WYKŁAD 7

OZNACZANIE BIAŁEK

Białka => niezbędne skł. pok., element bud. wszystkich tkanek i wielu zw. czynnych kontrolujących przemiany fizjologiczne

Produkty żywnościowe zawierające zw. białkowe analizowane są różnymi metodami
z uwagi na pochodzenie azotu:

1. mogą zawierać produkty rozpadu białek (peptydy, a-sy)

2. subst. azotowe niebiałkowe (pochodzące z różnych grup chemicznych i zw. organicznych i nieorganicznych)

[EGZ:

Wyjaśnij pojęcie mnożnika białkowego

100% rdzeń - cząsteczki]

Wyznaczono, że białka w cząsteczce posiadają azot na poziomie 15-18%. Śre3dnia jego zawartość określono na 16% - 100% białka / 16% azotu = 6,25

6,25 to głównie przyjęty mnożnik białkowy

Różnice w wart. przelicznika białkowego zw. z pochodzeniem białka

Białko

Roślinne zwierzęce

Np. kazeina zawiera 15,68% azotu, stąd 100%/15,68% = 6,38

Produkty białkowe pochodzenia roślinnego mają w swoim składzie mniej białka niż produkty pochodzenia zwierzęcego.

Metody oznaczania N w próbach: bezpośrednie i pośrednie.

Duński chemik Johan Kjeldhal (1849-1900) jako I opracował procedurę oznaczania N
z substancjach organicznych.

W metodzie można oznaczyć zawartość białka ogólnego w różnych rodzajach surowców, produktach w skali makro, półmikro i mikro.

Metoda Kjeldahla składa się z 3 etapów:

1. mineralizacja próby (org. W mineralna formę)

2. destylacja amoniaku z parą wodną

3. miareczkowanie (z kw. Borowym)

[spalanie białka w atmosferze H2SO4; forma organiczna przechodzi w formę mineralną mineralizacja próby]

[EGZ:

W jaki sposób postępujemy przy ozn. białka w nasionach pszenicy ?

- pobrać próbę , uwzględnić masę zmóż]

Aby wyniki były miarodajne należy przygotować próbę do mineralizacji:

• dokładnie zhomogenizować

• wielkość cząst. < 1mm

• usunięcie fosfolipidów i alkaloidów zawierających N poprzez ekstrakcję odpowiednimi rozpuszczalnikami lub gotowaniu z C₂H₅OH.

najlepiej gdy próbka analityczna zawiera 10-100 mg N

aby móc porównać wyniki przeprowadzonych analiz konieczne jest ustalenie wilgotności próbki. Jeśli znana jest wilgotność próbki to do przeliczenia wyników na suchą masę stosujemy równanie:

zawartość białka w przelicz. na sucha masę = (A x 100) / (100 - B)

A - zawartość białka w próbce (%)

B - wilgotność próby (%)

Proces mineralizacji

1. rozrywanie wiązań azotowych, przekształcanie całego N w jony amonowe

2. w klasycznej metodzie4 1g próbki - 25ml H₂SO₄

3. stosując Kjeldacha 12ml

4. temp. Wrzenia H₂SO₄ 338˚C, temp. Rozkładu 373˚C

5. [używać kwasu w nadmiarze]

Szybkość mineralizacji może być polepszona poprzez dodanie soli i katalizatorów, dodanie H₂SO₄ z nadmiarem z uwagi na:

• reagowanie z próba,

• reagowanie z odczynnikami,

• porównanie w trakcie mineralizacji.

Dodatkowymi parametrami zużycia H₂SO₄ jest skład próbki, przy czym próbki o dużej zawartości tł., będą zużywały więcej kwasu niż te o dużej zawartości białka lub węglowodanów.

Dodatek soli do mineralizacji próby

- podnosi temp. Wrzenia H₂SO₄

Głównie K₂SO₄, Na₂SO₄ lub ich mieszaniny

- Stosowane inne składniki, tzw. Mieszanina selenowa

90% Na₂SO₄ + 7% Hg₂SO₄ + 1,5% CuSO₄ + 1,5% Se

- Typowy stosunek do stosowanej soli 1,4 do 2

- a w przypadku próbek o dużej zaw. tł. nawet 2,8

Prędkość i skuteczność mineralizacji zależy nie tylko od temperatury w jakiej zachodzi proces ale od odpowiedniego katalizatora

• najlepsze Hg, Cu, Se (stosowane jako katalizatory w ponad 90% mineralizowanych próbach)

• stosowane są również tlenki lub sole HgO, HgSO₄, CuO, CuSO₄

Najczęściej Hg stosowana w aplikacjach jak skóra, pasza, ścieki wodne z uwago na zanieczyszczenia środowiska konieczne jest zbieranie w celu bezpiecznej utylizacji.

Przy zastosowaniu Se - mogą zachodzić starty N, w obecnej chwili mieszanina 1:1 Cu i TiO, np. do badań N w nasionach roślin oleistych

Czynniki utleniający to H₂O₂ - czynniki utleniające przyspieszające rozkład substancji organicznych - ogranicza pienienie próby podczas mineralizacji.

Czynniki redukujące K₂S lub Na₂S - wśród zasad dodane także jako substancje ograniczające ubytki azotu w trakcie mineralizacji.

Czas mineralizacji zależy od:

1. rodz. próby

2. użytej V H2SO4 (d= 1,84g/ml)

3. ilości dodanej soli

4. zastosowanego katalizatora

5. czynnika utleniającego

6. czynnika redukującego

7. temp. mineralizacji

Za koniec przebiegu mineralizacji przyjmuje się klarowanie próby.

Wykonywanie próby odczynnikowej - próby zerowej sprawdzającej czystość wszystkich zastosowanych dodatków przy min. - wyeliminowanie azotu nie należącego do próby właściwej

[EGZ:

Wyjaśnij zastosowanie prób zerowych w analityce żywności

odnośnik anulujący obecność N nie pochodzącego z prób (np. z brudnego odczynnika)]

Aparat Parnasa - Wagnera do destylacji mineralizowanej próby

1. Rozkład H₂SO₄ z uwolnieniem O2

1. 2H₂SO₄ 2SO₂ + O₂ + H₂O

2. utl. subs. org. z uwolnieniem CO₂, H₂O i NH₃

R xCO₂↑ + yH₂O↑ + zNH₃↑

3. Przechodzenie amoniaku w sól amonową - siarczan amonu

2NH₃ + H₂SO₄ (NH₄)₂SO₄

Destylacja NH₃ z parą wodną - SKRYPT

(NH₄)₂ + 2NaOH 2NH₃ + 2Na₂SO₄ + 2H₂O

NH₃ + H₃BO₃ NH₄H₂BO₃

Miareczkowanie

2NH₄H₂BO₃+ H₂SO₄ (NH₄)₂SO₄ + 2H₃BO₃

NH₄H₂BO₃ + HCl NH₄Cl + H₃BO₃

Destylacja próby w aparacie Parnasa - Wagnera

Rekacje:

• oddestylowanie jonu amonowego NH4+ w formę amoniaku przez oddanie NaOH do kolby destylacyjnej i związanie go w kolbie odbieralnika zawierającego roztwór kw. borowego H3BO3 (3%) ze wskaźnikami.

• Wskaźnik Tashiro - 0,05% alkoholowy roztwór czerwieni metylowej, 0,1% wodny roztwór błękitu metylowego w stosunku 10:3 podczas destylacji nastepuje zmiana barwy w odbieralniku z fiołkowej na zieloną

• Wskaźnik Ma i Zuazaga

Miareczkowanie

ilość wydzielonego N w formie NH3 obl. się z ilości związanego kwasu, wiedząc, że 1 ml kwasu odpowiada 0,01401 gN

% zaw. N ogólnego:

0,01401 (an-bn)*100

%Nog = m

Otrzymana wartość azotu przelicza się b. ogólnie w próbie mnożąc przez odpowiedni mnożnik białka uwzględniając jego wartość od rodzaju białka i związanej zawartości w nim azotu. Jest ona również określone jako b. surowe.

Oznaczane formy azotu:

1. N aminowy

2. amidowy

3. mocznikowy

Azot aminowy:

• metoda Sötensena - miareczkowanie

• metoda Van Slyke'a - gazometryczna

• metoda ninhydrynowa - bazuje na reakcji. między grupami aminowymi a ninhydryną

Czynnikiem determinującym wart. odż. białek jest jego skład aminokwasowi:

1. głownie a-sy egzogenne

2. N aminowy jest częścią N zawartego w rozpuszczalnych białkach, występuje
   w zasadach i wielkocząsteczkowych produktach białkowych.

Metoda Sörensena

• ozn. N aminowego w próbach

• w skutek reakcji aldehydu mrówkowego (formaldehydu) następuje blokowanie wolnych grup aminowych aminokwasów

• odmiareczkowanie wolnych grup karboksylowych za pomocą lugu (NaOH), przy założeniu, że ilość grup karbok. I amin. W badanych roztworach SA jednakowe, można obliczyć azotu

1ml zużytego do miareczkowania 0,1mNaOH odpowiada zawartości 1,4mg N

Oznaczanie N aminowego

R - CH + C=O R- CH + H2O

R - CH + NaOH R - CH + H2O

Azot aminowy

metoda van Slyke'a - gazometryczna (wolumetryczna)

RNH2 + HNO2 ROH + H2O + N2↑

reak. zachodzi między I rzędowym gr. Aminową a aminową w pozycji α , przebiega
w niskiej temp.

Oznaczenie jest wykonywane w aparacie zaopatrzonym w szklaną biuretę gdzie jest zbierany azot i jego tlenki. Tlenki reagują z KM_nO₄, a jego objętość pozostałego azotu jest mierzona w biurecie. Odczytana wartość jest podzielna przez 2 (przy założeniu, że połowa azotu pochodzi z kwasu).

1

• Kukurydza, jęczmień, asola, rzepak 6

• Żyto, pszenica, owies 5,7

• Łubin, arachidy 5,5

• białko mięsa 6,25

• białko mleka (kazeina) 6,38

• białko jaja kurzego 6,67

COO

NH₂

NH₂

COOH

N=CH₂

COOH

NH₂

COOH

H

H

N=CH₂

COOH

---