Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie nr 2

BIAŁKA

Magdalena Dudek

Paulina Ziółczyk

Data wykonania ćwiczenia:

15.10.2008

Data oddania sprawozdania:

22.10.2008

Cel ćwiczenia:

Naszym zadaniem było zapoznanie się z budową, funkcjami i właściwościami białek.

Wstęp teoretyczny:

Białka (proteiny, z gr. Proteios - oznacza pierwszorzędny) to wielkocząsteczkowe polipeptydy. Odgrywają one wiodącą rolę w czynnościach i budowie komórki.

Do ich funkcji należą m.in.:

- kataliza enzymatyczna

- transport i magazynowanie wielu cząsteczek i jonów

- czynności mechaniczno-strukturalne (np. budowa mięśni)

- ochrona immunologiczna

- wytwarzanie i przewodzenie impulsów nerwowych

- kontrola wzrostu komórek i organizmów

Podstawowymi jednostkami strukturalnymi białek są L-aminokwasy. Grupa karboksylowa jednej cząsteczki łączy się z grupa aminową drugiej poprzez tzw. wiązanie peptydowe. Związane w ten sposób tworzą strukturę łańcucha polipeptydowego.

Naturalne białka zawierają od ok. 50 do 2000 reszt aminokwasowych, których przeciętna masa wynosi około 110.

Masy cząsteczkowe łańcuchów polipeptydowych wahają się w granicach od 5500 do 220 000 jednostek masy atomowej. Jednakże masę protein wyraża się na ogół w Daltonach.

1 Dalton odpowiada 1 jednostce masy atomowej.

1 kDa = 1000 Daltonów

W budowie białek uwzględniamy cztery poziomy ich struktury.

Struktura I rzędowa - określająca sekwencję aminokwasów.

Struktura II rzędowa - opisująca wzajemne przestrzenne ułożenie reszt aminokwasowych, sąsiadujących ze sobą w sekwencji liniowej przykładem tego może być postać helisy α.

Struktura III rzędowa - odnosząca się do przestrzennych i wzajemnego ułożenia reszt aminokwasowych , oddalonych od siebie w sekwencji liniowej oraz lokalizacji mostków disiarczkowych.

Struktura IV rzędowa - określa białka składające się z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego. Wtedy taki łańcuch nazywamy podjednostką, a struktura ta opisuje ich wzajemne położenie i rodzaj kontaktu między nimi.

Klasyfikacja białek jest trudna i możemy ją przeprowadzić biorąc pod uwagę różne cechy protein.

I tak, ze względu na rozpuszczalność wyróżniamy:

- albuminy - dobrze rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach kwasów i zasad.

- globuliny - rozpuszczalne w wodzie dopiero po dodaniu dobrze dysocjującej na jony soli (proces wsalania).

- prolaminy - rozpuszczalne tylko w stężonym etanolu.

- gluteiny - rozpuszczalne tylko w rozcieńczonych roztworach kwasów i zasad.

Klasyfikacja wg. Kształtu:

- białka globularne - łańcuchy polipeptydowe są pofałdowane i zwinięte.

- białka włókienkowe - zawierające odcinki łańcuchów polipeptydowych zwiniętych śrubowo lub heliakalnie.

Klasyfikacja na podstawie czynności:

- strukturalne

- katalityczne

- transportowe

A także podział na :

- białka proste - zbudowane tylko z reszt aminokwasów

- białka złożone - zawierające w cząsteczce składnik niebiałkowy

Proteiny posiadają właściwości takie jak:

- zbliżony skład pierwiastkowy

- są związkami optycznie czynnymi

- są hydrofilowymi układami koloidalnymi

- są amfoterami

- ulegają denaturacji

- ulegają wysalaniu i wytrącaniu

Cztery ostatnie z właściwości zostały przez nas zaobserwowane podczas wykonywania omawianego ćwiczenia.

Przebieg doświadczenia:

Izolowanie białek roślinnych

A)Ekstrahowanie albumin i globulin.

W 25 ml. 0.5 molowego roztworu KCl przeprowadziłyśmy ekstrakcję 1g mączki grochowej. Otrzymany poprzez wirowanie supernatant analizowałyśmy w dwóch próbach.

a) w pierwszej wykazywałyśmy białko za pomocą reakcji biuretowej.

b) w drugiej należało rozlać do dwóch probówek po 1ml. ekstraktu mączki. Następnie dodać do pierwszej 8ml. wody, a do kolejnej taką samą ilość 0,5 molowego roztworu KCl.

Obserwacje:

a) po przeprowadzeniu reakcji Piotrowskiego otrzymałyśmy roztwór o zabarwieniu fiołkowym (podobnie w przeprowadzonym równolegle oznaczeniu białka jaja kurzego)

b) W tej próbie po dodaniu do ekstraktu wody powstało białe zmętnienie, następnie po dolaniu KCl powrócił do bezbarwnego roztworu. W drugiej próbie po dodaniu KCl najpierw otrzymałyśmy bezbarwny roztwór, a osad pojawił się dopiero po dodaniu kolejnej porcji soli.

Wnioski
a)W środowisku zasadowym nastąpiło zawiązanie kompleksu białka z jonami miedzi, czego barwny efekt mogliśmy zaobserwować. W probówce zawierającej tylko wodę reakcja nie nastąpiła.

b) W probówce nr 2, do której dodałyśmy KCl, nie nastąpiło zmętnienie, które było spowodowane dobrą rozpuszczalnością zarówno albumin jak i globulin. W probówce 1, do której dodałyśmy wodę, nastąpiło zmętnienie, gdyż globuliny z powodu silnego momentu dipolowego cząsteczek nie SA rozpuszczalne w wodzie. Po do daniu KCl zmętnienie zniknęło, ponieważ globuliny i albuminy są dobrze rozpuszczalne w rozcieńczonych roztworach soli.

B)wydzielenie glutenu:

Przygotowałyśmy ciasto z 30g mąki pszennej i wody. Odstawiłyśmy je na pół godziny, by nastąpiło uwodnienie i spęcznienie białka. Następnie wygniatając ciasto pod strumieniem zimnej wody wypłukałyśmy skrobię. Otrzymaną w ten sposób substancję o gumowatej
i ciągnącej konsystencji rozpuściłyśmy w 30ml roztworu NaOH o stężeniu 0,2 mola.

Na koniec przeprowadziłyśmy reakcję Piotrowskiego, by sprawdzić obecność białka.

Obserwacje:

Wynikiem próby była fiołkowa barwa roztworu.

Wnioski:

Gluten jest białkiem rozpuszczalnym w rozcieńczonych roztworach zasad, dlatego możliwe było rozpuszczenie otrzymanego ciasta przy użyciu roztworu NaOH.

Pojawienie się fioletowego zabarwiania po wykonaniu próby biuretowej, świadczy
o dodatnim odczynie reakcji, co wskazuje na obecność białka w próbie

Wysalanie białek

Do 10ml 1% roztworu białka jaja kurzego dodaję porcjami stały (NH₄)₂SO₄ aż do nasycenia roztworu soli(kryształki soli nie rozpuszczały nam się już w roztworze). Osad wysolonego białka oddzielam na sączku i rozpuszczam roztworem KCl. Sprawdzam obecność białka reakcją biuretową. Do wcześniej otrzymanego przesączu dodaję 3 krople 5% CCl₃COOH.

Obserwacje i wnioski:

Wynikiem reakcji jest roztwór o zabarwieniu fiołkowym co świadczy o obecności protein.

Dodawanie stałego (NH4)2SO4, który ze względu na bardzo dobrą rozpuszczalność w wodzie daje możliwość uzyskania roztworów o wysokiej mocy jonowej, powoduje niszczenie wodnej otoczki białka, obniżenie jego rozpuszczalności w wodzie, co skutkuje wypadaniem tegoż białka z roztworu - powstawanie osadu.

Po rozcieńczeniu osadu i przeprowadzeniu reakcji biuretowej otrzymuję roztwór o barwie niebiesko-fioletowej. Pokazuje to, że osadem było wysolone białko, które rozpuściło się pod wpływem rozcieńczonego roztworu soli. Przeprowadzenie reakcji biuretowej było możliwe, gdyż wysalanie jest procesem odwracalnym i nie powoduje zmian właściwości białka.

TCA wytrąca białka. Po dodaniu go do otrzymanego przesączu nie nastąpiło zmętnienie co oznacza, że białko zostało całkowicie wysolone z roztworu.

Białka jako koloidy.

Do dwóch probówek odmierzam po 1ml 0,01M roztworu azotanu srebra. Do probówki nr 1 dodaję 1ml 1% roztworu białka jaja kurzego a do probówki nr 2 - tę samą ilość wody.
Po wymieszaniu wprowadzam do każdej probówki po 1ml chlorku sodu.

Obserwacje: i wnioski:

Początkowo w probówce zawierającej białko z solą sodową nastąpiło zmętnienie, które
po dodaniu soli sodowej zniknęło.

W probówce z wodą początkowo roztwór był klarowny, a zmętnienie nastąpiło dopiero
po dodaniu NaCl.

W tym ćwiczeniu możemy zaobserwować właściwości białka jako koloidu hydrofobowego. W roztworze soli AgNO₃ z białkiem układ wytworzył koloidalną zawiesinę hydrofobową, która traci swój charakter dopiero po dodaniu soli mocnego elektrolitu. Woda nie posiada takich właściwości, dlatego efekt zaobserwowaliśmy dopiero po dodaniu NaCl.

Amfoteryczność białek

A)Strącanie białek za pomocą kationów i anionów.

Do probówek odmierzyłyśmy kolejno po 2 ml białka jaja kurzego o pH = 3,0; 4.7; 8.0, następnie dodałyśmy niewielkie ilości roztworów soli: siarczanu miedzi, octanu ołowiu
i wolframianu sodu.

Tabela nr 1 „Strącanie białek za pomocą kationów i anionów”

Odczynnik	1 % roztwór białka jaja kurzego
		pH = 8.0	pH = 4.7	pH = 3.0
10% siarczan miedzi	+	-	-
10% octan ołowiu II	+	-	-
10% wolframian sodu	-	-	+

Opis: „+” - wytrącanie białczanów; „-”- brak osadu

Obserwacje i wnioski:

Przy pH>pI, cząsteczki białka występują w postaci polianionów i mogą reagować z kationami
(Cu⁺², Pb⁺²). Kationy metali ciężkich denaturują białko i tworzą z ich anionową formą trudno rozpuszczalne, słabo dysocjujące sole.

Przy pH<pI, cząsteczki białka występują w postaci polikationów i mogą reagować z anionami. Białczany metali alkalicznych (np. Na⁺) są dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie, dlatego trudno było zauważyć ich powstanie.

B)Wpływ kwasów organicznych na białka.

Tabela nr 2 „Wpływ kwasów organicznych na białka.”

Kwas	Obserwacje
6% kwas sulfosalicylowy	zmętnienie
10% kwas trójchlorooctowy	zmętnienie
5% kwas octowy	brak osadu

Do trzech probówek dodałyśmy po 1 ml roztworu białka kurzego i następnie dolałyśmy taką samą ilość kwasu.

Obserwacje i wnioski:

W danej próbie mogłyśmy zauważyć, że największa ilość osadu wytrąciła się w reakcji z kwasem trójchlorooctowym, zaś w probówce zawierającej kwas octowy nie nastąpiło wytrącenie.

W przypadku dwóch pierwszych kwasów następuje wytrącenie jak i denaturacja białka, gdyż są to kwasy mocne (pierwszy - występuje grupa sulfonowa, drugi - zawiera 3 silnie elektroujemne chlory). Kwas octowy jest kwasem słabszym i nie powoduje wytrącenia białka.

.

Denaturacja białka

Do trzech probówek dodałyśmy po 2 ml białka jaja kurzego o pH = 8.0; 4.7; 3.0. Umieściłyśmy je
w łaźni wodnej o temp ok. 100 C. Po 15 minutach schłodziłyśmy probówki i dodałyśmy do roztworów o pH = 8.0 i 3.0 po 5 ml buforu octanowego.

Obserwacje i wnioski:

Po ogrzaniu białka następuje jego denaturacja, jest to spowodowane uszkodzeniem uporządkowanej struktury protein. Zniszczone zostają mostki wodorowe i disiarczkowe oraz wiązania jonowe.

W probówce o pH = pI nastąpiło wytrącenie białka, co świadczy o tym, iż punkt izoelektryczny nie zmienił swojej wartości. Nastąpiła natomiast koagulacja białka. W probówce 1 o pH 8,0 zauważamy zmętnienie - nastąpiła denaturacja białka. W probówce 2 wyraźnie widać, że zaszła koagulacja - białko zostało wytrącone (wytrącił się gęsty, biały osad). W probówce 3 nie powstało zmętnienie, należy jednak pamiętać, że denaturacja nie zawsze oznacza wypadanie białka z roztworu.

Do probówek 1 i 3 dodaję buforu octanowego o pH=4,7 aby doprowadzić pH w probówkach do pH równego ich punktowi izoelektrycznemu. Można zaobserwować intensywniejsze wytrącenie białka
w obu probówkach.

6

---