Ćwiczenia laboratoryjne z biochemii
Reakcje aminokwasów i białek
Cel ćwiczenia: Zapoznanie z budową i właściwościami aminokwasów i białek.
Aminokwasy są związkami organicznymi zawierającymi dwie grupy funkcyjne: karboksylową (-COOH) i aminową (-NH2). Aminokwasy są podstawowymi jednostkami strukturalnymi białek. Organizmy żywe budują wyłącznie tzw. -aminokwasy, czyli takie, w których grupa aminowa i karboksylowa są przyłączone do tego samego węgla ( i stąd nazwa -aminokwasy.
Każdy aminokwas prócz grup funkcyjnych zawiera też atom wodoru i charakterystyczny dla siebie podstawnik oznaczany ogólnie jako R. Jest to łańcuch boczny aminokwasu, który może mieć właściwości kwasowe, zasadowe, obojętne, może mieć też charakter alifatyczny, aromatyczny lub heterocykliczny.
Najczęściej stosowanym podziałem aminokwasów jest podział na podstawie charakterystyki właściwości podstawnika aminokwasów. Wyodrębniamy siedem grup: 1) aminokwasy alifatyczne, gdzie podstawnikiem jest łańcuch węglowodorowy, 2) aminokwasy zawierające grupę hydroksylową, 3) aminokwasy zawierające siarkę w podstawniku, które posiadają pewne unikalne cechy, wykorzystywane przez wszystkie organizmy żywe, 4) aminokwasy aromatyczne, posiadające w podstawniku pierścienie aromatyczne, 5) aminokwasy amidowe, których cząsteczki zawierają zmodyfikowaną grupę karboksylową przez wstawienie za grupę hydroksylową grupy aminowej, 6) aminokwasy kwaśne, zawierające dodatkową grupę karboksylową, 7) aminokwasy zasadowe, zawierające dodatkową grupę aminową.
Białka (polipeptydy) to związki wielkocząsteczkowe, zbudowane z reszt aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi (-CO-NH-), występujące we wszystkich organizmach roślinnych i zwierzęcych. Charakteryzują je bardzo wysokie masy cząsteczkowe.
Obecnie stosuje się podział białek pod względem składu chemicznego i wyróżnia dwie grupy:
białka proste (proteiny) - w wyniku całkowitej hydrolizy tych białek powstają tylko same aminokwasy, oraz białka złożone - w wyniku całkowitej hydrolizy tych białek powstają aminokwasy i składniki niebiałkowe tzw. grupy prostetyczne. Np. glikoproteidy zawierają jako składnik niebiałkowy cukrowce, nukleoproteidy - nukleotydy i kwasy nukleinowe, fosfoproteidy - resztę kwasu fosforowego, chromoproteidy - barwniki, lipoproteidy - tłuszczowce. Białka proste dzieli się na globularne i fibrylarne (włókniste). Białka złożone są bardziej rozpowszechnione w przyrodzie od protein. Do białek złożonych należą wszystkie enzymy, katalizujące przemiany zachodzące w organizmach żywych. Białka pełnią wiele funkcji i w związku z tym można je podzielić na: transportujące, przechowujące, strukturalne, regulatorowe, toksyny, przeciwciała, hormony, enzymy.
W strukturze białek można wyróżnić cztery poziomy organizacji zwane rzędowością. Struktura pierwszorzędowa jest wyznaczona przez sekwencję (kolejność)
aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.
Struktura drugorzędowa to typ przestrzennego ułożenia głównego łańcucha polipeptydowego na skutek tworzenia się wiązań wodorowych. Na ogół łańcuchy polipeptydowe białek układają się w kształt α-helisy (ślimaka) lub pofałdowanej kartki (harmonijki beta). Struktura trzeciorzędowa jest efektem pofałdowania i zwinięcia się łańcucha polipeptydowego, mającego już określoną strukturę dwurzędową. Organizację trzeciorzędową białek stabilizują wiązania wodorowe, mostki dwusiarczkowe oraz jonowe i hydrofobowe siły przyciągania pomiędzy grupami bocznymi aminokwasów. Struktura czwartorzędowa określa wzajemne ułożenie dwóch lub większej liczby łańcuchów polipeptydowych, z których każdy ma już określoną strukturę pierwszo-, drugo-, trzeciorzędową.
Strukturę czwartorzędową ma np. cząsteczka hemoglobiny - białko czerwonych krwinek, które bierze udział w transporcie tlenu, która składa się z czterech podjednostek.
Stosowane aminokwasy: glicyna, cysteina, tyrozyna, tryptofan;
Stosowane białka: białko jaja kurzego, żelatyna.
Szkło i sprzęt: probówki, statyw do probówek, uchwyt do probówek, zlewki, pipety.
Wykonanie ćwiczenia:
Reakcja z ninhydryną - odróżnianie aminokwasów i białek od innych związków organicznych.
Do jednej probówki wlać niewielką ilość roztworu glicyny a do drugiej roztworu białka kurzego lub żelatyny. Dodać do obu po 2 krople roztworu ninhydryny. Ogrzać do wrzenia na łaźni wodnej. Zanotować barwę i jej intensywność.
W reakcji następuje utlenianie tlenem pochodzącym z ninhydryny, deaminacja z wytworzeniem amoniaku oraz dekarboksylacja z wytworzeniem aldehydu i dwutlenku węgla. Ninhydryna ulega redukcji i łączy się z niezredukowaną cząsteczką ninhydryny wytwarzając produkt kondensacji, przeważnie o barwie niebiesko-fiołkowej.
Reakcja ksantoproteinowa - wykrywanie pierścienia aromatycznego w cząsteczkach aminokwasów i białek.
Odmierzyć do jednej probówki niewielką ilość glicyny, do drugiej tyrozyny lub tryptofanu, a do trzeciej roztworu białka kurzego. Do każdej dodać po ok. 1 ml stęż. HNO3 (ostrożnie!). Wymieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej do wystąpienia zabarwienia w dwóch probówkach. Po ochłodzeniu dodać ostrożnie małymi porcjami 30% NaOH.
Pod wpływem stężonego kwasu azotowego aminokwasy aromatyczne dają nitrowe pochodne o barwie żółtej, przechodzącej po zalkalizowaniu roztworu na pomarańczową.
Reakcja z octanem ołowiu - wykrywanie aminokwasów i białek zawierających siarkę.
Odmierzyć do jednej probówki ok.1 ml cysteiny do drugiej białka kurzego. Do każdej dodać niewielką ilość NaOH i octanu ołowiu. Ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 3-5 minut.
Aminokwasy i białka zawierające grupy hydrosulfidowe (-SH) można wykryć dodając do nich NaOH a następnie soli ołowiu. W środowisku alkalicznym z grupy -SH cysteiny odszczepia się siarka, która przechodzi do roztworu w formie jonów S2-, tworzących z jonami ołowiu nierozpuszczalny czarny siarczek ołowiu (II) - PbS↓.
Reakcja z kwasem azotowym III (van Slyke'a) - deaminacja aminokwasów.
W probówce zmieszać ok.1 ml 10% r-ru NaNO2 z 2 ml 0,5 M glicyny i dodać 1 ml stężonego kwasu octowego. Z probówki wydzielają się bezbarwne i bezwonne pęcherzyki azotu.
Wolne -aminokwasy w reakcji z kwasem azotowym (III) ulegają deaminacji i uwalniają azot, przechodząc w odpowiednie -hydroksykwasy
Reakcja biuretowa (Piotrowskiego) - wykrywanie wiązań peptydowych (odróżnianie białek od wolnych aminokwasów)
Do jednej probówki wlać ok. 2 ml r-ru białka kurzego lub żelatyny, do drugiej glicyny. Dodać do obu niewielką ilość 10% NaOH i parę kropli odczynnika biuretowego (Cu2+,OH-). W probówce z białkiem pojawia się barwa fioletowa.
Reakcja biuretowa jest charakterystyczna dla wiązań peptydowych, występujących w cząsteczkach białek i peptydów. Z ugrupowaniami tego typu jony miedzi Cu2+ w środowisku zasadowym tworzą połączenie kompleksowe o barwie fiołkowej.
Koagulacja cieplna białka.
Odmierzyć do probówki ok.1 ml r-ru białka kurzego i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej.
Wytrącanie białka solami metali ciężkich.
Odmierzyć do probówki ok.1 ml białka kurzego lub żelatyny i dodawać roztwór Pb(NO3)2 lub FeCl3.
Wytrącanie białka kwasem.
Odmierzyć do probówki ok.1 ml białka kurzego lub żelatyny i dodać kwasu trichlorooctowego.
Wytrącanie białek przez odwodnienie.
Przygotować 3 probówki z niewielką ilością białka kurzego. Do pierwszej dodać 96% etanolu, do drugiej acetonu, a do trzeciej chloroformu. Wstrząsnąć i odnotować zaobserwowane zmiany.
Ćw.6-9. Denaturacja to przemiana związana z nieodwracalnym zniszczeniem wtórnej struktury białka. Zachowane zostają mocne wiązania peptydowe, natomiast zniszczeniu ulegają słabe wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe. Denaturacja występuje wskutek podwyższonej temperatury, mocnych kwasów i zasad, soli metali ciężkich, rozpuszczalników organicznych (alkohol, aceton, chloroform).W wyniku denaturacji obniża się najczęściej rozpuszczalność białka i wypada ono z roztworu w postaci osadu.
10. Wysalanie białek
Do probówki z niewielką ilością białka kurzego lub żelatyny dodać nasyconego roztworu (NH4)2SO4. Zaobserwować zmiany. Następnie tryskawką dodać wody i energicznie wstrząsać do rozpuszczenia osadu
W odróżnieniu od denaturacji wysalanie jest procesem odwracalnej koagulacji białek. Zachodzi ono pod wpływem łatwo rozpuszczalnych soli, których jony „odbierają” cząsteczki wody otaczające cząstki białka. Cząsteczki białka, pozbawione „płaszcza wodnego” zlepiają się w większe agregaty i ulegają wytraceniu. Po dodaniu wody osad rozpuszcza się. Proces ten nazywamy peptyzacją. Wysalanie jest często stosowaną metodą wydzielania białek.
11. Wykrywanie składnika cukrowego w białkach złożonych
Do probówki wlać niewielką ilość stężonego roztworu białka kurzego, dodać odczynnika Molisha lub roztworu tymolu i po ściance probówki niewielką ilość stężonego H2SO4. Ogrzewać na łaźni wodnej. Obserwować zmiany.
Obecny w glikoproteidach składnik cukrowy powoduje powstanie charakterystycznego fioletowego pierścienia, w przypadku tymolu - różowego.