BUDOWA DNA i RNA

DNA: polimer dwuniciowy podstawą budowy jest nukleotyd zbudowany z reszty kwasu fosforowego, cukru z grupy pentoz 2-deoksyrybozy i jednej z 4 zasad azotowych: tyminy (T), cytozyny (C), adeniny (A) i guaniny (G).
RNA: jednoniciowynukleotyd jest zbudowany z reszty kwasu fosforowego, cukru rybozy i zasad: adeniny, cytozyny, guaniny i uracylu. Wyróznia się kilka rodzajów RNA: snRNA, hnRNA, mRNA, tRNA, rRNA

POZIOMY UPAKOWANIA DNA w chromosomach

Upakowanie dna rozpatruje się w kilku poziomach: 1. Nukleosomy(nukleonom to jednostka w ktorej skład wchodzą: białkowy rdzeń, nic dna oplatająca dyskowaty oktamer, białko spinające nic dna od strony zewnętrznej)2.soleniody(łancuchy chromosomów zorganizowane są w struktury przypominające sprężynę w której zwoje to koralikowate łańcuchy nukleosomów).

REPLIKACJA-endoenergetyczny proces, w którym podwójna nić DNA (podwójna helisa) ulega skopiowaniu. Replikacja jest semikonserwatywna (półzachowawcza) - w każdej z dwóch uzyskanych podwójnych nici DNA będzie jedna nić macierzysta i jedna nowa. Proces ten zachodzi podczas interfazy, Polimeraza DNA działa jedynie w kierunku od końca 3' do końca 5' (czyli syntetyzuje nową nić w kierunku od 5' do 3'). Z tego powodu jedna z nici jest syntezowana w sposób ciągły. Substratami tego procesu są: matryca DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów (dNTP), ATP - energia dla helikaz.

TRANSKRYPCJA-proces syntezy RNA na matrycy DNA przez różne polimerazy RNA, czyli przepisywanie informacji zawartej w DNA na RNA. Matryca jest odczytywana w kierunku 3' → 5', a nowa cząsteczka RNA powstaje w kierunku 5' → 3'. Podczas transkrypcji polimeraza RNA buduje cząsteczkę RNA łącząc zgodnie z zasadą komplementarności pojedyncze rybonukleotydy według kodu matrycowej nici DNA.

TRANSLACJA-proces syntezy łańcucha polipeptydowego białek na matrycy mRNA. W jego wyniku dochodzi do ostatecznego przetłumaczenia informacji genetycznej zawartej pierwotnie w kodzie genetycznym DNA na konkretną strukturę białka, zależną od uszeregowania aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Powstawanie łańcucha polipeptydowego sterowane jest przez sekwencję mRNA. Translacja odbywa się w cytoplazmie lub na błonach szorstkiej siateczki wewnątrzplazmatycznej. Proces ten jest katalizowany przez rybosom obejmujący podjednostkami przesuwającą się nić mRNA. Translacja składa się z czterech faz:

1.Aktywacji-właściwy aminokwas jest dołączany do właściwego tRNA za pomocą wiązania estrowego, powstałego przez reakcję grupy karboksylowej aminokwasu i grupy OH

2.Inicjacji-ma miejsce, kiedy mała podjednostka rybosomu przyłącza się do końca 5' mRNA. Do małej podjednostki przyłącza się duża podjednostka rybosomy

3.Elongacji-ma miejsce, kiedy następny aminoacylo-tRNA przyłącza się do rybosomu w miejscu A. Następnie proces translacji zachodzi na zasadzie komplementarności kodonu mRNA z antykodonem na tRNA.

4.Terminacji-Łańcuch polipeptydowy zostaje uwolniony do cytoplazmy, tRNA zostaje oddzielone od mRNA, a rybosom rozpada się na podjednostki, które mogą zostać ponownie wykorzystane do inicjacji translacji kolejnego mRNA

WYMOGI jakie musi spełniać laboratorium in vitro

Minimalne wymagania lokalowe dla laboratorium in vitro, to dwa pomieszczenia:

1.Niesterylne (dla roślin świeżo zebranych, kultur zakażonych, szkła laboratoryjnego przeznaczonego do mycia itp.)

2.Sterylne (dla pożywek, pobranych fragmentów tkanek roślinnych itp.)Wszystkie pomieszczenia muszą być utrzymywane w czystości, gdyż kultury in vitrosą bardzo podatne na zakażenia. Ze względu na zróżnicowane wymagania co do warunków wzrostu różnych kultur wskazane jest wyposażenie pomieszczenia wzrostowego w klimatyzator, regulację natężenia oświetlenia i zegar sterujący zmianami warunków.

MATERIAŁ ROSLINNY DO KULTUR IN VITRO Do kultur in vitro-może być pobierany z pola, szklarni, fitotronów (pomieszczeń lub szaf, w których można precyzyjnie programować w czasie: temperaturę, oświetlenie i wilgotność)

Rośliny muszą być utrzymane w pełnej zdrowotności, pozbawione części zaschniętych, bez zanieczyszczeń. Przed pobraniem eksplantantów rośliny wyjaławia się (alkohol, podchloryn sodu itp.)

RODZAJE KULTUR in vitro

1.kultury kalusa( Kalus to stale dzielaca się, bezładna histologicznie tkanka, mająca wygląd bezpostaciowej masy. Pod względem genetycznym jest niestabilna, często mogą występować zmiany liczby i struktury chromosomów. Kultury są wykorzystywane w badaniach nad różnicowaniem się komórek i morfogenezą. Mogą stanowić materiał wyjściowy do uzyskania zawiesin komórkowych i pojedynczych komórek. Stosowane również do rozmnażania wielu roślin ozdobnych, dzięki zdolności regeneracji całych roślin z kalusa lub wytwarzania zarodków somatycznych.)
2. Kultury zawiesin komórkowych.(Materiałem wyjściowym jest kalus, zmacerowane zarodki lub tkanka miękiszowa. Hodowle prowadzi się na płynnych pożywkach, na wytrząsarkach. Mają zastosowanie w badaniach mutacyjno- -selekcyjnych na poziomie komórkowym.)

  3. Kultury protoplastów(Protoplasty to komórki roślinne pozbawione enzymatycznie lub mechanicznie ściany komórkowej. Uzyskuje się je najczęściej z komórek miękiszowych liści lub z kalusa. Mają zastosowanie w pracach nad tworzeniem mieszańców somatycznych pomiędzy różnymi gatunkami).
  4. Kultury pylników i mikrospor (Służą do indukowania procesu androgenezy i uzyskania roślin haploidalnych).
5. Kultury zarodków.(Wykorzystywane do przerywania spoczynku nasion i uzyskiwania roślin z nasion niezdolnych w zwykłych warunkach do kiełkowania. Mogą zapewnić rozwój zarodków mieszańcowych. Służą również do oceny żywotności nasion głównie gatunków drzew iglastych, liściastych i owocowych. Stosuje się je także do badań nad przebiegiem procesów wzrostu i rozwoju oraz wpływem światła, temperatury, substancji mutagennych i regulatorów wzrostu na zarodki.)
6. Kultury merystemów( Stosowane do uwalniania roślin od patogenów. Jako metody uzupełniające stosowane są chemioterapia i termoterapia.)
7. Kultury organów roślinnych.(Stosowane do mikrorozmnażania. Wykorzystują zdolność roślin do tworzenia organów przybyszowych lub regeneracji z pierwotnej tkanki merystematycznej z eksplantatu. Do kultur organów roślinnych wykorzystuje się:
    - pąki wierzchołkowe,
    - wycinki węzłów z pąkiem bocznym,
    - fragmenty liści,
    - ogonki liściowe,
    - kwiatostany,
    - fragmenty cebul, bulw lub kłączy.

METODY ELIMINOWANIA WIRUSÓW na potrzeby kultur in vitro

1.Zwalczanie wektorów wirusów (klasyczna)

2.Chemoterapia in vitro(np. rybawiryna -przeciwdziała replikacji i degraduje wirusy nie działając fitotoksycznie na tkanki roślin; cytokininy)

3.Termoterapia in vivoi izolowanie wierzchołków pędów z roślin po termoterapii (podwyższona temperatura do ok. 360Cprowadzi do eliminacji wirusów, szczególnie w merystemach)

4.Termoterapia in vitro(podwyższona temp. ok 360C w kulturach merystemów lub kalusa)

5.Krioterapia (zamrożenie tkanki w ciekłym azocie do minus 1960C)

6.Kultura in vitro izolowanych merystemów (sama w sobie nie zawsze skuteczna

FUZJA PROTOPLASTÓW(Celem przeprowadzania fuzji protoplastów, czy to roślinnych czy zwierzęcych, jest chęć uzyskania nowych kombinacji jądrowych, cytoplazmatycznych oraz jądrowo-cytoplazmatycznych.
A.Chemiczna fuzja protoplastów
W metodzie tej wykorzystuje się glikol polietylenowy, który w obecności jonów Ca stymuluje fuzję. Wykorzystywany jest glikol polietylenowy o masie do 8 kDA. Stosuje się również modyfikację tej metody z zastosowaniem DMSO.
B. Elektrofuzja
Protoplasty układają się wzdłuż pola elektrycznego w wyniku przepływu prądu elektrycznego o częstotliwości 0,5-4 MHz oraz natężeniu do 500 V/cm. Następnie krótki impuls elektryczny prądu stałego powoduje łączenie się sąsiadujących ze sobą protoplastów(elektroporacja błon protoplastów).

MIESZAŃCE SOMATYCZNE komórki i zregenerowane z nich rośliny otrzymane w wyniku fuzji protoplastów komórek somatycznych.Ich tworzenie z wykorzystaniem kultur in vitroprowadzi do powstawania nowych kombinacji jądrowych, jądrowo-cytoplazmatycznych i cytoplazmatycznych (często niemożliwych do uzyskania metodami tradycyjnymi ze względu na bariery krzyż owalności Etapy powstawania mieszańców somatycznych:

1.Izolacja i zmieszanie ze sobą protoplastów dwóch komponentów przeznaczonych do fuzji (protoplasty te powinny mieć podobną wielkość i być całkowicie pozbawione ścian komórkowych)

2.Użycie czynników stymulujących fuzję (sprzyjających kontaktowi błon komórkowych, ich częściowej degradacji i następnie odbudowaniu -połączenie błon komórkowych w jedną wspólną otoczkę)

3.Identyfikacja i selekcja komórek mieszańcowych

4.Kultura komórek mieszańcowych i regeneracja roślin

5.Potwierdzenie mieszańcowego charakteru uzyskanych roślin.

ZASTOSOWANIE KULTUR in vitro 1.Rozmnażanie wegetatywne cennych materiałów (mikrorozmnażanie):Pozwala uzyskiwać potomstwo form o niepowtarzalnych cechach, które nie mogłyby zostać zachowane przy rozmnażaniu generatywnym (zostałyby utracone na skutek rekombinacji genetycznej) Stosowane np. w hodowli roślin ozdobnych 2. Otrzymywanie roślin wolnych od patogenów- Pozwala na otrzymanie roślin wolnych od wirusów. Rośliny uzyskuje się przez mikrorozmnażanie z bardzo małych stożków wzrostu lub stożków wzrostu roślin poddanych działaniu wysokiej temperatury, krioterapii, chemioterapii. 3. Selekcja w kulturach in vitro-możliwa do przeprowadzenia pod warunkiem istnienia korelacji między reakcją komórek lub tkanek roślinnych w kulturze in vitro, a reakcją otrzymanej z niej rośliny w warunkach uprawy (w polu lub szklarni)

Zastosowanie -np. w hodowli odpornościowej przy zastosowaniu metabolitów patogena (toksyn) jako czynnika selekcyjnego 4. Wykorzystanie zmienności somaklonalnej: Zmienność pojawiająca się w kulturach kallusowych może być dziedziczna. Zasada wykorzystania zmienności somaklonalnej jest identyczna z indukowaną mutaganezą, ale jak dotąd brak pozytywnych przykładów jej wykorzystania w praktycznej hodowli 5. Kultury zarodków F1mieszańców oddalonych: Zarodek mieszańcowy w odpowiednim stadium rozwoju przenoszony jest na pożywkę pozwalającą na jego dalszy rozwój. Poprawia skuteczność krzyżowań oddalonych, gdy występuje niezgodność między zarodkiem i bielmem rośliny matecznej lub niedorozwój bielma (przy nieprawidłowym zapłodnieniu komórki centralnej) 6. Kultury protoplastów Protoplast -komórka roślinna pozbawiona ściany komórkowej (po wytrawieniu jej enzymami). Dzielące się w kulturze protoplasty mogą ulegać fuzji (łączyć się) nawet jeśli są to komórki różne gatunkowo. Kultury protoplastów wykorzystywane są do tworzenia mieszańców oddalonych, u których bariera krzyżowalności jest trudna (lub niemożliwa) do pokonania poprzez tradycyjne krzyżowania międzygatunkowe. 7. Otrzymywanie podwojonych haploidów Prace prowadzone od 1964 roku. Rośliny haploidalne uzyskano dla ponad 200 gatunków roślin Uzyskiwanie form homozygotycznych (linii DH -genetycznych odpowiedników linii czystych):

a.Krzyżowania międzygatunkowe: metoda bulbosowa u jęczmienia (1970), metoda kukurydziana u pszenicy i pszenżyta

b.Kultury pylników lub mikrospor (androgeneza)

c.Kultury niezapłodnionych zalążków (gynogeneza)8. Kolekcjonowanie materiałów genetycznych (banki genów, np. dla winorośli) -ochrona zasobów genowych

GMO- Organizmy Modyfikowane Genetycznie czyli organizmy transgeniczne: rośliny, zwierzęta, mikroorganizmy, które zawierają w swych organizmach włączony do genomu gen z obcego gatunku, które zostały otrzymane przez wprowadzenie tego genu metodami inżynierii genetycznej.

ETAPY TWORZENIA GMO

-wyizolowanie genu

-stworzenie tzw. konstruktu zawierającego gen, promotor (przeważnie konstytutywny), wzgl. połączenie z DNA wektora

-transformacja (wprowadzanie DNA do genomu biorcy)

-selekcja

Izolowanie i charakterystyka genów:

Etap niezbędny do otrzymania organizmów transgenicznych realizowany w ramach działań z zakresu genetyki molekularnej.

Otrzymane geny mogą być następnie szczegółowo analizowane (pod względem budowy i funkcjonowania), a wiedza ta może być wykorzystana w praktyce (hodowla, przemysł chemiczny, farmaceutyczny itd.) lub też można je wykorzystać do tworzenia nowych konstrukcji genowych

Podstawą do izolacji genu jest wiedza o nim, a w szczególności cztery następujące charakterystyki:

-sekwencja (określona struktura pierwszorzędowa)

-dokładna lokalizacja genu w genomie

-rodzaj kodowanego RNA i wzór jego ekspresji

-funkcja genu

Klonowanie funkcjonalne (izolacja funkcjonalna):Zakłada się analogię mechanizmów kontroli podobnych cech lub procesów w różnych organizmach (nawet odległych taksonomicznie).Podstawą teoretyczną do klonowania genu jest wiedza na temat jego budowy (lub budowy produktu białkowego danego genu) otrzymana wcześniej przy badaniach nad innymi gatunkami.Poszukiwane są geny o podobnej sekwencji lub kodujące białka o podobnej budowie.

Klonowanie pozycyjne (izolacja pozycyjna):Podstawą do identyfikacji konkretnego genu jest precyzyjne określenie położenia tego genu w genomie, czyli konstruowanie map genetycznych o wysokiej gęstości oraz (na ich podstawie) map fizycznych (map, na których pozycje genów lub markerów określane są w odległościach fizycznych, głównie w nukleotydach)Wytypowane sekwencje będące hipotetycznymi genami odpowiedzialnymi za daną cechę są następnie testowane pod względem ich funkcjonalności (np. poprzez wprowadzenie metodami inżynierii genetycznej danej sekwencji do określonych roślin i sprawdzenie, czy prowadzi to do oczekiwanej zmiany fenotypu)

RODZAJE TRANSFORMACJI :

1. Transformacja wektorowa:

-plazmidy bakterii korzeniowych, które są wprowadzane do komórek roślinnych w czasie infekcji i zostają włączone do materiału genetycznego komórek gospodarza (rośliny) -metoda skuteczna głównie przy transformacji roślin dwuliściennych. Efektem wprowadzenia plazmidu do komórek korzenia jest powstawanie charakterystycznych narośli. Geny przeznaczone do transformacji wprowadza się w miejsce oryginalnych bakteryjnych genów plazmidu.

-genomy wirusów -wprowadza się geny w miejsce materiału genetycznego wirusa pozostawiając tylko tę część jego materiału genetycznego (DNA lub RNA), która odpowiada za zdolność do infekowania rośliny. Zalety: duża skuteczność; Wady: mała pojemność

2. Transformacja bezpośrednia:-elektroporacja -wytwarzana jest seria impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony komórkowej powodując powstawanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki.-PEG (glikol polietylenowy) jest substancją chemiczną powodującą zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej (podobnie jak przy elektroporacji). Dezorganizacja błony jest odwracalna-mikroinjekcja -wymaga zastosowania mikromanipulatora, dzięki któremu możliwe jest wstrzyknięcie roztworu DNA do wnętrza jądra komórkowego.-wstrzeliwanie -DNA nanosi się na mikroskopijne (0,5-5 mikrometrów) kulki ze złota, platyny lub wolframu. Całość wstrzeliwana jest w tkankę przy użyciu „armatki genowej”. Metoda powoduje szereg uszkodzeń w tkance, ale jest prosta w zastosowaniu.-fuzja liposomów -tworzy się sztuczną podwójną błonę lipidową na roztworze z cząsteczkami DNA. Po wstrząśnięciu błona otacza cząsteczki DNA tworząc banieczki osłaniające materiał genetyczny. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając DNA do środka.

GŁOWNE KIERUNKI PRAC NAD GMO- -odporność na herbicydy (gen bar -acetylotransferaza z Streptomeces hygroscopicus warunkuje odporność buraka cukr. na herbicyd Basta; geny tolerancji na Glyphosate czyli Roundup -wprowadzone do soji, kukurydzy, bawełny, rzepaku, tytoniu)

-poprawa cech użytkowychnp. pomidor (Flavr Savr), melon -zmieniona charakterystyka dojrzewania;oleiste -zmiana składu kwasów tłuszczowych

-odporność na szkodniki (geny bakteryjne np. Bt -Bacillus thuringensis, białko Cry -endotoksyna warunkująca odporność ziemniaka na stonkę; geny baktryjne kodujące chitynazy i glukanazy warunkujące odporność pomidora na fuzariozy

PRZYKŁADY ROSLI MODYFIKOW GENETYCZNIE: Odporność na herbicydy: soja, kukurydzę, rzepak, tytoń, pomidory. Odporność na choroby: tytoń odporny na wirusa mozaiki tytoniowej , ogórek na wirusa mozaiki ogórka, kalafior na wirusa mozaiki kalafiora. Odporność na owady ziemniak odporny na stonkę, inne to bawełna, kapusta, pomidory, oraz przede wszystkim kukurydza Poprawa cech jakościowych pomidor, ryż, pszenica

---