mitochondrialne rybosomy (55 S)

mtDNA koduje:

● 12S i 16S rRNA (do małej i dużej podjednostki rybosomów)

● 22 cząsteczki tRNA

● 13 białek błony wewnętrznej (łańcuch oddechowy: 7 podjednostek dehydrogenazy NADH, cytochrom b, 3 podjednostki oksydazy cytochromowej; grzybek mitochondrialny: 2 podjednostki syntazy ATP). Stanowi to znikomą część wyposażenia mitochondrialnego. Reszta kodowana jest w jądrze, syntetyzowana na wolnych rybosomach cytoplazmatycznych i włączana posttranslacyjnie do mitochondrium. Mitochondrium określa się z tego względu jako organellę semiautonomiczną.

mtDNA w komórkach roślinnych i u różnych grup zwierząt znacznie różni się wielkością genomu i podjednostek rybosomowych, co wskazuje na zróżnicowane drogi rozwoju ewolucyjnego.

Endosymbiotyczna teoria ewolucji mitochondriów: od pierwotnych bakterii posiadających w błonie komórkowej łańcuch oddechowy i syntazę ATP, które zostały sfagocytowane przed ok. 1,5 mld lat przez pierwotne komórki eukariotyczne dysponujące jedynie glikolizą beztlenową jako źródłem energii. W trakcie dalszej ewolucji większość genów bakterii została przeniesiona do jądra komórki-gospodarza.

Import białek mitochondrialnych syntetyzowanych w cytoplazmie

Jak wszystkie białka kierowane do organelli, białka mitochondrialne produkowane na rybosomach cytoplazmatycznych posiadają odcinki sygnałowe rozpoznawane przez receptory na zewnętrznej błonie mitochondrialnej. Białka są wbudowywane do mitochondriów w miejscach kontaktowych, gdzie w obu zbliżonych do siebie błonach mitochondrialnych znajdują się współosiowe translokony: TOM (translokon bł. zewnętrznej zawierający m.in. receptor dla odcinka sygnałowego) i TIM (translokon bł. wewnętrznej). Przechodzące przez translokony białka muszą być “rozwinięte”, czyli pozbawione struktury II- i III-rzędowej, co wymaga ich kooperacji z białkami opiekuńczymi (z rodziny hsp, tzw. białek szoku termicznego) zarówno w cytoplazmie, jak i w mitochondriach.

Przechodzenie białek przez translokon błony wewnętrznej wymaga energii dostarczanej przez gradient protonowy, natomiast ich “wejście" i "wyjście” do wnętrza mitochondrium zależne jest od energii z ATP. Istnieją 3 rodzaje translokonów bł. wewnętrznej: TIM 22, TIM 23 i OXA.

Drogi importu białek zależą od odcinków (sekwencji) sygnałowych:

● do błony zewnętrznej: przez TOM, białko posiada odcinek sygnałowy kierujący do mitochondrium i odcinek hydrofobowy „stop” zakotwiczający białko w błonie;

● do przestrzeni międzybłonowej: przez TOM i TIM 23, białko posiada odcinek kierujący rozpoznawany przez oba translokony i dodatkowy odcinek "stop", po jego zakotwiczeniu w bł. wewnętrznej peptydaza sygnałowa w przestrzeni międzybłonowej odcina go i uwalnia białko;

● do macierzy: przez TOM i TIM 23, białko posiada odcinek kierujący rozpoznawany

przez oba translokony i odcinany po przejściu białka do macierzy;

● do błony wewnętrznej: (1) najpierw przez TOM i TIM 23 do macierzy (odc. kierujący), potem przez OXA z powrotem do bł. wewnętrznej (odc. sortujący/”stop”), (2) przez TOM i TIM 22 (odcinek kierujący i "stop");

Choroby mitochondrialne

Rzadkie, dziedziczne choroby będące wynikiem

• defektów genomu mitochondrialnego (np. LHON - dziedziczna neuropatia wzrokowa Lebera, NARP - neuropatia obwodowa z ataksją i barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki, MERF - padaczka miokloniczna z nieprawidłowymi czerwonymi włóknami mięśniowymi, MELAS - encefalopatia mitochondrialna z kwasicą mleczanową i epizodami podobnymi do udaru mózgu, zespół Leigha). Mutacje mtDNA dotyczą obu płci, ale dziedziczą się wyłącznie po linii matczynej.

• defektów genomu jądrowego - kodującego białka mitochondrialne.

W obu przypadkach szeroki wachlarz objawów klinicznych (głównie miopatie, encefalopatie, neuropatie).

Peroksysomy

Są to struktury otoczone błoną, zawierające enzymy. Występują we wszystkich komórkach (wielkość 0.1-0.2 μm), ale szczególnie licznie w kom. wątroby i kanalików nerkowych, gdzie mają też większe rozmiary (do 1 μm).

Kształt: przeważnie kulisty, ale w niektórych komórkach mogą być wydłużone (tubularne), rozgałęzione, nieregularne.

Hipoteza siateczki peroksysomowej: peroksysomy mogą tworzyć dynamiczny przedział błonowy podlegający nieustannym procesom fuzji i rozdziału. Peroksysomy w formie siateczki obserwuje się b. rzadko, gdyż procesy rozdziału przeważają nad procesami fuzji.

Błona peroksysomu

Nieselektywnie przepuszczalna dla substancji niskocząstecznowych, transportery dla substratów enzymów peroksysomowych (np. dla kwasów tłuszczowych), translokony dla białek peroksysomowych (p. dalej).

Główne enzymy peroksysomowe:

• katalaza - rozkłada H₂O_2, jest markerem peroksysomów,

• oksydazy peroksysomowe (oksydaza moczanowa u zwierząt ma formę parakrystalicznego rdzenia) - wykorzystują tlen cząsteczkowy, a w reakcji dają H₂O₂ jako produkt uboczny

• enzymy β-oksydacji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych,

• enzymy syntezy lipidów

• aminotransferazy

Główne funkcje peroksysomów

• utlenianie różnych substratów i eliminacja powstającego w tym procesie H₂O₂

• β-oksydacja kw. tłuszczowych o długich łańcuchach (>C₈, dokończenie procesu zachodzi w mitochondriach),

• synteza cholesterolu, plazmalogenów (eterolipidy, forma fosfolipidów spotykana w błonach biologicznych, a szczególnie w osłonkach mielinowych), udział w syntezie kwasów żółciowych

• degradacja puryn

Import białek do peroksysomów

Białka błony peroksysomu i enzymy peroksysomowe są syntetyzowane są na wolnych rybosomach i posiadają specyficzne odcinki sygnałowe PTS (peroxisome targeting signal).

• PTS1 - najczęstszy, 3 aminokwasy o sekwenji Ser-Liz-Leu na końcu C, wprowadza białka do wnętrza peroksysomu;

• PTS2 - 9 aminokwasów na końcu N, białka kierowane do wnętrza lub do błony

• PTS3 - odcinek sygnałowy zlokalizowany w środku łańcucha polipeptydowego (brak danych)

Import białek wymaga energii z ATP i zespołu ok. 20 białek (Pex = peroksyny) obejmującego cytoplazmatyczne i błonowe receptory dla odcinków sygnałowych oraz translokony. Sposób działania translokonów nie został wyjaśniony: przechodzą przez nie białka w formie “zwiniętej” (nie są potrzebne białka opiekuńcze), a nawet cząstki koloidalnego złota o wielkości 5 nm.

Proliferacja peroksysomów

Leki hypolipidemiczne (Clofibrate i jego pochodne) wywołują proliferację peroksysomów w kom. wątrobowych u zwierząt laboratoryjnych oraz wzrost aktywności procesów β-oksydacji kwasów tłuszczowych w peroksysomach. Tego zjawiska nie zaobserwowano u człowieka. Wyodrębniono natomiast (również u ludzi) tzw. receptory aktywowane proliferatorami peroksysomów (PPAR - peroxisome proliferator-activated receptors) - receptory jądrowe aktywujące transkrypcję genów kodujących białka regulujące metabolizm kwasów tłuszczowych.

Biogeneza peroksysomów

W większości komórek nowe peroksysomy powstają przez rozdział już istniejących peroksysomów, a powiększaja się przez wbudowywanie lipidów do błon (za pośrednictwem specjalnych białek przenoszących lipidy) oraz przez import białek zarówno do błon, jak i do wnętrza peroksysomów.

Okazało się jednak, że w rzadkich przypadkach, w komórkach pozbawionych peroksysomów (procesy rozwojowe, warunki doświadczalne) peroksysomy mogą tworzyć się de novo. Do niewielkich obszarów błony siateczki śródplazmatycznej zostają wbudowane peroksyny Pex3 i Pex16, a następnie te fragmenty błony odrywają się od siateczki w formie małych pęcherzyków (pęcherzyki preperoksysomowe). Do nich z kolei importowane są dalsze składniki: lipidy błonowe i białka peroksysomowe. W ten sposób tworzą się pierwsze w pełni funkcjonalne peroksysomy.

Choroby peroksysomowe

Są to rzadkie, genetycznie uwarunkowane schorzenia, w których defekt dotyczy (1) enzy-mów peroksysomowych lub (2) peroksyn odpowiedzialnych za import enzymów do peroksysomów.

• Defekty pojedynczych enzymów peroksysomowych: objawy kliniczne zależą od rodzaju enzymu, np. akatalazemia przebiegająca prawie bezobjawowo, pierwotna hyperoksaluria typu 1 - brak jednej z aminotransferaz, ciężka uogólniona kamica szczawianowa; choroba Refsuma - postać dorosłych - brak enzymu metabolizującego kwas fitanowy, schorzenie neurodegeneracyjne, adrenoleukodystrofia sprzężona z chromosomem X - brak białka ALDP uczestniczącego w rozkładzie kwasów tłuszczowych; pseudozespół Zellwegera - brak tiolazy uczestniczącej w β-oksydacji kw. tłuszczowych.

• Defekty importu białek (peroksyn) powodują, że enzymy są syntetyzowane, ale nie mogą dostać się do peroksysomów i ulegają szybkiej degradacji w cytozolu. Daje to zazwyczaj obraz defektów wieloenzymatycznych, posiadających pewne wspólne objawy kliniczne (uszkodzenia neurologiczne wynikające z zaburzenia mielinizacji, zaburzenia metabolizmu lipidów, niekiedy zaburzenia rozwojowe). Schorzenia te manifestują się natychmiast po urodzeniu i z reguły są letalne.

Przykłady: zespół Zellwegera (patologia obejmuje mózg, wątrobę i nerki), choroba Refsuma - postać niemowlęca, adrenoleukodystrofia noworodkowa, chondrodysplazja typu ryzomelicznego. Blok importu białek do wnetrza peroksysomów powoduje, iż w komórkach są „cienie peroksysomów” - pęcherzyki zbudowane z błony peroksysomowej ale nie zawierające enzymów.

Badania genetyczne pacjentów z chorobami peroksysomowymi II grupy wskazują na istnienie co najmniej 12 genów decydujących o prawidłowym imporcie białek do peroksysomów.

Cytobiologia Medyczna

3

---