Mikrobiologia Ćw. 6

Metody identyfikacji biochemicznej

Metody klasyczne:

- pośrednie

- bezpośrednie

Metody współczesne:

- Systemy API

- metoda Enterotube

- komputerowe systemu identyfikacji bakterii i automatyzacji

Pośrednie:

Rozkład cukrów:

- wykrywanie różnic w zdolności do rozkładu różnych cukrów (glukoza, laktoza, sacharoza, mannitol, fruktoza, itp.)

- nieposiane podłoża mają barwę jasnosłomkową, filetową lub czerwoną (w zależności od rodzaju danego wskaźnika)

- rozkład cukrów prowadzi do fermentacji (octowa, alkoholowa, masłowa, itp.), podczas której pH spada < _lub
równo) 7 - zakwaszenie środowiska, pod wpływem indykatora powoduje to zmianę barwy podłoża (zwykle na kolor
czerwony lub żółty) oraz bez lub z wytworzeniem gazu -CO₂ (widoczny w rurce fermentacyjnej Durhama).

Rozkład związków zawierających azot:

- rozkład białka, AA, związków azotowych (dezaminacja, dekarboksylacja, itp.), alkalizacja środowiska (pH>7) i zmiana
barwy podłoża (dzięki obecności wskaźnika w podłożu), możliwość uwalniania gazu (siarkowodór, amoniak)

- zdolność do wytwarzania siarkowodoru - rozkład AA zawierających siarkę, bada się na specjalnych podłożach
(podłoże Kliglera, SS, itp.)Pod wpływem powstającego siarkowodoru następuje czarnienie podłoża

Podłoże Kliglera lub TSI (Triple Sugar Iron):

- stałe podłoże diagnostyczne w probówkach w postaci skosów dla pałeczek Gram - , o małych wymaganiach
odżywczych (Enterobarcteriaceae)

- pozwala zbadać zdolność rozkładu glukozy, laktozy i wytworzenie siarkowodoru

- posiew zarówno w części słupkowej (wkłucie), jak i skośnej

- podłoże zawiera m.in. mało glukozy i 10-krotnie więcej laktozy ( w proporcji 1:10), tiosiarczan i jony żelaza, które są
wskaźnikiem wytwarzania H₂S oraz wskaźnik pH

- ocena podłoża powinna być wykonana po 24 h

- wytwarzanie w czasie fermentacji cukrów, dużych ilości CO₂ lub H₂ uwidacznia się przez rozerwanie lub unoszenie
podłoża

- rozkład glukozy przejawia się zakwaszeniem i zażółceniem jałowego jasnoczerwonego podłoża. Zmiana postępuje
szybciej w części skośnej, gdzie wkrótce pojawia się powrót do barwy wyjściowej, z powodu wtórnej alkalizacji
będącej wynikiem rozkładu aminokwasów (skos jasnoczerwony + słupek żółty = rozkład glukozy)

- jeśli będzie rozkładana laktoza, żółte zabarwienie obu części utrzymuje się przez wiele godzin (skos żółty + słupek
żółty = rozkład laktozy)

- brak rozkładu cukrów wiąże się z alkalizacją pożywki, która pogłębia swoją wyjściową barwę, przyjmując kolor
czerwony

- tworzenie się H₂S z tiosiarczanem zachodzi powoli w kwaśnym środowisku słupka i powoduje powstawanie
nierozpuszczalnego czarnego strątu siarczanu żelaza

Zdolność produkowania indolu - do podłoża z wodą peptydową i tryptofanem, po odpowiednim czasie inkubacji, dodaje się do podłoża kilka kropli odczynnika Kovacsa. Obecność indolu widoczna jest w górnej warstwie w kształcie wiśniowego pierścienia. Jeśli badane bakterie nie wytwarzają tego produktu pierścień pozostaje barwy odczynnika

Zdolność rozkładu mocznika - wykrywane na podłożu Christensena z mocznikiem. Jeśli posiane bakterie wytwarzają ureazę i rozkładają mocznik, to rozkładowi towarzyszy produkcja amoniaku, który alkalizując podłoże zmienia jego kolor z żółtego na czerwono-fioletowy

Zdolność dekarboksylacji lizyny - posiew na podłoże Falkowa, gdzie następuje alkalizacja podłoża i zmiana barwy z żółtej na fioletową.

Metody bezpośrednie:

Próba na koagulazę - do roztworu plazmy króliczej wprowadzamy na około 18-24h hodowlę badanych zarazków. Zawartość probówki mieszamy (wstrząsanie) i wstawiamy do cieplarki. W razie wytwarzania koagulazy przez badany szczep, plazma ulega ścięciu (galaretowaty skrzep).

Orientacyjnie można tę próbę wykonać także na szkiełku podstawowym, dodając do zawiesiny bakterii małą ilość plazmy. Dodatni wynik - zlepianie bakterii w grudki

Próba na katalazę - do bulionowej hodowli bakteryjnej dodać kilka kropli 3% roztworu wody utlenionej. Przy dodatnim wyniku unosi się duża liczba pęcherzyków gazu, tworząc na powierzchni płyną obfitą pianę.

Próbę tę można przeprowadzić także na szkiełku podstawowym, na które nanosimy materiał badanej kolonii lub dużą kroplę hodowli bulionowej i mięsa z kroplą roztworu wody utlenionej.

Możliwe jest także naniesienie bezpośrednio na badaną kolonię 1-2% roztworu wody utlenionej. Wynik dodatni - powstanie pęcherzyków gazu.

Próba wytworzenie lipazy - stwierdzamy na podłożu z żółtkiem jaja, na które posiewa się bakterie w sposób umożliwiający uzyskanie pojedynczej kolonii. Drobnoustroje wytwarzające ten enzym powodują przejaśnienie podłoża wokół kolonii.

Próba wytworzenia hemolizy - posiew bakterii na podłoże agarowe z krwią w celu wykazania zdolności hemolizy (rozpuszczają krwinki czerwone)

Hemolizę podzielono na typy oznaczone literami alfabetu greckiego, w zależności od różnic działania na krwinki różnych gatunków zwierząt oraz odmiennego charakteru (strefa hemolizy, ostrość granic i stopień przejaśnienia)

Hemoliza alfa - wokół kolonii pojawia się strefa zielono-brązowa, na skraju której można zauważyć zupełną hemolizę objawiającą się zupełnym przejaśnieniem podłoża.

Hemoliza alfa' - w wąskiej strefie zupełnej hemolizy znajdującej się na obwodzie strefy o barwie zielonkawo-brązowej, stwierdza się niezhemolizowane krwinki czerwone. Niewyraźne przejście strefy hemolizy w podłoże niezmienione.

Hemoliza beta - wokół kolonii strefa zupełnego przejaśnienia podłoża.

Hemoliza gamma - brak zdolności hemolizy krwinek czerwonych (bakteria nie wytwarza hemolizy), podłoże wokół kolonii niezmienione.

Metody współczesne:

1. System API:
   - opracowany przez firmę BioMerieux, obejmuje szereg zestawów do ukierunkowanej identyfikacji
   chorobotwórczości bakterii na podstawie charakterystycznych aktywności biochemicznych.

- biochemiczny szereg identyfikacji API ma postać paska z tworzywa sztucznego, w którym wytłoczone są
mikroprobówki

- każda mikroprobówka zawiera odpowiedni, odwodniony substrat, który zostaje uwodniony przez
wprowadzenie pipetą zawiesiny badanych bakterii

- do inkubacji paska w cieplarce służy indywidualna komora inkubacyjna, zapewniająca właściwą wilgotność

- reakcje biochemiczne zachodzące w czasie inkubacji powodują zmiany zabarwienia (samoistnie lub po
dodaniu odpowiedniego indykatora)

- do odczytu służy specjalna tabelka informująca o sposobie dokonania odczytu i zapisania wyniku w postaci
kodu numerycznego

- w karcie wyniku, testy podzielono na grupy po 3, a wartości 1,2 lub 4 odpowiadają dodatniemu wynikowi
reakcji w każdej grupie

- jeśli szereg API zawiera 20 testów, to dodając liczby w każdej grupie otrzymuje się kod numeryczny 7-
cyfrowy

- korzystając z książki kodów API i programu API LAB można dokonać identyfikacji nazwy gatunku, do którego
należy badana bakteria

Testy API opracowano dla różnych grup drobnoustrojów

2. Metody Enterotube:

- służą do różnicowania drobnoustrojów w obrębie rodziny Enterobacteriaceae - wysiewamy badany szczep
na kilku pożywkach znajdujących się w jednej probówce

- wnętrze probówki podzielone na 8-12 części, w których znajdują się podłoża umożliwiające określenie cech
biochemicznych (ilość i rodzaj tych podłóż zależy od producenta testu)

- posiew wykonuje się najczęściej za pomocą ezy, przeciągając ją jednym ruchem przez kolejne podłoża w
probówce

- inkubacja przez 24 lub 48h w odpowiedniej temperaturze

- na postawie zmian w zabarwieniu pożywek oznacza się właściwości biochemiczne badanego szczepu, co
pozwala na jego identyfikację

3. Komputerowe systemy identyfikacji bakterii i i automatyzacji.

1

---