WYKŁAD -8-

Konwersja skrobi kukurydzianej.

Przypomnienie: skrobia jest niejednorodnym strukturalnie polimerem glukozy, składa się z dwóch frakcji (nierozgałęzionej i pozbijanej - amyloza, struktura helikalna utrzymywana jest przez wiązania wodorowe, które muszą być przed dalszą przeróbką zniszczone, najczęściej z wykorzystaniem wysokiej temperatury, druga frakcja - amylopektyna - to frakcja rozgałęziona, oprócz wiązań -1,4 występują też wiązania -1,6). Taka struktura skrobi pociąga za sobą określony sposób konwersji - celem jest otrzymanie czegoś, co jest słodkie (odpowiedniej formy cukru wyczuwanej przez kubki smakowe jako słodkie), bo skrobia słodka nie jest. Wykorzystywane są dwie grupy enzymów: -amylazy (wiązania glikozydowe znajdujące się wewnątrz cząsteczki - czyli są to endoglikozydazy), których działanie powoduje powstawanie dekstryn (oligomerów zawierających 6-7 cząsteczek glukozy), a w rezultacie powstaje dwucukier - maltoza (też nie jest słodki) oraz β-amylazy (enzymy sacharogenne - odcinają „od zewnątrz” po dwie cząsteczki glukozy, produktem jest β-maltoza i rozgałęziona dekstryna graniczna, gdyż enzymy te nie hydrolizują rozgałęzień). Wiązania -1,6 rozcinają oligo-1,6-glikozydazy.

W rozkładzie skrobi chodzi o uzyskanie cukrów prostych - monosacharydów. Proces konwersji skrobi dotyczy skrobi kukurydzianej i dla tego produktu został stworzony (USA chciało się uniezależnić od cukru z trzciny cukrowej z Kuby). Do 1972 roku używano jako jedynego środka słodzącego sacharozy. Pojawił się problem znalezienia tańszego cukru, nie pochodzącego z trzciny cukrowej (buraków cukrowych raczej się tam nie wykorzystuje). Ponieważ kukurydzę hoduje się łatwo, postanowiono wykorzystywać skrobię kukurydzianą jako źródło cukru (cukru typu środka słodzącego). Początkowo poddawano ją chemicznej, kwaśnej hydrolizie i otrzymywano dekstrozę - oligomery glukozowe, mało słodkie, dodatkowo z gorzkim posmakiem i pozostałościami koloru (z chemicznej obróbki). Chodziło nie tyle o wykorzystanie tego jako środka słodzącego do kawy czy herbaty, tylko o wykorzystanie w cukiernictwie, piekarnictwie, itd. Problem został dopiero rozwiązany w dwóch takich etapach, kiedy zaczęto przeprowadzać konwersję skrobi metodami enzymatycznymi. Na początku wykorzystywano tylko dwie grupy enzymów: bakteryjne -amylazy (→ dekstryny, czyli polimery zawierające 6-7 cząsteczek glukozy, jednocześnie skrobia przeprowadzana była w stan ciekły) i następnie glukoamylazy (cięcie miejsc rozgałęzień w amylopektynie i cięcie dekstryn do disacharydów). W ten sposób przeprowadzano proces sacharyfikacji i do lat 60-tych środkiem zastępującym sacharozę była dekstroza. Dopiero odkrycie mikroorganizmów wytwarzających izomerazę glukozową (izomeryzacja glukozy do fruktozy) rozwiązało problem znalezienia zastępczego w stosunku do sacharozy środka słodzącego, bo glukoza, którą otrzymywano, w przeciwieństwie do różniącej się od niej tylko konformacją fruktozy, nie jest słodka (i dlatego przeprowadza się glukozę we fruktozę !!! - bo jest słodka). Po znalezieniu tego enzymu opracowano technologię procesu ciągłego, z izomerazą glukozową immobilizowaną na stałym nośniku. Proces ten funkcjonuje od 1972 roku i pozwala otrzymywać syropy wysokofruktozowe (HFCF - high fructose corn syrup → są otrzymywane ze skrobi kukurydzianej). Pierwsze zawierały do 15% fruktozy, obecnie - zależnie od potrzeb przemysłowych otrzymuje się 42, 55 i 90%.

Proces technologiczny:

1. rozbicie struktury wyższego rzędu amylozy za pomocą wysokiej temperatury (niszczy się w amylozie wiązania wodorowe) → skrobia przechodzi w stan zżelikowany („kleikowanie” skrobi)

2. po rozbiciu struktury działa się pierwszym enzymem - -amylazą, otrzymuje się stan ciekły

3. zmienia się temperaturę i pH i wprowadza drugi enzym - glukoamylazę → sacharyfikacja (oba te enzymy mają inne optimum pH, za pomocą temperatury inaktywuje się -amylazę), odbywa się to w reaktorach o pracy ciągłej, trwa 65-75 godzin i pozwala otrzymać do 96% dekstrozy

4. izomeryzacja, czyli wykorzystanie aktywności izomerazy glukozowej, wykonuje się to w warunkach przemysłowych za pomocą kolumn ze zimmobilizowanym enzymem, trwałość takiej kolumny to kilka miesięcy

5. przeróbka chemiczna polegająca na oczyszczeniu: rafinacja obejmująca przeprowadzanie produktu przez szereg filtrów i kolumn z węglem aktywnym, kolumny jonowymienne, itd. - w sumie pozwala to otrzymać 42% syrop wysokofruktozowy, kukurydziany, a odparowanie zagęszcza go do 71%.

Jest to przykład procesu funkcjonującego na bardzo dużą skalę i wykorzystania

enzymu z grupy glikozydaz na skalę przemysłową

(a bardzo często lubię o to pytać ).

Izomeraza glukozowa (glikozydaza) jest także szeroko produkowana. Wiele bakterii wytwarza ją w ilościach interesujących dla potrzeb przemysłowych: u Flavobacterium arborescens jest to endoenzym (znajduje się wewnątrz komórek), wykorzystuje się komórki w stanie wolnym lub jako preparat, gdzie są one zimmobilizowane. Na dobrą sprawę wszystkie bakterie zawierają ten enzym wewnątrz komórek. Inne przykłady, to: Actinoplanes, Streptomyces, Bacillus coagulans, gdzie preparat przygotowuje się w ten sposób, że immobilizowane i związane glutaraldehydem komórki poddaje się lizie (pozbawia ścian komórkowych, żeby zapewnić kontakt z substratem). Preparaty te produkowane są przez wiele firm wytwarzających preparaty enzymatyczne do wykorzystania przemysłowego, występują one pod wspólną nazwą IGI (immobilized glucose isomerase), np. Sweetzyme®, Maxazyme®, Ketozyme®, Optisweet®, Taka-zyme® (każdy wytwarzany przez innego producenta).

Proces produkcji Taka-Sweet® (firma Miles Laboratoires).

Preparat składa się z komórek Flavobacterium arborescens zimmobilizowanych w natywnej postaci. Rozmiary tych komórek są bardzo niewielkie - immobilizację przeprowadza się w ciekawy sposób: po wyhodowaniu odpowiedniej ilości biomasy (w takich, warunkach, aby aktywność enzymatyczna była wysoka), oddziela się ją od podłoża (wiruje się hodowlę), ogrzewa się, aby doprowadzić do immobilizacji enzymu wewnątrz komórki (komórki są zabijane w takiej temperaturze, aby ich białka enzymatyczne pozostały aktywne). Pierwszym etapem immobilizacji jest sieciowanie komórek (bo są malutkie) przez dodanie polietylenoiminy i chitozanu (naturalny polimer) - tu powstaje pierwotne oblepienie tych komórek i powstanie większych agregatów, które dopiero immobilizuje się za pomocą glutaraldehydu, powstały preparat odbarwia się przez filtrację nadaje kształt i suszy.

Środki smakowe i zapachowe pochodzenia mikrobiologicznego.

Przemysł spożywczy od dawna interesował się tym, co nadaje specyficzny smak produktom otrzymywanym na drodze fermentacji. Sam proces fermentacji zwykle prowadzi - w przypadku mlekowej przeprowadzanej w mleku do ścięcia sernika, ale w zależności od tego, jakie są tam mikroorganizmy, powstaje szereg różnych metabolitów nadających specyficzny smak i zapach produktom mlecznym. To samo dotyczy np. fermentacji mlekowej prowadzonej przy wytwarzaniu piwa i wina. Już na początku dwudziestego wieku zaczęto się zastanawiać, czemu niektóre sery odpowiednio „pachną”, ewentualnie śmierdzą, tudzież same chodzą . Odkryto, że jedną z grup związków występujących w serach aromatycznych są metyloketony, że diacetyl, powstający również przy przetwórstwie mlecznym daje zapach masłopodobny. W sumie związki te strukturalnie nie są zbyt trudne dla syntezy chemicznej (istniałaby możliwość ich wytwarzania i tym samym skracania czasu oczekiwania na produkt otrzymywany na długiej drodze fermentacji - przez dodanie wytwarzanym normalnie podczas jej przebiegu związków smakowych i zapachowych). Jednak tendencja, żeby wykorzystywać procesy naturalne i otrzymywać żywność naturalną, pojawiła się już dość dawno, zaczęto więc zastanawiać się, w jaki sposób otrzymać w sposób naturalny wymienione związki.

Metyloketony (jedna z grup podstawowych związków występujących w serach) - badano je na przykładzie Penicillium roquefortii, okazało się, że głównym ich producentem są spory (nie komórki wegetatywne), powstają one w procesie bardzo podobnym do β-oksydacji, któremu ulegają kwasy tłuszczowe o łańcuchu węglowym mniejszym niż 14 węgli, ta reakcja utleniania przebiega z jednoczesną dekarboksylacją - utlenianie tych kwasów powoduje powstanie związków nadających serom pleśniowym specyficzny smak i aromat. Okazało się, że produkcja przemysłowa tylko i wyłącznie tych związków jest bardzo kosztowna - bardzo wiele z nich jest lotnych, są one toksyczne dla grzybów, więc nagromadzający się produkt jest czynnikiem ograniczającym. W produkcji tych związków stosuje się techniki fermentacyjne uzupełniane konwersjami mikrobiologicznymi - uzyskuje się mieszankę zawierającą pewną ilość mikroorganizmów i podłoża, w którym te mikroorganizmy rosły i mogły wybierać te metabolity, dla nas aromatyczne.

Diacetyl w rozcieńczonym roztworze daje zapach maślany, wykorzystuje go przemysł spożywczy i fermentacyjny. Są mikroorganizmy, które wykorzystuje się do jego produkcji na skalę przemysłową (szczegóły nie są znane, związek od lat jest sprzedawany w USA, jako produkt importowany z Francji, gdyż Stanach próbuje się metodami możliwie najbardziej ekonomicznymi i tanimi otrzymać to, co normalnie wytwarza się metodami naturalnymi, stąd prawdopodobnie sery sprzedawane tam jako naturalne, wcale takimi nie są).

Zapamiętać: jako przykłady substancji smakowych i zapachowych metyloketony (zapach sera) i diacetyl (zapach maślany).

Otrzymuje się też laktony - ale laktony specyficzne: cykliczne estry γ- i -hydroksykwasów, wykorzystywane jako środki zapachowe - mogą mieć zapach brzoskwiniowy, śmietankowy, owocowy, orzechowy, kokosowy, miodowy. Można to albo robić metodami enzymatycznymi (i tak się to robi) - wtedy stosowanym enzymem są lipazy, albo wykorzystuje się mikroorganizmy, które hodowane na odpowiednim substracie, wytwarzają tego typu związki.

Innymi związkami smakowymi i zapachowymi są kwas masłowy i izowalerianowy. Kwas masłowy - nie pachnący zbyt ładnie - w małych stężeniach wykorzystywany jest przez przemysł spożywczy i perfumeryjny, jego estry natomiast stanowią szeroko stosowane związki zapachowe, np. ester pentylowy → zapach bananowy, izobutylowy → gruszkowy. Podobnie estry kwasu izowalerianowego - zapamiętajcie, że nawet jeśli coś samo niezbyt przyjemnie pachnie, to jeżeli zrobi się z tego ester, to otrzyma się np. zapach jabłkowy, waniliowo-jabłkowy, malinowy. Ester etylowy kwasu izowalerianowego jest stosowany w cukierkach, gumie do żucia.

Zastosowanie mieszanin smakowo-zapachowych.

1. mleczarstwo - głównie chodzi tu o procedury stosowane w Stanach: są takie mieszaniny, które mają zapach serowy, są one stosowane do nadawania specyficznego smaku i zapachu różnym sosom i przekąskom. W Stanach skrócenie czasu dojrzewania sera z zachowaniem walorów smakowych otrzymuje się w ten sposób, że dodaje się odpowiednik takich past - otrzymuje się sery zwane od technologii EMC(Enyme Modified Cheese), do ściętego w naturalne sposób sernika dodaje się past zawierających odpowiednie mikroorganizmy, enzymy i jeszcze pewnego rodzaju mieszanki smakowo-zapachowe, istnieje pełna gama możliwości otrzymywania sera Cheddar, Permezanu, Mozarelli - które tymi serami właściwie nie są.

2. zapachy „chlebowe” - ciasta drożdżowe mają bardzo specyficzny aromat, ale muszą one rosnąć - czas ten (przy produkcji na skalę komercyjną) podraża koszty, opracowano różne procedury umożliwiające skrócenie procesu produkcyjnego: stosuje się tzw. zapachy prefermentacyjne - to, co można dostać pod nazwą „drożdże instant”, nie są to drożdże, które po wrzuceniu do mleka i zmieszaniu z mąką będą rosnąć i pączkować, tylko taki zapach prefermentacyjny robi się w ten sposób, że drożdże podhodowuje się trochę, to jest taka mieszanina, która zawiera wodę, cukier (bo coś muszą one jeść), sół, sproszkowane odtłuszczone mleko - po 6 godzinach fermentacji (drożdże rosnąc i fermentując wytwarzają swoje charakterystyczne substancje, nadające specyficzny smak i zapach) suszy się to i pasteryzuje. Taki produkt dodaje się do ciasta, które już nie musi rosnąć (aby było pulchne, dodaje się innych związków)

3. istnieją preparaty enzymatyczne zawierające proteazy i amylazy, które mają poprawić strukturę ciasta: często słyszy się o mące bezglutenowej, o tym, że niektórzy muszą jeść pieczywo bezglutenowe. W mące (w nasionach, z których się ją otrzymuje) oprócz skrobi występuje też białko. Gluten jest białkiem występujący w nasionach zbóż, najbardziej znany i wykorzystywany jest gluten pszenny, otrzymuje się go przez odmywanie mąki wodą, co daje substancję białkową zawierającą do 90% białka, która jest elastyczna, swoista, lepka i plastyczna, od ilości i zawartości glutenu zależą walory wypiekowe mąki, co ma szczególne znaczenie, gdy ciasto ma być bardzo chrupkie i długo ma pozostać kruche (np. krakersy). Gluten ma specyficzne białka: prolaminy (inaczej gliadyna) 40-50% i gluteliny (inaczej glutanina) do 40%, oprócz tego są jeszcze inne białka. Gluten charakteryzuje się tym, że zawiera dużo glutaminy, kwasu glutaminowego, oprócz tego Pro, Leu i Ile - wszystkie te aminokwasy odpowiadają za specyficzną strukturę i właściwości tego białka.To co w mące występuje dzięki glutenowi, to są płytki białkowe zbudowane z glutenu, pośrodku nich znajdują się lipoproteidy stanowiącedo 5% masy glutenu - wszystko to po uwodnieniu pozwala na wyrabianie ciasta. W zależności od tego czy gluten się podhydrolizowuje, czy nie, można taką mąkę stosować albo w warunkach domowych albo do wytwarzania suchych ciastek czy krakersów. Tutaj stosuje się właśnie preparaty enzymatyczne: proteazy - aby coś zrobić z glutenem i amylazy - aby zadziałać na skrobię (→ przykład specyficznego zastosowania enzymów w piekranictwie).

Zapamiętać: co to są naturalne i identyczne z naturalnymi środki zapachowe.

Roczny rynek środków zapachowych i smakowych w 1994 roku wyniósł prawie 10 mld $ - są one używane w olbrzymich ilościach. Znanych jest 10 tys. syntetycznych środków zapachowych, stosowanych jest kilkaset, 400 jest produkowanych w skali powyżej tony rocznie.

Istnieją 2 grupy związków smakowych i zapachowych, które i z punktu widzenia dużej skali produkcji i tego, że są najstarszymi tego typu środkami wymagają omówienia. Najstarszym jest wanilina, którą poznano pod koniec XIX wieku, jej struktura jest bardzo prosta, można ją otrzymywać syntetycznie (syntetyczny środek smakowy) - 12$/kg. Naturalna (tam, gdzie naturalnie występuje) jest ekstrahowana z nasion wanilii - 4000$/kg. Benzaldehyd ma zapach gorzkich migdałów, jest pierwszym związkiem zapachowym, jaki chemia poznała (odkryli go Liebig i Wöhlen pod koniec XIX wieku). Kolejnym związkiem jest dekanolid o odpowiedniej konfiguracji otrzymywany w wielu tonach rocznie.

Metody biotechnologiczne umożliwiły stosowanie związków mających wiele wspólnego ze związkami naturalnymi - są pochodzenia naturalnego, ale ponieważ nie pochodzą z naturalnego źródła, są nazywane identycznymi z naturalnymi - przy ich uzyskiwaniu wykorzystuje się: jednostopniowe biotransformacje ( podaje się prekursor przeprowadzany w produkt przez mikroorganizm lub enzym), biokonwersje lub syntezy de novo (bardzo wiele mikroorganizmów może syntezować to, co uważano, że występuje tylko w np. jakiejś roślinie). Związki naturalne stosuje się nie tylko ze względu na modę, ale także dlatego, że wiele z nich jest optycznie czynnych (synteza prowadzi do otrzymania mieszanin diastereoizomerów lub mieszanin racemicznych). Różnica między izomerami często jest ogromna, np. 4-Dekanolid (zapach owocowo-tłusty) w formie R wyczuwany jest w ilości 1,5 ppb, S - 5,6 ppb. W przypadku nootkatonu jeden z izomerów wyczuwalny jest w ilości 0,6-1,0 ppm - drugi: 400-800 ppm.

Wanilinę i benzaldehyd mogą wytwarzać grzyby (bakterie - diacetyl).

4-dekanolid to główny składnik smakowo-zapachowy truskawek, brzoskwiń i moreli, występuje też w produktach mleczarskich i w fermentowanej żywności. Jego proces produkcyjny znany jest od 1980 roku, cena naturalnego produktu - 1200 $/kg (źródło nie jest co prawda egzotyczne, ale związek pochodzący z naturalnych źródeł kosztuje 20000 $/kg). Produkt identyczny z naturalnym (uzyskiwany z mikroorganizmów) jest o wiele tańszy. Wykorzystuje się albo konwersje: podaje się odpowiedni substrat, mikroorganizmy przetwarzają go w ten związek lub syntezę de novo: wyselekcjonowane mikroorganizmy mają taki metabolizm, że powstaje to, co normalnie występuje w roślinach i ich owocach.

To samo dotyczy benzaldehydu: występuje w nasionach pestkowców, jest składnikiem glikozydu cyjanogennego (nazwa pochodzi stąd, że gdy zostaje niszczona tkanka roślinna, zaczynają działać enzymy hydrolityczne uwalniane z lizosomów, rozkładają glikozyd cyjanogenny - zwany tu amygdalina, oprócz benzaldehydu wydziela się cyjanowodór - sposób obrony przed roślinożercami, bo cyjanowodór dla mniejszych roślinożerców może wywoływać nieprzyjemne objawy ze strony przewodu pokarmowego). Tak otrzymywany benzaldehyd jest aromatem naturalnym, natomiast identyczny z naturalnym uzyskuje się przez mikrobiologiczną degradację fenyloalaniny: niektóre grzyby (podstawczaki) mogą egzogennie podaną fenyloalaninę degradować na dwa sposoby - albo do benzaldehydu (uzyskuje się to, co trzeba), albo inną ścieżką metaboliczną do 3-fenylopropanolu (zapach kwiatowy zbliżony do różanego.

Podobnie otrzymuje się wanilinę identyczną z naturalną. Wanilina nie była znana do czasów Corteza, do 1816 roku była izolowana z nasion wanilii, potem dopiero poznano jej strukturę. Konsumpcja to 12 tysięcy ton rocznie (z tego 50 ton z naturalnych źródeł). Metody biotechnologiczne pozwalają na uzyskanie waniliny identycznej z naturalną.

Środek zapachowy (smakowy) identyczny z naturalnym otrzymuje się przez wykorzystanie szlaku metabolicznego charakterystycznego dla roślin, a funkcjonującego w innych, niższych organizmach). Do otrzymania waniliny stosuje się grzyby zdolne do rozkładu (biodegradacja) lignin (występuje w nich bardzo wiele związków fenolowych, niektóre z nich, po zhydrolizowaniu lignin, stają się pięknym substratem dla szlaku metabolicznego, w którym powstaje pośrednio również wanilina). Tym składnikiem lignin jest kwas ferulowy, który określony gatunek grzybów przeprowadza w wanilinę.

Aromatów identycznych z naturalnymi produkuje się bardzo dużo. Na skalę przemysłową wykorzystuje się albo syntezę de novo (w mikroorganizmach - najczęściej grzybach - funkcjonuje taki szlak metaboliczny, który jest charakterystyczny raczej dla roślin) i biotransformację (np. degradacja fenyloalaniny przez grzyby do benzaldehydu). W ten sposób - z wykorzystaniem różnego rodzaju grzybów - otrzymuje się zapach kwiatów pomarańczy (tym co w nich pachnie jest antranilan metylu, podobnie pachnie też acetofenon), anyżowy. To samo można otrzymać stosując biotransformacje, prekursorami są aminokwasy: Phe dla zapachów wymagających benzaldehydu, ligniny i słoma dla wanilii, stosowany tu jest także olej rycynowy - jego składniki, a także Asn i Phe mogą być prekursorami zapachów różanych.

Enzymy w produkcji żywności.

Niezależnie od tego czy biotechnologia stosuje do otrzymania czegoś proces fermentacyjny, czy ma być to proces biotransformacji czy transformacji, zawsze to, co powstaje, jest produktem jakiejś reakcji biotechnologicznej.

Problem enzymów występujących w produktach, którymi obraca przemysł spożywczy:

1. Mięso, wprowadzane normalnie do sprzedaży czy poddawane przetwórstwu zawiera bardzo wiele różnego rodzaju enzymów, z których najistotniejsze są hydrolityczne enzymy typu katepsyn, po śmierci w mięśniu zachodzi proces określany „rigor mortis” (kiedy zostaje odcięty dopływ tlenu, mięsień przechodzi na metabolizm beztlenowy, to trwa jeszcze przez pewien okres czasu po śmierci zwierzęcia, powstaje bardzo dużo kwasu mlekowego, obniża się pH mięśnia, kompleks aktomiozyny zostaje utrwalony w takiej postaci i następuje skurcz, mięsień jest twardy). Tutaj problem zastosowania enzymów w przetwórstwie spożywczym dotyczy procesu kondycjonowania mięsa - takiego działania temperaturą czy pH, aby było ono odpowiednio kruche, a nie twarde.

2. Innym przykładem są enzymy w mleku: zawiera ono około 30 enzymów (pozostałości po procesie sekrecji, np. katalaza). Z punktu widzenia przechowywania mleka szczególne znaczenie mają proteazy, zwłaszcza działające na jeden z rodzajów kazeiny (główne białko mleka, występujące w kilku postaciach, jedna z nich jest bardzo podatna na działanie enzymów proteolitycznych - wywołuje warzenie się mleka podczas przegotowywania, obecnie mleko w sprzedaży jest odpowiednio przygotowywane). W mleku znajdują się też lipazy - działając na tłuszcze mleka powodują jego jełczenie.

3. Ostatnim z tych problemów to enzymy w owocach (po przecięciu ciemnieją - w tkankach roślinnych występują oksydazy polifenolowe, które w określonych warunkach powodują powstawanie melanin o ciemnym zabarwieniu). Z punktu widzenia biotechnologii bardzo duże znaczenie mają pektynazy. Komórki roślinne są pozlepiane ze sobą dzięki pektynom, występują też w blaszce środkowej (rozdziela sąsiednie komórki). Związki te mają złożoną budowę, głównym składnikiem są długie łańcuchy kwasu poligalakturonowego i pochodne cukrów, występują też cukry obojętne. Pektyny dodatkowo stanowią koloid ochronny - ze względu na swoją budowę mają zdolność chłonięcia wody (tworzą wtedy zbiornik wody zewnątrzkomórkowej). Pochłonięcie wody powoduje żelowanie, oprócz tego pektyny w blaszce środkowej występują w charakterze soli wapnia i są nierozpuszczalne. Pektyny utrudniają tłoczenie soku - chłoną wodę (funkcja ochronna) i z trudem ją oddają, dlatego traktuje się odpowiednio owoce, z których chce się otrzymać sok. Są dwa rodzaje soku pomidorowego: ciepło- i zimnoprzerywany w zależności od tego czy pektynazy znajdujące się w owocach zostały od razu zinaktywowane (ciepłoprzerywany), czy dopiero po pewnym czasie dojrzewania. Sok ciepłoprzerywany jest pulpowaty, lepki - pektyny nie uległy rozkaładowi, zimnoprzerywany jest rzadki, używa się go do produkcji koncentratów.

Największe zastosowanie mają enzymy łatwe w użyciu, czyli te nie wymagające kofaktorów - głównie hydrolityczne. Istnieją trzy grupy tych enzymów, m. in. lipzay (zastosowanie: produkcja serów i makrocyklicznych laktonów, uzyskiwanych prze katalizowanie reakcji wewnątrzcząsteczkowej cyklizacji).

Na początku lat 80-tych produkowano rocznie około 65 tysięcy ton za około 400 mln $. Głównymi producentami enzymów wykorzystywanych w procesach biotechnologicznych jest Dania, Holandia, USA, Japonia, Niemcy, Francja, Szwajcaria i Anglia. Oprócz lipaz czy enzymów z grupy glikozydaz (przykład izomerazy glukozowej) duże zastosowanie mają enzymy proteolityczne (hydrolazy peptydowe).

Proteazy wykorzystywane na dużą skalę są pochodzenia zwierzęcego (główny udział miała podpuszczka - teraz zastępuje się ją podpuszczkami pochodzenia mikrobiologicznego), roślinnego (trzy podstawowe: papaina z Carica papaya, ficyna z ananasa, bromelaina z ananasa i ficyna z fikusa) oraz mikrobiologicznego (są najbardziej rozpowszechnione, bo łatwo jest je preparować. Proteazy, jako enzymy „depolimeryzujące” biopolimery, przez mikroorganizmy muszą być wydzielane do podłoże - łatwo je otrzymywać, dodatkowo można znaleźć szeroki wachlarz różnego rodzaju specyficzności (polega na tym, że tną łańcuch polipeptydowy albo od końca - paptydazy, albo wewnątrz - proteinazy, ponadto różnią się specyficznością polegającą na tym, między jakimi aminokwasami preferują wiązania peptydowe).

Ogólny diagram produkcji przemysłowej enzymów.

Enzymy otrzymywane na skalę przemysłową nie są preparatami zawierającymi czyste, krystaliczne białka - są to raczej surowe preparaty w postaci zawiesin lub proszków enzymatycznych. Zależnie od tego czy enzymy pochodzą z mikroorganizmów, czy z organizmów wyższych, wczesne etapy produkcji różnią się, dalej proces oczyszczania jest bardzo podobny: prosta ekstrakcja, zagęszczanie, ewentualnie wytrącenie - preparat enzymatyczny zawiera jeszcze w sumie bardzo dużo materiału balastowego, ale źródło dobiera się w taki sposób, aby zawierało ono takiej aktywności enzymatycznej odpowiednio dużo. Enzymy pochodzenia mikrobiologicznego mają o wiele większy udział w rynku ze względu na łatwiejszy proces oczyszczania. Preparaty enzymów pochodzenia roślinnego są bardzo drogie - mimo, że materiału roślinnego można zebrać dużo, to białko preparuje się o wiele gorzej, niż z innego materiału i występuje w o wiele mniejszych ilościach, niż można by się tego spodziewać. Materiał zwierzęcy już w momencie zbierania musi być poddany odpowiedniej procedurze - musi być zebrany i przechowany w odpowiedniej temperaturze, stąd największy rynek mają preparaty pochodzenia mikrobiologicznego, również można znaleźć wśród mikroorganizmów enzymy o bardzo szerokim spektrum działania.

Rodzaje zastosowań proteaz w przemyśle jako preparatów enzymatycznych - zastosowanie znajdują wszystkie rodzaje proteaz:

• dla trypsynopodobnych (otrzymywane z promieniowców lub - jako jedyny tutaj przykład proteaz pochodzenia nie mikrobiologicznego, tylko zwierzęcego - pankreatyna - mieszanina enzymów lipo- i proteolitycznych wykorzystywanych w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym, jako substytut własnych enzymów przy chorobach trzustki oraz przy garbarstwie), alkaliczne proteazy pochodzenia bakteryjnego są stosowane w proszkach i detergentach enzymatycznych obok lipa

• proteazy tiolowe (głównie pochodzenia roślinnego) - niewielkie zastosowanie

• pepsynopodobne proteinazy kwaśne, głównie (obok wieprzowej i wołowej) z Aspergillus, są wykorzystywane do hydrolizy białek soi (produkcja sosu sojowego

Przykłady zastosowania:

• Kontrola gorzkiego smaku w hydrolizatach białka - białko zwierzęce (jako odżywcze) jest dość drogie, opracowuje się metody odzysku białka z materiałów odpadowych z przetwórstwa zwierzęcego czy roślinnego. W hydrolizatach białka, które produkuje się, aby dodawać je do żywności (zupy w proszku, konserwy), chodzi o to, żeby białko takie nie miało gorzkiego smaku. W zależności od tego, jaką proteazę się użyje (w jakich miejscach zostanie zhydrolizowany łańcuch polipeptydowy), pojawiają się na wolnych końcach polipeptydu aminokwasy hydrofobowe (im więcej takich aminokwasów na zewnątrz, tym taki hydrolizat jest bardziej gorzki) - należy dobierać proteazy hydrolizujące białko tak, żeby gorzki smak się nie pokazywał.

• Hydroliza białka soi - gdy zostają resztki soi po wyciśnięciu z nasion oleju (jedno ze źródeł uzyskiwania oleju), to co zostaje po tłoczeniu oleju, poddaje się działaniu alkalicznej proteinazy, uzyskany produkt dodaje się np. do konserw lub innych produktów żywnościowych.

• Hydrolizaty żelatyny - białko mające bardzo mało Trp (mała wartość odżywcza), takie hydrolizaty są dodawane do produktów żywnościowych z innymi białkami i wykorzystywane między innymi w niskokalorycznych napojach („wypychacz” żołądka o niewielkiej wartości kalorycznej), dodaje się je także często do napojów podhydrolizowanych, żeby nie było żelowania (jeśli białka jest dużo, to w płynie może nastąpić zjawisko żelowania) i wykorzystuje w kosmetyce (dodatki do kremów i szamponów). Typowy proces trawienia żelatyny to: 30% roztwór żelatyny, mieszanina alkalicznych i obojętnych proteaz, 4 godziny inkubacji, pasteryzacja w 90 stopniach.

• Hydroliza białek serwatki i kazeiny - trawi się trypsyną, pepsyną, albo proteazami trypsyno- i pepsynopodobnymi pochodzenia mikrobiologicznego dla uzyskania produktów dietetycznych (stosowane np. w chorobach trzustki czy żołądka, gdy zmniejszone jest wydzielanie natywnych enzymów), proteazy wykorzystuje się też do produkcji mieszanek zastępujących mleko (poddaje się hydrolizie białka soi, serwatkę, kazeinian sodu → po okresie inkubacji to wszystko razem daje substytut mleka).

• Odzysk białka zwierzęcego z kości - po obraniu ich z mięsa zostaje w nich około 5% białka - za pomocą odpowiednich proteaz produkuje się ekstrakty dodawane także do zup w proszku, konserw (zastosowanie alkalicznej proteinazy).

• Wykorzystywanie białka rybiego - resztki po przeróbce (ości, płetwy, skóra) rozdrabnia się, działa w roztworze wodnym odpowiednią proteazą → następuje hydroliza, taką mieszaninę podgrzewa się, pasteryzuje (następuje denaturacja enzymów) i przesiewa się (części nierozłożone: łuski i ości są odsiewane), pozostałość jest zatężana (powstaje produkt częściowo rozpuszczalny) lub odwirowywana (oddziela się od tego substancje tłuszczowe - olej i otrzymuje produkt rozpuszczalny).

• Detergenty enzymatyczne, mleczarstwo (podpuszczka), browarnictwo (na końcu procesu produkcji dodaje się proteazy, aby zhydrolizować białko, które jeszcze pozostało).

• Garbarstwo - proteazy alkaliczne na etapie moczenia skóry usuwają zanieczyszczenia z tej skóry, stosuje się preparaty trypsyny z trzustki wołowej lub wieprzowej, zawierające też pewien procent lipaz i amylaz, które w tym przypadku nie przeszkadzają. Preparaty enzymów proteolitycznych stosuje się też w procesie usuwania włosów ze skóry (gdy robi się to chemicznie, powstaje bardzo dużo siarkowodoru, niszczy się te włosy), gdy zastosuje się proteazę alkaliczną, nie zanieczyszcza się środowiska, nie trzeba alkalizować później mieszaniny (obniża się koszt procesu, bo nie trzeba stosować wapnia), otrzymuje się nienaruszone włosy usunięte ze skóry (np. produkcja filcu). Proces jest jednocześnie łatwy do kontrolowania.

• Proteazy roślinne stosuje się jako dodatek do paszy (ułatwione przyswajanie), przy produkcji podłoży mikrobiologicznych, wchodzą w skład mieszanek poprawiających trawienie.

• Brinaza (proteaza z Aspergillus oryzae, podobna do pepsyny) hydrolizuje fibrynę i fibrynogen - u ludzi poddawanych hemodializie zatykają się fibryną naczynia krwionośne, po zastosowaniu tego enzymu uzyskuje się po kilku minutach efekt rozpuszczenia skrzepu.

• Kolagenaza jest stosowana w bezbolesnym usuwaniu małych guzków skórnych, blizn po oparzeniach.

• Lizostafina (pochodzenia bakteryjnego) wykorzystywana jest przeciwko zakażeniom Staphyococcus aureus wtedy, gdy zakażeniu uległa powierzchnia skóry, enzym stosuje się na powierzchniach błon śluzowych nosa i gardła, jest bardzo efektywny (działa jak koagulaza), usuwa zakażenie a jednocześnie jest nietoksyczny - bardzo szybko uzyskuje się w ten sposób unieszkodliwienie gronkowca.

Wykorzystanie enzymów z grupy glikozydaz (jednym przykładem jest izomeraza glukozowa).

• pektynazy - wytwarzane są do zastosowania w procesie przemysłowym także przez różne mikroorganizmy - producentem jest Aspergillus niger. Produkowana przez niego pektynaza ma aktywność esterazową, liazową i działa na bardzo wiele składników pektyn. Pektynazy stosuje się w ekstrakcji soków owocowych i przetwórstwie soków cytrusowych. Sok owocowy robi się tak, że nie niszczy się żadnej części owocu: najpierw owoc jest dzielony na skórkę i resztę, skórka - dzięki możliwości zastosowania pektynaz - jest wykorzystywana do otrzymania naturalnych substancji zmętniających: mieli się, inaktywuje właściwe enzymy znajdujące się tam, chłodzi i działa pektynazą. Cała reszta służy to wytłoczenia soku, pozostają po tym komórki roślinne - pulpa, w której nie ma już soku, również jest poddawana działaniu pektynazy, odzyskuje się dzięki temu resztki soku i pektynę - naturalne środki zmętniające. Do soku też dodaje się pektynazy obniżając jego lepkość.

• laktaza - wykorzystywana jest jako preparat pochodzący z grzybów (w tym np. z niższych grzybów: drożdży) lub bakterii, stosuje się ją do uzyskania mleka czy syropu serwatkowego pozbawionych laktozy (o lepszych walorach odżywczych, bo wielu ludzi nie trawi laktozy). Do mleka dodaje się laktazę pochodzenia drożdżowego, natomiast w przypadku serwatek stosuje się laktazę z innych grzybów, gdyż działa ona w niższym pH (serwatki są zwykle bardzo kwaśne, są produktem ubocznym przy produkcji sera, są na tyle kwaśne, że pH nawet podnosi się za pomocą KOH), za każdym razem, działając laktazą, otrzymuje się, zależnie od procedury albo mleczny koncentrat bezlaktozowy, albo odtłuszczone, bezlaktozowe mleko lub bezlaktozowy syrop serwatkowy (jeden z substratów wykorzystywanych przez przemysł spożywczy, cukierniczy).

Tłuszcze i oleje z mikroorganizmów

Wspominano wcześniej o strategii SCP (single cell protein), gdzie komórki mikroorganizmów miały służyć jako źródło białka dodawanego do paszy lub żywności (jak dotąd stosuje się tylko jako dodatek do paszy - w żywności można znaleźć różne hydrolizaty enzymatyczne, ale nie pochodzą one z mikroorganizmów, tylko z resztek innych produktów żywnościowych). Istnieje też strategia SCO (single cell oil) - wykorzystanie mikroorganizmów gromadzących w komórkach oleje. Mikroorganizmy oleageniczne wytwarzają oleje o strukturze i składzie zbliżonym do roślinnych. Źródeł oleju interesujących ze względów spożywczych nie ma tak wiele: soja, orzeszki ziemne, bawełna, palmy, kokosy, słoneczniki, rzepak, winogrona (olej z pestek winogron). Cechą charakterystyczną takich mikroorganizmów jest występowanie liazy cytrynianowej - hydrolizuje cytrynian z powstaniem acetylo-CoA (może on wejść w cykl Krebsa bądź zapoczątkować syntezę kwasów tłuszczowych). U mikroorganizmów oleagenicznych jest drugie miejsce wytwarzania acetylo-CoA (normalnie powstaje po dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu, tu dodatkowo powstaje z kwasu cytrynowego, czyli nie musi być wytwarzany w mitochondriach), w komórkach następuje kumulacja oleju. Są drożdże, których lipidy mogą stanowić do 20% biomasy. U mikroorganizmów dysponujących liazą cytrynianowa kumulacja lipidów następuje, gdy stosunek źródła węgla do azotu wynosi 50:1 (nadmiar węgla, deficyt związków azotowych). Hodowla jest stacjonarna, gdy następuje wyczerpywanie azotu, mikroorganizmy zaczynają kumulować lipidy w komórkach. W hodowli ciągłej trzeba ograniczać dostęp azotu. Do tej pory produkuje się lipidy pochodzenia mikrobiologicznego w byłym ZSRR (Biolipid - dodatek do olejów napędowych). Moliwości wykorzystania takich olei to na razie tylko perspektywiczne rozważania - mogłyby stanowić substytut drogich olejów roślinnych i opłacałoby się produkować na dużą skalę takie mikrobiologiczne lipidy, jeżeli byłoby to coś nowego, o unikalnym składzie, otrzymywane na podłożach będących odpadami, najlepiej z jakiegoś innego przemysłu, niedostępne z innego rodzaju źródeł. Technologia ta ma taką przewagę nad SCP, że może być zastosowana w technice, stąd niepotrzebne są badania toksykologiczne.

Ciekawostki związane z substancjami lipidowymi produkowanymi z mikroorganizmów

• polihydroksymaślan PHB wytwarzany w Anglii (preparat nazywa się Biopol, jest to biodegradowalne tworzywo termoplastyczne)

• olej otrzymywany z glonów (nie jest olejem w sensie struktury chemicznej, ale ze względu na swoje właściwości chemiczne został do lipidów zaliczony), glon Botrycoccus braunii w komórkach gromadzi do 50% lipidów, związek wytwarzany przez niego nazywa się botrykocen, jeżeli przeprowadzi się jego kraking, otrzymuje się 67% benzyny, 15% paliwa do turbin lotniczych i 15% Diesla

Powyższe biotechnologie nie są jeszcze stosowane, gdyż są drogie.

3

Konwersja skrobi kukurydzianej.

---