Badania DNA

Na początek kilka definicji:

DNA - kwas deoksyrybonukleinowy, substancja chemiczna będąca nośnikiem informacji genetycznej, występująca we wszystkich żywych organizmach. Łańcuch DNA występuje w postaci podwójnej, skręconej nici, tzw. podwójnej helisy

gen - fragment DNA, w którym zakodowana jest infor-macja o produkcji białka

polimerazowa reakcja łańcuchowa PCR (polymerase chain reaction) - metoda do wielokrotnego duplikowania śladowych ilości DNA, by zapewnić ilości potrzebne do wykonania analizy. PCR jest często wykorzystywana do analizy "odcisków palców DNA" (fingerprint), w nauce i medycynie sądowej.

genetyczny odcisk palca - wzór fragmentów DNA powstałych po strawieniu wybranego obszaru genomu odpowiednim enzymem restrykcyjnym i rozdzielonych w żelu elektroforetycznym; jeśli do badań wybierze się odpowiedni odcinek DNA, powstaje wzór charakterystyczny dla każdego osobnika danego gatunku

genom - kompletny zestaw genów organizmu żywego

kwas nukleinowy - długa spolimeryzowana cząsteczka złożona z pojedynczych jednostek nukleotydowych związanych silnymi wiązaniami chemicznymi; łańcuchy DNA i RNA są kwasami nukleinowymi różniącymi się od siebie cukrowym składnikiem nukleotydów, jest nim odpowiednio deoksyryboza i ryboza

mitochondria - "centra energetyczne" znajdujące się w każdej komórce i dzielące się niezależnie od niej. Materiał genetyczny zawarty w mitochondriach dziedziczy się inaczej niż ten znajdujący się w jądrach komórkowych. Geny jądrowe otrzymujemy po obojgu rodzicach, podczas gdy DNA mitochondrialny - tylko po matce.

MtDNA - Mitochondrialny DNA. Koliste cząsteczki DNA znajdujące się wewnątrz mitochondriów. MtDNA zawiera geny kodujące niektóre białka wchodzące w skład mitochondriów.

Locus (l.mn. loci) - Miejsce lokalizacji genu na chromosomie. Oba chromosomy należące do pary homologicznej zawierają takie same loci ułożone w identycznej kolejności.

Restryktazy (enzymy restrykcyjne , endonukleazy restrykcyjne) - to enzymy bakteryjne rozpoznające specyficzne sekwencje DNA (zazwyczaj palindromowe) i przecinające helisę DNA w określonym miejscu. Uzyskane w ten sposób fragmenty DNA posiadają identyczną sekwencję nukleotydów.

Hybrydyzacja - komplementarne łączenie się dwóch nici DNA (lub RNA)

Blotting - transfer DNA na filtr

Badania genetyczne

Sięga się do nich między innymi przy dochodzeniu rodzicielstwa, pokrewieństwa, identyfikacji zwłok i szczątków oraz do identyfikacji próbek materiału genetycznego. Badania polegają na porównaniu profilu genetycznego zwłok z profilem DNA żyjących krewnych.

Metody:

- technika PCR (Polymerase Chain Reaction) ? metoda amplifikacji - analiza polimorficznych sekwencji mikrosatelitarnych jądrowego DNA. Polega na powieleniu (enzymatycznej amplifikacji) odcinka DNA bez klonowania, co pozwala na szybkie zwielokrotnienie segmentu DNA, skracając tym samym czas badań. Zastosowanie tej techniki pozwala na określenie fenotypów loci nawet w przypadku bardzo starych i niewielkich śladów biologicznych. Do analizy wykorzystuje się krew, ślinę, włosy z cebulkami, kości, zęby i tkanki

- Druga metoda skupia się na badaniu mtDNA. Jest wykorzystywana przede wszystkim w sytuacjach, kiedy materiał biologiczny jest niewystarczający. MtDNA występuje w wielu kopiach przez co jego badanie jest skuteczniejsze niż badanie DNA jądrowego.

- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA w systemie genetycznym danej populacji. Określana także jako badanie genetycznych odcisków palców (DNA fingerprints). Metoda bardzo dokładna, ale wymagająca większej ilości materiału genetycznego i trwająca dłużej niż metoda PCR.

- blotting Southerna -elektryczny transfer pojedynczych nici na podłoże, ich immobilizacja i hybrydyzacja sondą DNA

Kolejność analizy fragmentów restrykcyjnych:
- izolacja i oczyszczenie DNA
- cięcie enzymami restrykcyjnymi
- rozdzielenie fragmentów DNA
- denaturacja DNA (termiczny rozkład helisy na pojedyncze nici)
- transfer nici z żelu na podłoże nitrocelulozowe
- hybrydyzacja
- detekcja i analiza




Błędy w analizie
Błąd przedlaboratoryjny - niewłaściwe zabezpieczanie bądź przechowywanie
Błąd laboratoryjny - kontaminacja, preferencyjna amplifikacja, reakcje fałszywie negatywne, niedoskonałość rozdziałów
Kontaminacja może nastąpić: materiałem genetycznym pracowników laboratorium, zmieszanie próbek, kontaminacja produktami PCR

Cechy mtDNA
mtDNA występuje w komórce w setkach lub tysiącach kopii
mtDNA jest dziedziczone w linii matczynej
cechuje go wysoki polimorfizm
Inną cechą mtDNA jest jego względna stałość, wynikająca z niewielkich rozmiarów i braku obszarów nie kodujących.

Zastosowanie analizy MtDNA w naukach sądowych
Badanie śladów biologicznych
Szczątków ludzkich
Materiału zwierzęcego

Polimorficzne układy chromosomu Y - jest haploidalny
- nie ulega rekombinacji genetycznej
- specyficzny dla osobników płci męskiej
- dziedziczony wyłącznie po ojcu

Zastosowanie polimorficznych układów chromosomu Y w badaniach sądowych
Polimorficzne układy chromosomu Y umożliwiają wykrywanie i różnicowanie materiału genetycznego pochodzącego od mężczyzn, identyfikację oraz indywidualizację DNA należącego do mężczyzn w śladach stanowiących mieszaniny materiału pochodzącego od wielu mężczyzn i kobiety np. gwałt zbiorowy

-1984 -? Alec Jeffreys pracownik naukowy Uniwersytetu Leicester pracując przy sprawie Colina Pitchforka udoskonalił metodę utrwalania na błonie rentgenowskiej i porównywania znaczników genetycznych w postaci "kodu paskowego".

-1928 - Frederick Griffith odkrył, że niezakaźne postacie bakterii wywołującej zapalenie płuc mogą przekształcić się w zakaźne, jeżeli wstrzyknie się je do organizmu myszy wraz z martwymi bakteriami chorobotwórczymi. Zjawisko to zostało nazwane transformacją.

- 1944 - Oswald Avery, Colin MacLeod i Maclyn McCarty wykazali, że tzw. czynnikiem transformującym, który pobierany od martwych bakterii zakaźnych przez niezakaźne powodował przemianę tych ostatnich w formy chorobotwórcze, jest DNA. Tym samym udowodnili, że geny są zbudowane właśnie z tego związku, a nie - jak wcześniej powszechnie przypuszczano - z białka.

- 1949 - Erwin Chargaff odkrył, że skład DNA poszczególnych gatunków może się różnić. Zawsze jednak jest dokładnie tyle samo adeniny, ile tyminy oraz guaniny i cytozyny.

- 1953 - Francis Crick i James Watson, opierając się na wynikach badań Rosalind Franklin, Maurice'a Wilkinsa i ich współpracowników, opisali strukturę DNA. 25 kwietnia opublikowali na ten temat historyczną pracę w "Nature".

- 1961 - Francis Crick i Sydney Brenner udowodnili, że kolejność ułożenia aminokwasów w białku jest zapisana w DNA kolejnymi trójkami zasad (trzy nukleotydy kodują jeden aminokwas), które się nie nakładają, i że jeden aminokwas może być kodowany przez kilka trójek.

-1966 - Marshall Nirenberg, Har Khorana oraz Severo Ochoa ostatecznie rozszyfrowali kod genetyczny, czyli ustalili, które trójki zasad kodują które aminokwasy.

 

---