2.Pierwotny transkrypt zawiera naprzemian ułożone odcinki intronowe i eksonowe. Po zsyntetyzowaniu czapeczki i poliadenylacji cząsteczki RNA, ale jeszcze przed jej eksportem z jądra do cytoplazmy następuje wycięcie wszystkich intronów oraz połączenie eksonów w jedną całość. Po zakończeniu tych procesów transkrypt staje się funkcjonalną cząsteczką informacyjnego RNA (mRNA), który w tej postaci może opuścić jądro komórkowe.
3. Poliadenylacja - to kolejna modyfikacja eukariotycznego mRNA dotycząca końca 3' cząsteczki. Jest to szereg nukleotydów adeninowych zwany fragmentem poliadenylowym lub poli-A. Po zakończeniu syntezy transkryptu enzymy jądrowe rozpoznają sygnał poliadenylacji przecinając mRNA w tym miejscu i dołączając (do końca 3') od 50 do 250 nukleotydów adeninowych. Zabieg taki ma na celu zabezpieczenie cząsteczki mRNA eukariontów przed degradacją zanim zdąży opuścić jądro komórkowe.
4. Cap (ang. czapeczka) - charakterystyczna dla Eukaryota modyfikacja mRNA. Polega na dołączeniu nietypowego nukleotydu 7-guanylowego do końca 5' łańcucha mRNA przez specyficzne enzymy. Zabezpiecza ona mRNA przed degradacją przez niektóre enzymy przyczyniając się (przynajmniej częściowo) do większej stabilności cząsteczki w komórkach eukariotycznych w porównaniu z komórkami prokariotycznymi, gdzie takie modyfikacje nie mają miejsca a mRNA jest bardzo nietrwały. Przykładowo u eukariontów okres półtrwania mRNA wynosi od 30 minut do 24 godzin natomiast u bakterii tylko 2 minuty. Niezwykłość czapeczki polega również na tym, że jest ona syntetyzowana "od tyłu" tzn. jest dołączana do końca 5' cząsteczki mRNA a nie do końca 3' jak w przypadku syntezy podczas translacji.
Co najmniej "Czapeczka typu 0" czyli 7-metyloguanozyna przyłączona wiązaniem 5'5' pojawia się we wszystkich eukariotycznych mRNA. Powstaje ona w dwóch etapach.
Następnie metylotransferaza guaninowa przenosi resztę metylową na azot w pozycji 7 guaniny.
"Czapeczka typu 1" obejmuje oprócz dołączenia 7-metyloguanozyny obejmuje metylację przy węglu 2' rybozy drugiego (7-metyloguanozyna jest teraz pierwszym) nukleotydu. Jeśli nukleotydem tym jest adenozyna, metylowany może być też azot w pozycji 6 adeniny.
W przypadku "Czapeczki typu 2" metylacja obejmuje również węgiel 2' trzeciego nukleotydu.
Uważa się, że struktura cap ma na celu ochronę mRNA przed nukleazami oraz umożliwia rozpoznawanie mRNA przez rybosomy.
5. Wycinanie intronów
Zanim powstanie ostateczny, dojrzały mRNA mogący ulec translacji, pre-mRNA musi zostać pozbawiony intronów. Proces wycinania tych niekodujących "wtrętów" zwany jest splicingiem i wykorzystuje jeden wspólny dla eliminacji wszystkich intronów aparat enzymatyczny.
Oznacza to, że introny muszą mieć jakieś wspólne elementy rozpoznawane przez wspomniany aparat splicingowy. Z porównywania sekwencji różnych intronów wynika, że łączą je następujące podobieństwa:
na 5' końcu zawierają zawsze kolejno: resztę guaninową i uracylową (5'- GU)
na ich 3' końcu występuje reszta guaninowa poprzedzona resztą adeninową (AG - 3')
wewnątrz zawierają tzw. miejsce rozgałęzienia, w którym kluczową dla splicingu rolę odgrywa nukleotyd adeninowy.
6. Mechanizm splicingu
Wycinanie intronów, jak każdy proces przeprowadzany przez organizm żywy, jest skomplikowane. Wyróżnić w nim można kilka etapów:
1. Rozcięcie cząsteczki pre-mRNA w miejscu splicingowym 5' (tj. na 5' końcu intronu).W wyniku tej reakcji następuje uwolnienie 5' końca fosforanowego egzonu 1.
2. Atak grupy 2'-OH nukleotydu adeninowego ( z miejsca rozgałęzienia ) na 5' grupę fosforanową nukleotydu guaninowego intronu. Jak wiadomo wiązania między kolejnymi nukleotydami to wiązania fosfodiestrowe tworzone między tzw. 5' grupą fosforanową a gru pą hydroksylową ( -OH ) rybozy. Zwykle do wiązania tego angażowana jest grupa 3'-OH, niemniej jednak inne reszty hydroksylowe m.in. 2' posiadają zdolność do interakcji z resztą fosforanową. I tak nukleotyd adeninowy ( z miejsca rozgałęzienia ) mając grup ę 3'-OH wykorzystaną w "normalnym" wiązaniu fosfodiestrowym do interakcji z resztą fosforanową 5' intronu angażuje grupę 2'-OH. Tworzy się tu wiązanie 2'-5' fosfodiestrowe.
3. Atak uwolnionej grupy 3'-OH egzonu 1 na 5' grupę fosforanową egzonu 2 z uwolnieniem intronu mającego postać lassa.
7. Gen neprylizyny (NEP) podlega alternatywnemu splicingowi do 4 rodzajów transkryptów: 1, 1 bis, 2a i 2b. Celem pracy było określenie ilości kopii poszczególnych transkryptów i ich znaczenie w tkankach sromu o różnym stopniu patologii. Materiał do badań był pobierany w trakcie operacji raka sromu (17 próbek), liszaja twardzinowego (9 próbek) oraz zdrowej skóry z marginesu chirurgicznego, w trakcie operacji plastycznych sromu i krocza jako grupa kontrolna (7 próbek). Wszystkie próbki poddano analizie RT-PCR oraz weryfikacji histopatologicznej. W grupie liszaja twardzinowego, dobrze zróżnicowanego raka sromu (G-1) oraz w grupie kontrolnej nie stwierdzono transkryptów 1 bis i 2b. Transkrypty te były obecne jedynie w próbkach umiarkowanie lub słabo zróżnicowanego raka sromu (G-2, G-3). W grupie liszaja twardzinowego nie stwierdzono ekspresji NEP, za wyjątkiem małych ilości transkryptu 2a. Liczba kopii mRNA transkryptów 2a i 2b w grupie umiarkowanie lub słabo zróżnicowanego raka sromu (G-2, G-3) była wyższa znacząco statystycznie aniżeli w grupie dobrze zróżnicowanego raka sromu (G-1). Wydaje się, że transkrypty NEP 2a i 2b biorą udział w progresji raka sromu, niemniej niezbędne są dalsze badania na większych grupach pacjentek.
8. Rozne wycinanie intronow z gotowego transkryptu, czyli alternatywny splicing.
W wyniku laczenia ze soba roznych egzonow moze powstac wiecej niz jeden rodzaj mRNA, niestety mechanizm tego zjawiska nie jest do konca poznany.
9. snRNA - "mały jądrowy" RNA (ang. small nuclear RNA). Nukleotyd występujący w jądrze komórkowym kwas rybonukleinowy pełniący prawdopodobnie funkcję rybozymu w procesie wycinania intronów.
Cząsteczki małego jądrowego RNA (snRNA, ze względu na wysoką zawartość nukleotydów urydynowych nazywane też UsnRNA) pełnią ważną funkcję w procesie wycinania intronów z prekursorów mRNA (pre-mRNA). SnRNA wykazują biologiczną aktywność w kompleksach z białkami. Kompleksy siedmiu białek Sm lub typu Sm (ang. Sm-like, Lsm) i jednej z cząsteczek snRNA tworzą tzw. małe jądrowe rybonukleoproteiny (ang. small nuclear ribonucleoproteins, snRNP).
SnRNP stanowią ważny składnik kompleksu białkowo-rybonukleinowego zaangażowanego w wycinanie intronów - splajsosomu. Ich rola polega na rozpoznawaniu odpowiednich obszarów intronu poprzez tworzenie komplementarnych połączeń RNA-RNA z dwoma obszarami terminalnymi i miejscem rozgałęzienia intronu. Dodatkowo snRNA nadają przestrzenny kształt dwóm centrom aktywnym splajsosomu i prawdopodobnie katalizują dwie następujące po sobie reakcje transestryfikacji zachodzące w trakcie wycinania intronu (Will i Lührman, 2001).
Funkcjonalnie wyróżnia się dwie grupy cząsteczek snRNA. Do pierwszej zalicza się cząsteczki U1, U2, U4, U5 oraz U6 snRNA uczestniczące w wycinaniu przeważającej większości intronów pre-mRNA nazywanych GU-AG (ze względu na obecność charakterystycznych par nukleotydów na końcach 3' i 5') lub intronami typu U2. Do drugiej grupy należą U11, U12, U4atac, U6atac snRNA, które razem z U5 biorą udział w wycinaniu intronów typu U12 (AU-AC) (Tarn i Steitz, 1996).