WYKŁAD 7 + „analiza ż.”UP + pdr

OZNACZANIE BIAŁEK

Białka => niezbędne skł. pok., element bud. wszystkich tkanek i wielu zw. czynnych kontrolujących przemiany fizjologiczne

• duża m. cz.

• a-sy podst. jednostka budulcowa (N, C, H, O, S)

Wł. funkcjonalne białek:

2. rozpuszczalność

3. pęcznienie

4. żelowanie

5. pienienie się

6. lepkość

7. zdolność do tworzenia błon, włókien i emulsji

Produkty żywnościowe zawierające zw. białkowe analizowane są różnymi metodami
z uwagi na pochodzenie azotu:

1. mogą zawierać produkty rozpadu białek (peptydy, a-sy)

2. subst. azotowe niebiałkowe (pochodzące z różnych grup chemicznych i zw. organicznych i nieorganicznych)

[EGZ: Wyjaśnij pojęcie mnożnika białkowego

100% rdzeń - cząsteczki]

Wyznaczono, że białka w cząsteczce posiadają azot na poziomie 15-18%. Średnia jego zawartość określono na 16% - 100% białka / 16% azotu = 6,25

6,25 to głównie przyjęty mnożnik białkowy

Różnice w wart. przelicznika białkowego zw. z pochodzeniem białka

Białko

Roślinne zwierzęce

Np. kazeina zawiera 15,68% azotu, stąd 100%/15,68% = 6,38

Produkty białkowe pochodzenia roślinnego mają w swoim składzie mniej białka niż produkty pochodzenia zwierzęcego.

Metody oznaczania N w próbach: bezpośrednie i pośrednie.

1. bezpośrednie opierają się na met. Miareczkowych (met. Soerensena), pomiarach spektrofotometrycznych, refraktometrycznych lub nefelometrycznych oraz met. immunoenzymatycznych (ELISA)

2. pośrednie najczęściej stosowana to met. Kjeldahla. Można je stosowac tylko twedy gdy produkt nie zawiera innych zw. azotowych poza białkowymi (a-sy, zw. amonowe, amidowe, iminowe)

Met. Kjeldahla

Duński chemik Johan Kjeldhal (1849-1900) jako I opracował procedurę oznaczania N
z substancjach organicznych.

W metodzie można oznaczyć zawartość białka ogólnego w różnych rodzajach surowców, produktach w skali makro, półmikro i mikro.

• polega na ilościowym oznaczeniu zaw. N, a następnie przeliczeniu go na białko za pomocą odpowiednich mnożników białkowych.

• W produktach spoż. oznacza się tzw. N ogólny (oprócz N białkowego jest to n pochodzący z produktów odbudowy białek oraz z różnych grup chemicznych innych związków)

Metoda Kjeldahla składa się z 3 etapów:

1. mineralizacja próby (org. W mineralna formę)

2. destylacja amoniaku z parą wodną

3. miareczkowanie (z kw. borowym)

[spalanie białka w atmosferze H2SO4; forma organiczna przechodzi w formę mineralną mineralizacja próby]

[EGZ: W jaki sposób postępujemy przy ozn. białka w nasionach pszenicy ?

- pobrać próbę , uwzględnić masę zbóż]

Aby wyniki były miarodajne należy przygotować próbę do mineralizacji:

• dokładnie zhomogenizować

• wielkość cząst. < 1mm

• usunięcie fosfolipidów i alkaloidów zawierających N poprzez ekstrakcję odpowiednimi rozpuszczalnikami lub gotowaniu z C₂H₅OH.

najlepiej gdy próbka analityczna zawiera 10-100 mg N

aby móc porównać wyniki przeprowadzonych analiz konieczne jest ustalenie wilgotności próbki. Jeśli znana jest wilgotność próbki to do przeliczenia wyników na suchą masę stosujemy równanie:

zawartość białka w przelicz. na sucha masę = (A x 100) / (100 - B)

A - zawartość białka w próbce (%) B - wilgotność próby (%)

Proces mineralizacji - spalanie zw. org. we wrzącym stęż. kw. siakowym, polega na intensywnym utlenianiu białek do CO2 i H2O. N z grup aminowych uwalnia się w postaci NH3 i wiąże się z H2SO4 w wyniku reakcji (A).

1. rozrywanie wiązań azotowych, przekształcanie całego N w jony amonowe

2. w klasycznej metodzie4 1g próbki - 25ml H₂SO₄

3. stosując Kjeldahla 12ml

4. temp. Wrzenia H₂SO₄ 338˚C, temp. Rozkładu 373˚C

5. [używać kwasu w nadmiarze]

Szybkość mineralizacji może być polepszona poprzez dodanie soli i katalizatorów, dodanie H₂SO₄ z nadmiarem z uwagi na:

• reagowanie z próba,

• reagowanie z odczynnikami,

• porównanie w trakcie mineralizacji.

(A) 1. rozkład H2SO4 z uwolnieniem tlenu:

2H2SO4 2SO2 + O2 + 2H2O

2.utlenienie subst. org. z uwolnieniem Co2, H2O, i NH3

COOH

R-CH xCO2↑ + yH2O↑ + zNH3

NH2

3.przechodzenie amoniaku w sól amonową

2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

Dodatkowymi parametrami zużycia H₂SO₄ jest skład próbki, przy czym próbki o dużej zawartości tł., będą zużywały więcej kwasu niż te o dużej zawartości białka lub węglowodanów.

Dodatek soli do mineralizacji próby

- podnosi temp. Wrzenia H₂SO₄

Głównie K₂SO₄, Na₂SO₄ lub ich mieszaniny

- Stosowane inne składniki, tzw. Mieszanina selenowa

90% Na₂SO₄ + 7% Hg₂SO₄ + 1,5% CuSO₄ + 1,5% Se

- Typowy stosunek do stosowanej soli 1,4 do 2

- a w przypadku próbek o dużej zaw. tł. nawet 2,8

Prędkość i skuteczność mineralizacji zależy nie tylko od temperatury w jakiej zachodzi proces ale od odpowiedniego katalizatora

• najlepsze Hg, Cu, Se (stosowane jako katalizatory w ponad 90% mineralizowanych próbach)

• stosowane są również tlenki lub sole HgO, HgSO₄, CuO, CuSO₄

Najczęściej Hg stosowana w aplikacjach jak skóra, pasza, ścieki wodne z uwago na zanieczyszczenia środowiska konieczne jest zbieranie w celu bezpiecznej utylizacji.

Przy zastosowaniu Se - mogą zachodzić starty N, w obecnej chwili mieszanina 1:1 Cu i TiO, np. do badań N w nasionach roślin oleistych

Czynniki utleniający to H₂O₂ - czynniki utleniające przyspieszające rozkład substancji organicznych - ogranicza pienienie próby podczas mineralizacji.

Czynniki redukujące K₂S lub Na₂S - wśród zasad dodane także jako substancje ograniczające ubytki azotu w trakcie mineralizacji.

Czas mineralizacji zależy od:

1. rodz. próby

2. użytej V H2SO4 (d= 1,84g/ml)

3. ilości dodanej soli

4. zastosowanego katalizatora

5. czynnika utleniającego

6. czynnika redukującego

7. temp. mineralizacji

Za koniec przebiegu mineralizacji przyjmuje się klarowanie próby.

Wykonywanie próby odczynnikowej - próby zerowej sprawdzającej czystość wszystkich zastosowanych dodatków przy min. - wyeliminowanie azotu nie należącego do próby właściwej

[EGZ:

Wyjaśnij zastosowanie prób zerowych w analityce żywności

odnośnik anulujący obecność N nie pochodzącego z prób (np. z brudnego odczynnika)]

Aparat Parnasa - Wagnera do destylacji mineralizowanej próby

1. Rozkład H₂SO₄ z uwolnieniem O2

1. 2H₂SO₄ 2SO₂ + O₂ + H₂O

2. utl. subs. org. z uwolnieniem CO₂, H₂O i NH₃ [?]

R xCO₂↑ + yH₂O↑ + zNH₃↑

3. Przechodzenie amoniaku w sól amonową - siarczan amonu

2NH₃ + H₂SO₄ (NH₄)₂SO₄

Destylacja NH₃ z parą wodną - SKRYPT

• zachodzi w podwyższonej temp. w obecności nadmiaru zasady sodowej

(NH₄)₂ + 2NaOH 2NH₃ + 2Na₂SO₄ + 2H₂O

• wydziolny amoniak oddestylowuje się od odbieralnika zawierającego r-r słabego kwasu, np. borowego, wsytępującego w nadmiarze

NH₃ + H₃BO₃ NH₄H₂BO₃

Miareczkowanie związanego amoniaku mianowanym r-rem silnego kwasu np. siarkowego (solnego) ze wskaźnikiem Tashiro

2NH₄H₂BO₃+ H₂SO₄ (NH₄)₂SO₄ + 2H₃BO₃

NH₄H₂BO₃ + HCl NH₄Cl + H₃BO₃

Ilość N w próbie poddanej destylacji obl. Się z liczby cm3 kwasu zużytego do miareczkowania, korzystając z zależności, że 1 cm3 0,05mol/dm3 H2SO4 odpowieada 1,4mg N, którą następnie przelicza się na całość r-ru uzyskanego po mienarlizacji i odnosi się do naważki próby, w której jest wykonane oznaczenie.

Miareczkowanie

ilość wydzielonego N w formie NH3 obl. się z ilości związanego kwasu, wiedząc, że 1 ml kwasu odpowiada 0,01401 gN

% zaw. N ogólnego:

0,01401 (an-bn)*100

%Nog = m

Destylacja próby w aparacie Parnasa - Wagnera

Rekacje:

• oddestylowanie jonu amonowego NH4+ w formę amoniaku przez oddanie NaOH do kolby destylacyjnej i związanie go w kolbie odbieralnika zawierającego roztwór kw. borowego H3BO3 (3%) ze wskaźnikami.

• Wskaźnik Tashiro - 0,05% alkoholowy roztwór czerwieni metylowej, 0,1% wodny roztwór błękitu metylowego w stosunku 10:3 podczas destylacji nastepuje zmiana barwy w odbieralniku z fiołkowej na zieloną

• Wskaźnik Ma i Zuazaga

Otrzymaną wartość azotu przelicza się b. ogólnie w próbie mnożąc przez odpowiedni mnożnik białka uwzględniając jego wartość od rodzaju białka i związanej zawartości w nim azotu. Jest ona również określone jako b. surowe.

Oznaczane formy azotu:

1. N aminowy

2. amidowy

3. mocznikowy

Azot aminowy:

• metoda Sörensena - miareczkowanie

• metoda Van Slyke'a - gazometryczna

• metoda ninhydrynowa - bazuje na reakcji. między grupami aminowymi a ninhydryną

Czynnikiem determinującym wart. odż. białek jest jego skład aminokwasowi:

1. głownie a-sy egzogenne

2. N aminowy jest częścią N zawartego w rozpuszczalnych białkach, występuje
   w zasadach i wielkocząsteczkowych produktach białkowych.

Metoda Sörensena

• Polega na miareczkowym oznaczeniu liczby jonów wodorowych uwolnionych na skutek reakcji formaldehydu z resztami zasadowymi a-ów

• Pod wpływem działania formaldehydu na a-sy tworzy się pochodna typu metyloaminokwasu o charakterze dość mocengo kwasu. Wolną grupę karboksylową tej pochodnej zobojętnia się ługiem

• ozn. N aminowego w próbach

• w skutek reakcji aldehydu mrówkowego (formaldehydu) następuje blokowanie wolnych grup aminowych aminokwasów

• odmiareczkowanie wolnych grup karboksylowych za pomocą ługu (NaOH), przy założeniu, że ilość grup karboksyl. i amin. w badanych roztworach są jednakowe, pozwala na obliczenie zawartości N aminowego.

1ml zużytego do miareczkowania 0,1mNaOH odpowiada zawartości 1,4mg N

Oznaczanie N aminowego

R - CH + C=O R- CH + H2O

R - CH + NaOH R - CH + H2O

Azot aminowy

metoda van Slyke'a - gazometryczna (wolumetryczna)

RNH2 + HNO2 ROH + H2O + N2↑

reak. zachodzi między I rzędowym gr. Aminową a aminową w pozycji α , przebiega
w niskiej temp.

Oznaczenie jest wykonywane w aparacie zaopatrzonym w szklaną biuretę gdzie jest zbierany azot i jego tlenki. Tlenki reagują z KM_nO₄, a jego objętość pozostałego azotu jest mierzona w biurecie. Odczytana wartość jest podzielna przez 2 (przy założeniu, że połowa azotu pochodzi z kwasu).

Met. kolorymetryczna

• z odczynnikiem Folina opiera się na mierzeniu natężenia niebieskiego zabarwienia, które występuje przez działania na białko, w odczyni zasadowym, odczynnikiem Folina- Ciocalteu (odczynniki molibdenianowo- wolframianowy daje niebieskie zabarwienie z Trp i Tyr)

• niektóre barwniki wiążą się ilościowo z białkami, ilość związanego barwnika jest wprost proporcjonalna do ilości białek

• do oznaczania ogólne ilości białek mleka - czerń amidowa (barwnik dwuazowy)

• w środowisku kwaśnym białka jako kationy wielowartościowe wiążą się z czynnymi aninami (grupy suflonowej barwnika, tworząc zw. nierozpuszczalne. Barwnik dodany w nadmiarze nosatej w tym środowisku wytrącony wraz z białkami w ilości proporcjonalnej do ilości czynnych kationów, czyli ogólnej ilości białek)

• czerń nie wiąże się ze zw. azotowymi niebiałkowymi

7

• białko mięsa 6,25

• białko mleka (kazeina) 6,38

• białko jaja kurzego 6,67

• Kukurydza, jęczmień, asola, rzepak 6

• Żyto, pszenica, owies 5,7

• Łubin, arachidy 5,5

COO

NH₂

H

H

N=CH₂

COOH

NH₂

COOH

NH₂

COOH

N=CH₂

COOH

---