SPRAWOZDANIE Z BIOCHEMII

Wyznaczanie parametrów kinetyki reakcji enzymatycznej

za pomocą metod polarymetrycznych.

Aleksandra Poczkaj gr Ch2

Aleksandra Gatlik gr Ch1

Agnieszka Kopeć gr Ch1

1. Cel ćwiczenia:

Wyznaczenie parametrów kinetyki reakcji enzymatycznej hydrolizy sacharozy - wartości stałej K_m i V_max.

2. Przebieg ćwiczenia:

Do kolby o pojemności 100 ml wsypano 4 gram sacharozy, a następnie dolano bufor octanowy (pH 4,7) do kreski i wymieszano do rozpuszcznia sacharozy, otrzymując roztwór 4%. Połowę zawartości roztworu przelano do osobnej kolby, do której dodano 200 µl inwertazy. Następne rozcieńczenia wykonywano poprzez uzupełnienie buforem octanowym kolby 100ml do kreski, przelewając 50 ml do kolejnej i dodając inwertazy. Tym sposobem stężenie zmniejszało się z każdym podejściem o połowę.

Otrzymano więc stężenia 4%, 2%, 1% i 0,5%.

Roztwory wprowadzano do rurki polarymetrycznej, uważnie lejąc by nie powstał pęcherzyk powietrza, aż do uzyskania wypukłego menisku. Rurkę polarymetryczną wprowadzano do polarymetru i następnie dokonywano pomiaru skręcalności optycznej co 2, 4, 6, 8 i 10 minut.

Obliczenia:

Stężenie substratu po czasie:

Cs=1,16*(alfa/L)+0,23*Co

Stężenie produktu:

Cp=Co-Cs

Alfa- kąt skręcenia światła spolaryzowanego w danej chwili[stopnie]

L- długość rurki polarymetrycznej - 2dm

Co- początkowe stężenie substratu[g/ml]

t	alfa	Cs	Co-Cs	Vo	1/Co	1/Vo
4%
0,3	5	3,82	0,18	23,20186	0,25	0,0431
2	4,5	3,53	0,47
4	4,2	3,356	0,644
6	3,4	2,892	1,108
8	3	2,66	1,34
10	2,4	2,312	1,688
2%
1,38	2,2	1,736	0,264	10,49318	0,5	0,0953
2	2,2	1,736	0,264
4	2	1,62	0,38
6	1,8	1,504	0,496
8	1,5	1,33	0,67
10	1	1,04	0,96
1%
1	1,1	0,868	0,132	7,272727	1	0,1375
2	1	0,81	0,19
4	0,7	0,636	0,364
6	0,6	0,578	0,422
8	0,45	0,491	0,509
10	0,3	0,404	0,596
0,50%
1,08	0,4	0,347	0,153	3,297066	2	0,3033
2	0,35	0,318	0,182
4	0,3	0,289	0,211
6	0,2	0,231	0,269
8	0,1	0,173	0,327
10	0,05	0,144	0,356

Dla wykresów przeprowadzoną prostą regresji y=ax+b, dla których 'a' przyjmuje wartość Vo.

Wykres Lineaweavera - Burka:

Wartości 1/V₀ i 1/C₀ nałożono na wykres, które ustawiły się w sposób prawie liniowy. Niestety podczas pomiaru dokonano małych błędów, przy odczytywaniu skręcalności. Związku z tym przeprowadzono stałą regresji do tych punktów która wynosiła y=11,052x+0,0749. Punkty jej przecięcia z osią OX i OY POsłużyły do wyznaczenia wartości K_m i V_max.

Zlinearyzowanie równanie Michaelisa - Menten na wykres Lineaweavera - Burka wynosi:

Związku z tym:

-> V_max = 0,2142 [g/100ml*min]

K_M = 1,3482 [mol/dm³]

Wykres Michaelisa - Menten:

Na podstawie obliczonych wartości K_m i V_max, narysowano wykres Michaelisa - Menten.

V	Co
0,057948	0,5
0,091219	1
0,127949	2
0,160203	4

V obliczono ze wzoru:

3. Wnioski

Na wykresie Michaelisa - Menten widzimy że wraz ze wzrostem stężenia substratu rośnie szybkość reakcji chemicznej, zgodnie z teorią. Szybkość reakcji wzrasta liniowo, aż do osiągnięcia prędkości 0,13 [g/min] co odpowiada stężeniu 2,7[gl/ml]. Następnie reakcja zmniejsza swoją szybkość, ze względu na fakt, że enzym został wysycony substratem. Wraz ze wzrostem szybkości, wzrasta stężenie produktu, a stężenie substratu maleje.

Na podstawie otrzymanych wyników możemy stwierdzić, iż Vmax wynosi 0,2142. Niestety dla naszych stężeń Vmax nie jest uzyskiwane. Połowa szybkości maksymalnej 0,1071[g/min] jest uzyskiwana dla stężenia 1,3482 [g/mlObliczone pomiary nie pokrywają się ze sobą, występuje duża różnica wyników.

Analizując wykres Lineweavera - Burka da się zauważyć, że wszystkie punkty pomiarowe odstają od prostej regresji( y=11,052x+0,0749). Błędy te mogą wynikać z niedokładności mierzenia kąta skręcalności, ponieważ podziałka była bardzo mała, a ludzkie oko czasem zawodzi. Również mogą wynikać z błędu skręcalności właściwej zależnej od błędu współczynnika nachylenia ∆a. Należy też mieć na uwadze, że skręcalność właściwa świeżo przygotowanego roztworu cukru nie jest stała i dopiero po kilku godzinach przyjmuje wartość końcową, która stanowi ok. połowy wartości początkowej. Zjawisko to nazywamy mutarotacja. Równie możliwym powodem jest występowanie pęcherzyka powietrza, który spowodował odstępstwo punktu pomiarowego od prostej.

---