ĆWICZENIE 4

Hodowla laboratoryjna ścisłych beztlenowców (anaerobów)

- obligatoryjne aeroby, fakultatywne anaeroby, obligatoryjne anaeroby, mikroaerofile

- wymagania w/w bakterii odnośnie potencjału redoks Eh (V, mV) podłoża wzrostowego

- toksyczność O2 dla beztlenowców ścisłych (utrata katalazy, toksyczny wpływ H2O2 powstającego przy redukcji tlenu)

- ścisłe beztlenowe sporotwórcze: Clostridium spp. i Desulfotomaculum spp. znaczenie ekologiczne (saprofity) i zdrowotne (zakażenia i toksynotwórczość), profile ich aktywności biochemicznej

- ściśle beztlenowe bakterie niesporotwórcze

•Desulfovibrio desulfuricans

•pleomorficzne (wielopostaciowe, sprawiające wrażenie hodowli mieszanej) jelitowe Bacteroides fragilis

•Fusobacterium sp.

•Veilonella sp.

- zabiegi laboratoryjne mające na celu zapewnienie ścisłym beztlenowcom optymalnych warunków wzrostowych:

•preparatyka wstępna (użycie subletalnego szoku termicznego - niespecyficzny czynnik pregerminacji) 75°C/ 15-20 min.

UTLENIANIE BIOLOGICZNE

(Utlenianie - odebranie elektronów z cząsteczki substratu z jednoczesnym odebraniem jonów wodoru (jeśli występują), elektrony nie pozostają wolne, potrzebny jest akceptor elektronów, akceptor jest w tym procesie redukowany, akceptor uzyskuje ładunek ujemny i służy jako akceptor jonów wodoruZWIĄZEK UTLENIANY JEST DAWCĄ WODORU, AKCEPTOR WODORU JEST REDUKOWANYENERGIA pochodzi z różnicy pomiędzy ilością energii uwolnionej w reakcji utlenienia, a energią zużytą w odpowiedniej reakcji redukcji)1. Oddychanie tlenowe - końcowym akceptorem wodoru jest tlen cząsteczkowy2. Oddychanie beztlenowe - końcowym akceptorem wodoru jest związek nieorganiczny, a nie tlen (azotan, siarczan, węglan)3. Fermentacja - końcowym akceptorem wodoru jest związek organiczny

ODDYCHANIE TLENOWE:

dawca wodoru + akceptor wodoru =

produkt utleniony + produkt zredukowany + zysk energetyczny

np. glukoza + tlen = dwutlenek węgla + H2O + zysk energetyczny

Metody chemiczne

- dodatek substancji redukujących łatwo utlenialnych POZA PODŁOŻEM, np.

pirogallol lub tiosiarczan sodu w środowisku zasadowym

- dodatek substancji silnie redukujących bezpośrednio DO PODŁOŻA, obniżenie potencjału redoks w podłożu wzrostowym np.1% glukoza, tiosiarczan sodu, opiłki żelaza zredukowane w strumieniu N2, tioglikolan sodowy, cysteina, kwas askorbinowy, glutation,

- stosowanie tzw. gas generating kits

(borowodorek sodu i/lub dwuwęglan sodowy (dla wytwarzania CO2); borowodorek sodu reaguje z wodą, wydziela się H2, wodór wiąże tlen w obecności katalizatora, wskaźnik z błękitem metylenowym - niebieski w atmosferze tlenowej, bezbarwny w atmosferze beztlenowej )

Metody fizyczne

- zastosowanie zasady „regeneracji” podłóż dla beztlenowców - zagotowanie i szybkie schłodzenie (nawarstwianie płynną warstwą parafiny)

- zastosowanie podłóż płynnych z frakcją cząsteczkową dwu-fazowych (tkanka wątrobowa, serca wołowe, zmielone mięso, skrawki marchwi, ziemniaków jako absorbenty tlenu), np. podłoże Wrzoska z wątrobą

- zalewanie posiewu w probówce warstwą agaru (korek agarowy)

• zastosowanie anaerostatów (mechaniczne usuwanie tlenu ze środowiska hodowli i generowanie odpowiedniej atmosfery gazowej: azot, argon, hel, wodór)

Metody biologiczne

- usuwanie tlenu przez wspólną hodowlę ze ścisłymi tlenowcami (metoda Fortnera)

np. beztlenowce sacharolityczne na podłożu z cukrami:

Clostridium acetobutylicum, Clostridium pasteurianum

z tlenowcami: B. subtilis, S. marcescens, Mycoderma cerevisiae

beztlenowce proteolityczne na podłożu z białkami:

Clostridium sporogenes, Clostridium putrefaciens

B. subtilis, E. coli, P. vulgaris

Beztlenowce z gleby (1)

•Clostridium botulinum - ściśle beztlenowe bakterie sporotwórcze występujące jako saprofity glebowe mogą w żywności wytwarzać neurotoksynę letalną, będącą jedną z najsilniejszych w przyrodzie (dla człowieka dawka letalna to kilka nanogramów).

•Toksyna-botulina pojawiawia się w środowisku po autlizie komórki wegetatywnej, głównie po wytworzeniu spor.

•Toksyny są produkowane w zakresie temp. 10-48oC

•Wykorzystywana w medycynie do blokowania połączeń mięśniowo-nerwowych w leczeniu niektórych schorzeń, np.tików nerwowych, napięcia mięśniowego.

• Ze względu na budowę antygenową wytwarzanej toksyny (toksycznego białka) wyróżnia się typy Clostridium botulinum oznaczone literami A-G (typy A,B,E,F i G zagrażają człowiekowi).

• Typ E uznawany jest za typ wodny (wody morskie i śródlądowe) - wzrost wegetatywny Cl. botulinum i toksykogeneza w śniętej rybie i martwych bezkręgowcach powoduje botulizm ptactwa wodnego (Fulica atra) i zagrożenie w hodowli ryb drapieżnych.

Clostridium perfringens (Laseczka zgorzeli gazowej)

Laseczki ściśle beztlenowe pozbawione zdolności ruchu:

-przy zakażeniach rozległych i głębokich zranień (typ A) są czynnikiem etiologicznym zgorzeli gazowej (gangreny)

-przy namnożeniu w żywności przetworzonej termicznie [wzrost inicjowany przez przeżywające endospory (typu A) powodują zatrucia pokarmowe]

-endemicznie rozsiedlony typ C (Nowa Gwinea) wywołuje u ludzi nekrozę jelit (wektorem jest niedopieczona wieprzowina)

-ścisły beztlenowiec sporotwórczy znany z szerokiego występowania w biosferze (sedymenty morskie, ścieki, przewody pokarmowe człowieka i stałocieplnych)

Martwica tkanki mięśniowej wywołana przez Clostridium spp. stanowi rzadkie następstwo urazów.

Rany pourazowe stwarzają najlepsze warunki do namnażania się laseczek zgorzeli gazowej z powodu zaburzenia miejscowego ukrwienia, co powoduje spadek ciśnienia parcjalnego tlenu w tkankach.

6 gatunków Clostridium wytwarza toksyny odpowiedzialne za wystąpienie zgorzeli gazowej.

Nierozpoznana i nieleczona zgorzel gazowa prowadzi do śmierci (70% śmiertelność przed wprowadzeniem leczenia w komorach tlenowych).

Hiperbaryczne komory tlenowe, w których umieszcza się chorego umożliwiają seanse, w czasie których pacjent poddawany jest działaniu mieszanki tlenowej pod ciśnieniem.

ĆWICZENIE 4

Wykonanie ćwiczenia:

-Odczyty wyników z ćwiczenia 3 (własne posiewy do pojedynczych kolonii na płytkę z agarem odżywczym) - samoocena wyniku, wykonanie rysunku.

-Uzupełnienie tabeli (ćwiczenie 3) opisu wzrostu tlenowców i względnych beztlenowców (płytka stała, skos agarowy, słupek agarowy, bulion)

Opis i rysunki wzrostu Clostridium spp.

(wygląd hodowli i charakterystyczne zmiany w podłożu)

dla następujących posiewów:

•posiewy na płynne podłoże Cooked Meat Medium (Oxoid)

•posiewy na podłoże stałe (podłoże RCM - Oxoid) oraz

•posiewy na płynne podłoża 2-fazowe z nawarstwieniem odcinającym dostęp tlenu

podłoże Liver Broth (Oxoid)

Badanie zewnątrzkomórkowej aktywności enzymatycznej bakterii Przygotowanie testu

•Materiał wyjściowy - hodowle (AO na skosach) szczepów wyizolowanych z posiewów z rąk oraz szczepy standardowe

• Przesiewy w/w szczepów testowych na podłożą agarowe zawierajęce substraty umożliwiające wykrycie zewnątrzkomórkową aktywność:

•proteolityczną -podłoże Fraziera do wykrywania drobnoustrojów rozkładających żelatynę (F)

•amylolityczną - Agar Odżywczy z 0.2% skrobi (AS)

•hemolityczną - Agar Odżywczy z 4% krwi ludzkiej (AK)

•lipolityczną - Agar Odżywczy z 1% Tween 80 i CaCl2 (AT)

---