Mikrobiologia Ćw. 4

Badanie hodowlane

Pożywki bakteryjne. Sposoby posiewów bakterii. Metody hodowli bakterii tlenowych i beztlenowych. Morfologia hodowli płynnej i kolonii bakteryjnej.

Tok postępowania rozpoznawczego (wcześniejszy wykres)

Pożywki bakteryjne:

Pożywka - odpowiednio dobrane podłoże służące do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych.

Cechy podłoża bakteriologicznego:

- zawiera odpowiednie składniki odżywcze

- odpowiednie pH

- izotoniczne

- przejrzyste (z pewnymi wyjątkami)

- jałowe

Podział podłóż:

- płynne - wyciąg mięsny, bulion, woda peptonowa

- półpłynne - 0,25-0,5% agaru

- stałe - agar odżywczy (2-3% agaru), podłoże żelatynowe, podłoża z ziemniaka

Podłoża płynne:

- wyciąg mięsny - podstawowy składnik podłoży, sporządza się go z mielonego mięsa wołowego lub końskiego
(oczyszczone z tłuszczu i błon), zalanego podwójną ilością wody i pozostawionego na około dobę w szafie
chłodniczej.

Po przegotowaniu i przesączeniu wyciąg dopełnia się wodą do objętości wyjściowej i sterylizuje w autoklawie.

- bulion - wyciąg mięsny z dodatkiem 1-2% peptonu i 0,5% NaCl. Pepton - produkt częściowego enzymatycznego
trawienia białka (mieszanina wolnych aminokwasów i polipeptydów). Źródło azotu dla bakterii, niezdolnych do
rozkładania białka nienadtrawionego. NaCl zapewnia odpowiednie ciśnienie osmotyczne (izotonię). Wymagane pH
(7,2-7,4) uzyskuje się przez stopniowe dodawanie 10% roztworu NaOH lub HCl (kontrola pehamterem)

- woda peptonowa - woda destylowana, pepton, NaCl

Podłoża stałe:

- podłoże agarowe - składa się z bulionu i agaru w ilości około 2-3%. Agar otrzymywany jest z wodorostów morskich
(Agar Agar). W wodzie w temperaturze 100°C przechodzi w stan płynny, po oziębieniu poniżej 45°C zestala się
tworząc elastyczną masę, dającą się ponownie upłynnić po podgrzaniu do 100°C. Podłoże agarowe w temperaturze
inkubacji (37°C - optymalna dla większości bakterii chorobotwórczych) zachowuje stałą konsystencję. Agar nie jest
składnikiem odżywczym dla bakterii - służy do zestalenia pożywek.

- podłoże żelatynowe - składa się z bulionu i 15-20% dodatku żelatyny. W temperaturze 30-35°C przechodzi w stan
płynny. Nie nadaje się jako pożywka w hodowli inkubowanej w 37°C. w odróżnieniu od agaru, żelatyna stanowi
pożywkę dla drobnoustrojów.

Obecnie w handlu znajdują się gotowe preparaty suchych podłóż - buliony, agaru odżywczego, podłoża McConkeya, Klinglera i innych.

Podział podłóż ze względu na skład:

- naturalne - sporządzone z wyciągów z tkanek roślinnych lub zwierzęcych (niekiedy z dodatkiem krwi, surowicy lub
innych płynów ustrojowych)

- syntetyczne - zawierają wodę, sole mineralne i składniki odżywcze (aminokwasy, witaminy i inne substancje
chemiczne)

- zwykłe (ubogie) - bulion zwykły, agar zwykły

- wzbogacone (specjalne) - podłoża zwykłe z dodatkiem np. składników odżywczych (glukozy, wyciągu drożdżowego,
krwi, surowicy, żółtka jaja itp.) lub czynników wzrostowych (witamina K, niektórych aminokwasów, PABA, heminy,
koenzymów I i II).

Podział podłóż ze względu na przeznaczenie:

- wybiórcze - umożliwia rozwój danego gatunku bakterii chorobotwórczych, a hamuje wzrost pozostałej flory
bakteryjnej. Do izolacji określonych gatunków drobnoustrojów z materiału zanieczyszczonego postronną florą
bakteryjną

- różnicujące - daje możliwość wykrycia właściwości biochemicznych i fizjologicznych hodowanych drobnoustrojów

Podział podłóż ze względu na zastosowanie:

- transportowe - półpłynne, tylko do przechowania bakterii w czasie transportu

- transportowo-wzrostowe - do posiewu krwi (hemomedium, anaeromedium) - wstrzykiwanie próby na podłoże;
płynu mózgowo-rdzeniowego (meningomedium); moczu (dip-slide: uromedium, uricult) - znaczenie podłoża w
próbce

- wzrostowe

Cel posiewów na podłożach bakteriologicznych:

- izolacja zarazka - uzyskanie czystej hodowli

- sporządzanie szczepionki lub antygenu diagnostycznego - namnożenie określonego gatunku mikroorganizmów lub
produktów jego przemiany materii

- identyfikacja zarazka metodą biochemiczną

* posiewy wykonujemy za pomocą: wyjałowionej ezy bakteriologicznej, szklanej bagietki, pipety Pasteura lub
zwykłej.

- podłoże umieszcza się najczęściej na płytkach Petriego lub w probówkach (postać słupka - agar słupkowy, postać
skosu - agar skośny)

- płytki przechowywane w lodówce, przed posiewem podsuszamy (20 min.), układając je otwarte i odwrócone w
cieplarce

- naczynie z podłożem przed posiewem czytelnie oznaczamy (numer próby, data - probówki na 1/3 wysokości od
góry, płytki na denku, nie na wieczku!!!)

- w trakcie posiewów należy unikać zanieczyszczenia podłoża postronną mikroflorą (podłoża otwieramy tylko na czas
niezbędny, trzymamy ukośnie, wylot naczyń - probówek opalamy w płomieniu przed i po manipulacjach)

- korki chwytamy piątym palcem ręki za część wystającą z probówki

Izolacja czystych hodowli:

- w pracy bakteriologicznej dąży się zawsze do uzyskania czystych hodowli danego gatunku bakterii i jego
pojedynczych kolonii (pozwala poznać ich morfologię i różnicować)

- najczęściej w laboratoriach stosowana jest metoda posiewu sektorowego - posiew badanego materiału na kilku
polach (sektorach) powierzchni stałego podłoża

- na pierwszym polu posiewu wzrost drobnoustrojów jest najobfitszy, na drugim rzadszy, a na trzecim i czwartym
wyrastają z reguły już pojedyncze kolonie zarazka

- posiane podłoża inkubuje się przez określony czas w cieplarkach, zwykle w temperaturze 37°C i w atmosferze
zapewniającej wzrost danym zarazkom

- bakterie beztlenowe namnażają się tylko w atmosferze pozbawionej tlenu i wymagają specjalnych metod hodowli

Metody hodowli bakterii beztlenowych:

1. Metody fizyczne:

- hodowla w anaerostatach - posiane podłoża umieszczamy w szczelnie zamkniętych naczyniach, powietrze usuwamy za pomocą pompy próżniowej (hodowla w próżni) lub zastępujemy je gazem obojętnym dla bakterii, np. azotem, wodorem, dwutlenkiem węgla. Płytki agarowe inkubowane w próżni ustawia się wieczkiem do góry, zapobiegając odklejaniu się podłoża od szkła).

- podłoże Wrzoska - bulion zawierający kawałki jałowej wątroby (w podłoży Robertsona - kawałki serca), pokryte warstwą parafiny. Wycinki wątroby (serca) obniżamy potencjał oksydoredukcyjny bulionu, parafina uniemożliwia dostęp powietrza do pożywki po sterylizacji. W przypadku użycia bulionu, wcześniej przygotowanego, poddaje się zabiegowi regeneracji - gotowanie celem usunięcia resztek powietrza

- wysoki słupek agarowy - posianie badanej próby na upłynniony i ostudzony do temperatury 48°C wysoki słupek agarowy (8-10 cm). Po zestaleniu się podłoża powstają w nim warunki beztlenowe.

2. Metody chemiczne:

- umieszczeniu w hermetycznie zamkniętym naczyniu substancji chemicznych np.: pirogallolu w środowisku
alkalicznym - wiąże tlen; wprowadzenie do pożywki związków redukujących np.: tioglikanu sodowego, cysteiny -
obniżających potencjał oksydoredukcyjny

3. Metoda biologiczna:

- płytka Fortnera - hodowla w jednym szczelnie zamkniętym naczyniu beztlenowców i bakterii tlenowych. Po zużyciu
tlenu przez tlenowce powstają warunki sprzyjające rozwojowi beztlenowców.

4. Metoda kombinowana:

- fizykochemiczna - eksykator uszczelniony wazeliną, naczynie z pirogalolem i KOH, dodatkowo świeca do szybkiego
zużycia tlenu

Wzrost bakterii na podłożach:

- bakterie wprowadzone do pożywki rosną i namnażają się przez podział i po odpowiednim czasie tworzą populację
bakteryjną - hodowlę

- hodowla mieszana - w pożywce lub na niej namnożyły się różne gatunki bakterii

- hodowla czysta - w pożywce lub na niej namnożyły się drobnoustroje należące tylko do jednego gatunku

- hodowla płynna - hodowla bakterii w pożywce płynnej

- kolonia bakteryjna - lokalne, ograniczone, widoczne gołym okiem, na podłożu stałym, nagromadzenie komórek
potomnych, wywodzących się od jednej bakterii.

1

---