Barwienie proste (barwnikiem zasadowym, pozytywne)Utrwalony preparat zalewamy fioletem krystalicznym/błękitem metylenowymPo kilku minutach spłukujemy dokładnie barwnik wodą, osuszamy bibułąwętrze komórki wybarwia się na fioletowo/niebiesko, endospory i tło pozostają niewybar.Barwienie Grama (E.coli/Staphylococcus epidermidis; Ps.fluorescens/B.megaterium.Utrwalony preparat wymieszanych hodowli nocnych bakterii G- i G+ zalewamy fioletem krystalicznym.Płuczemy szkiełko płynem Lugola i zalewamy nim (bejca)Płuczemy wodą, osuszamy bibułą i zalewamy na 30sek 95% metanolem.Płuczemy wodą, dobarwiamy safraniną przez kilka minut.Płuczemy wodą, osuszamyZasada działania:1.oparta na budowie: G- błona zewnętrzna, błona cytoplazmatyczna, cienka mureina (słabo blokuje); G+ bardzo gruba mureina, błona cytoplazmatyczna2.fiolet krystaliczny barwi bakterie G+ i G-3.płyn Lugola (bejca) wypiera chlor z fioletu i zastępuje go jodem - tworzą się agregaty fioletu w obu typach komórek4.etanol (odbarwiacz) niszczy błony bakterii G- i wymywa z nich fiolet (mało mureiny, nie zatrzymuje)
5.safranina dobarwia wszystkie komórki na czerwono - w G+ nic się nie zmienia (fioletowe), G- ostatecznie czerwone. Barwienie ściany komórkowej (B.megaterium)Utrwalony alkoholem metylowym preparat nocnej hodowli przepłukać bejcą - roztworem taniny i zalać na pół godziny.Płuczemy wodą.Barwimy roztworem safraniny (!barwi się warstwa taniny, nie wnika do ściany)*Obrys komórki czerwony.Barwienie endospor (B.megaterium, B.subtilis)Utrwalony preparat barwić zielenią malachitową podgrzewając go co jakiś czasSpłukać wodą, dobarwić safraninąSpłukać wodą i osuszyćPrzetrwalniki wybarwione na zielono, wnętrze komórki na różowoBarwienie otoczek (Micrococcus luteus, B.megaterium)Na szkiełko nanosimy kroplę płynnej hodowli lub robimy zawiesinę z hodowli stałej (nanosimy kroplę wody na szkiełko i mieszamy z pobranym z szalki materiałem)Dodajemy kroplę tuszu i mieszamy z hodowląDrugim szkiełkiem rozprowadzamy zawiesinę po powierzchni do uzyskania jednorodnej ciemnej warstwySuszymy szkiełko na powietrzu i utrwalamy w płomieniuBarwimy safraniną.Spłukujemy wodą, osuszamy bibułą*Tło ciemne, wnętrze komórki na różowo, otoczki niewybarwione. Jak w hodowli mieszanej E. coli (lub Staphylococus aureus), B. megaterium i Micrococcus luteus rozróżnić każdy z gatunków? (Najpierw trzeba otrzymać czyste kultury.)Krok pierwszy: rozcieńczenie hodowliKrok drugi: posiew wg. jednej z opcjiA wspólne podłoże pełne [oceniamy potem morfologię kolonii]B trzy odpowiednio dobrane podłoża selekcyjne [każde podłoże specyficzne dla danego gatunku]Cwspólne podłoże różnicujące [jak w 'a' ale nie oceniamy morfologii, lecz np. kolor metabolitu]Krok trzeci: posiew redukcyjny i otrzymanie czystych kulturKrok czwarty: z czystych kultur rozróżniamy stosując kolejno obserwację kolonii, barwienie proste iobserwację morfologii komórek pod immersją, barwienie Grama.Pożywka zanieczyszczona laseczkami. Jak odzyskać czystą kulturę pałeczki?1. rozcieńczenie hodowli2. posiew na stałe podłoże pełne [tym razem lepiej się upewnić, czy jest sterylne, bo jeszcze jakieśmaczugowce się pojawią i co wtedy?]3.wybrane kolonie posiać redukcyjnie na osobne płytki z podłożem pełnym4.dla pewności i ustalenia gdzie-co-jest materiał z każdej z płytek wybarwić metodą Grama, bo pałeczki są Gram-ujemne a laseczki Gram-dodatnie Hodowla - podłoże (stałe, półpłynne lub płynne) z namnożonymi mikroorganizmami; może być jednogatunkowa lub mieszana Kolonia - to widoczne gołym okiem skupisko bakterii na podłożu stałym o charakterystycznej dla gatunku morfologii; na ogół powstaje w wyniku podziału pojedynczej komórkiCzysta kultura - hodowla powstała w wyniku podziału pojedynczej, wyizolowanej komórki bakteryjnejKlon - czysta kultura i poch od niej populacje potomneSzczep - klony tego samego gatunku, ale izolowane z niezależnych od siebie czystych kulturRUCHpęcherzyki cytoplazmatyczne otoczone warstwą polipeptydową; są przepuszczalne dla gazów, zmieniają położenie w słupie wody góra-doł;rzęski - różna ilość, mogą wielokrotnie przekraczać dł. Komórki; różna organizacja ciałka bazalnego u bakterii G+ i G-BADANIE RUCHU1.preparat kropli wiszącej - przyżyciowo na szkiełku z łezką2.wybarwianie rzęsek - pogrubienie bejcą i barwienie, oglądane w mikroskopie świetlnym3.mikroskop elektronowy4.metoda hodowlana - zaszczepienie podłoża półpłynnego igłą5.m.hodowlana - na agarze półpłynnym lub płytce wilgotnej - obserwujemy wzrost pierścieniowy, bakterie tworzą długie komórki, które migrują, a po pokonaniu pewnej odległości znowu przechodzą podział (tu - małe pałeczki) 6.m.hodowlana - obserwacja taksjiBejce - substancje ułatwiające barwienie przez wzmocnienie działania barwników lub pokrycie barwionej struktury warstwą przyjmującą barwnik; np. Tanina, płyn Lugola
TYPY HODOWLI PŁYNNYCH.OKRESOWA (stacjonarna) - organizmy wysiane na podłoże rozwijają się aż do wykorzystania substancji odżywczych i/lub zatrucia się metabolitamiFAZY: - lag,adaptacyjna, zależy od inokulum (gatunku, liczby); można ją skrócić poprzez posiew hodowli nocnej bez zmiany typu podłoża -młodość fizjologiczna-wzrostu wykładniczego - równomierny wzrost (komórki dzielą się równomiernie, co określony czas) - zmniejszenie wielkości komórek, hodowla zbalansowana; zależy od inkubacji, podłoża- stacjonarna - charakteryzuje go stała liczba komórek i brak podziałów-zamieranie hodowliCIĄGŁA - hodowla ze stałą fazą wzrostu logarytmicznego, kontrolowane warunki - odprowadzanie metabolitów, uzupełnianie podłoża; jej celem jest osiągnięcie stanu równowagi fizjologicznej i badanie reakcji na zmianę warunków Charakterystyczne w tej fazie jest zmniejszenie się rozmiarów bakterii w porównaniu z faząpoprzednią. Przez cały okres logarytmiczny wielkość komórek utrzymuje się mniej więcej na tymsamym poziomie, nie zmienia się też ich wiek osobniczy i częstość podziału. Faza logarytmiczna jestgłównym okresem wzrostu hodowli. Jej długość zależy od czynników środowiskowych i od cechdanej bakterii. Skrócić je mogą: brak pokarmu, nadmierne nagromadzenie toksycznych metabolitów, nieodpowiednie pH, rH. Na ogół w podłożach ubogich, w których bakteria musi syntetyzowaćwszystkie składniki, szybkość wzrostu jest mniejsza, a faza logarytmiczna dłuższa.SYNCHRONIZOWANA - zakładana z komórek w tym samym stadium cyklu życiowego, charakteryzowanego na postawie wielkości lub przez hamowanie wzrostu; jej celem jest badanie aktywności i procesów zachodzących w komórce między podziałami
KSZTAŁTY BAKTERIIPODSTAWOWE 1. kula (coccus, ziarniak) - ø0.8μm, kuliste formy patogenne tworzące układy (wynik nierozejścia komórek po podziale), zawierają otoczki śluzowe, G+ i G-*dwoinki - jedyna G- Diplococcus pneumoniae*czworaczki*paciorkowce - np. Streptococcus faecalis*pakietowce - np.Micrococcus luteus*grona - np. Staphylococcus epidermidis 2.cylindryczne*pałeczki (bacterium) - krótsze, zaokrąglone końce, zwykle tlenowce, zwykle nie tworzą układów,mniejsze od laseczek,brak endospor G- np. E. coli, Ps. fluorescens, Proteus vulgaris;*laseczki (bacillus) - tępe końce, dłuższe, tworzą łańcuchy i endospory, G+, tlenowce i bezwzględne beztlenowce (np. Clostridium sp.); np. Bacillus megaterium, B. subtilis*krętki, śrubowce, promieniowce, przecinkowce. OTOCZKIzewnątrzkomórkowe subst. Śluzowe (15% wody);związane z komórką (otoczka) lub nie (śluz); wielocukrowe (np. Streptococcus pneumonium), polipeptydowe (np. B. Antracis) albo glikoproteinowe (np. Neisseria meningiditis);można je uwidocznić, nie wybarwić;rola:ochrona przed wysychaniem i przed fagocytozą (patogeny) oraz bakteriofagami;wpływ na dyfuzję cząstek - utrudnienie napływu antybiotykom, Me ciężkim;adhezja do podłoży stałych (np. Streptococcus mutans)ŚCIANAuwidaczniana przez barwienie specjalistyczne safraniną nocnej hodowli po delikatnym utrwaleniu i zabejcowaniu ENDOSPORY;ciepłooporne, odporne na czynniki chemiczne i wysychanie - mają grube, wielowarstwowe osłony;dlatego uwidacznia je b.złozone barwienie pozytywne zielenią malachitową na gorąco w STAREJ hodowli;w barwieniu prostym są elementem niewybarwionym;wytwarzane m.in. przez Bacillus i Clostridium;zawsze po jednym na komórkę - nie są sposobem rozmnażania, tylko przetrwania;różne położenie i rozmiar - może wpływać na kształt komórki, silnie załamują światło;sporulacja: po koniec logarytmicznej fazy wzrostuodwodnienie, synteza kw. Dipikolinowego (który nie występuje w komórce wegetatywnej; 5-10% suchej masy), synteza specjalistycznych białek związanych z DNA chroniących przed uszkodzeniami, wielokrotne obłonienieMET. WYKRYW. ENDOSPOR -barwienie złożone zielenią malachitową na gorąco- mikroskop kontrastowo-fazowy (przyżyciowo, silnie załamują światło)-próba hodowlana - ogrzewanie hodowli w temp.70-80C przez 10min, następnie płukanie etanolem przez 45min w temp.20C i inkubacja - jeśli zaobserwujemy wzrost, prawdopodobnie były endosporyKiełkowanie - aktywacja w odpowiedzi na bodziec (np.temp), utrata oslon i kw.dipikolinowego - wzrost protoplastu, pobieranie wody, przekształcenie w kom wegetatywną
Odbarwianie - pozwala uwidocznić bakterie lub inne szczegóły budowy przez barwienie innych bakterii lub struktur; np. Alkohol etylowy 90%, stężone kwasyUtrwalenie preparatu - ma na celu denaturację struktur i umożliwienie wniknięcia barwnika przez odsłonięcie wolnych grup, co zwiększa powinowactwo do barwnika, a także przyczepia martwe bakterie do szkiełka oraz minimalizuje zagrożenie przy pracy z patogenem; np. W płomieniu palnika, alkoholem metylowym (przy barwieniu specyficznym ściany), formaldehydemEscherichia coli (pałeczka okrężnicy)(nazwa rodzajowa pochodzi od nazwiska Teodora Eschericha, który wyizolował tę bakterię; gr. colon= jelito grube/okrężnica - miejsce występowania tej bakterii)Pałeczka gramujemna należąca do rodziny Enterobacteriaceae (pałeczki jelitowe). Względnybeztlenowiec. Chemoorganotrof, prototrof. Temp. optymalna 37°C. Występuje w jelicie grubymczłowieka i licznych zwierząt Szeroko rozpowszechniona w środowisku życia człowieka. Jest tobakteria najlepiej poznana pod względem fizjologicznym i genetycznym.
pierwotne skrzela małżów i jak są zbudowane
w jakich środowiskach żyją ślimaki
różnice pomiędzy muszlami nautilusa i ślimaków
barwniki oddechowe mollusca
w co przekształciła się noga głowonogów