Diagnostyka bakterii beztlenowych przetrwalnikujących
Bakterie beztlenowe można podzielić na przetrwalnikujące i nieprzetrwalnikujące.
Bakterie beztlenowe nieprzetrwalnikujące należą do różnych rodzajów bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich.
Pałeczki Gram-ujemne:
Grupa Bacteroides fragilis
Grupa Bacteroides ureolyticus: Wolinella, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella, Mobiluncus, Megamonas, Selenomonas, Leptotrichia, Anaerospirillum;
Pałeczki Gram-dodatnie: Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Actinomyces, Lactobacillus;
Ziarniaki Gram-ujemne:Veillonella;
Ziarniaki Gram-dodatnie: Peptostreptococcus.
Bakterie beztlenowe przetrwalnikujące obejmują rodzaj Clostridium.
Znanych jest ok. 100 gatunków tego rodzaju, z czego ponad 40 izolowano dotąd od ludzi. Niektóre z tych gatunków wchodzą w skład flory kolonizującej błony śluzowe różnych układów, najczęściej przewodu pokarmowego. Często są spotykane w kale ludzi zdrowych.
Wszystkie bakterie z rodzaju Clostridium to Gram-dodatnie laseczki, wytwarzające przetrwalniki. Większość produkuje toksyny i enzymy toksyczne, odpowiedzialne za wywoływanie określonych zmian w tkankach (skurcz mięśni, zaburzenia przewodnictwa w o.u.n., porażenia spastyczne, zmiany martwicze i inne).
Za toksykoinfekcje odpowiedzialne są głównie:
Clostridium perfringens — zgorzel gazowa (w połączeniu z innymi gatunkami 2, 3 lub więcej, np. Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes lub Clostridium histolyticum, Clostridium bifermentans, Clostridium sordelli lub innych)
Clostridium septicum - obrzęk złośliwy - zgorzel gazowa
(często w skojarzeniu z Clostridium butiricum, Clostridium baratii, Clostidium haemolyticum)
Clostridium botulinum - zatrucie jadem kiełbasianym
Clostridium difficile - rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego po antybiotykoterapii, zespół AAC
Clostridium tetani - tężec
Komórki wegetatywne z młodych hodowli barwią się Gram-dodatnio, natomiast ze starych Gram-ujemnie.
Wytwarzają przetrwalniki umieszczone w komórce centralnie, terminalnie lub subterminalnie, stąd komórki przypominają wyglądem osełkę, rakietę tenisową, pałeczkę dobosza (laseczka tężca) lub maczugę (można obserwować w preparatach barwionych metodą Schaeffera-Fultona).
Należą do drobnoustrojów beztlenowych dlatego muszą być hodowane w warunkach beztlenowych.
Podłoża płynne
bulion tioglikolanowy (bioMerieux - bulion tioglikolanowy z rezazuryną jako wskaźnikiem stopnia natlenienia podłoża); tioglikolan sodu obniża potencjał oksydo-redukcyjny podłoża
bulion Schaedlera do izolowania względnych i bezwzględnych beztlenowców; obecność heminy, ekstraktu drożdżowego, witaminy K3 ułatwia rozwój bakterii o bardzo wysokich wymaganiach wzrostowych
Podłoża stałe
agar Columbia
agar Columbia + 5% krwinek baranich + gentamycyna (nie działa na beztlenowce)
agar Schaedlera
agar Schaedlera + 5% krwinek baranich
TSN Agar (Trypcase, Sulfite, Neomycin (bioMerieux) - podłoże do izolacji Clostridium perfringens)
Systemy do hodowli drobnoustrojów beztlenowych
system, który składa się ze szczelnej koperty z przezroczystego plastiku, która umożliwia dzięki generatorowi, szybkie uzyskanie atmosfery potrzebnej do hodowli szczepów beztlenowych. Generator zawiera mieszaninę sproszkowanego żelaza, kwasu cytrynowego i dwuwęglanu sodu. Po dodaniu wody następuje usunięcie tlenu i wzbogacenie atmosfery w CO2, co zapewnia szybki wzrost hodowli beztlenowej np. Generbag anaer (bioMerieux), Anaerocult P, C mini, A mini (Merck)
system, który składa się z puszki (2.5 litrowy zbiornik ze stali nierdzewnej lub przejrzystego plastiku), generatora umożliwiającego uzyskanie warunków beztlenowych
Generbox anaer (bioMerieux) - generator w postaci koperty, która zawiera 3 tabletki z hydroboranem sodu, dwuwęglanem sodu i kwasem cytrynowym, które mogą wytworzyć około 1,850 ml wodoru i 190 ml dwutlenku węgla. Koperta „beztlenowa" umożliwia otrzymanie warunków beztlenowych w obecności czynnego katalizatora (aluminium opłaszczone 0.5% palladem). W kopercie znajduje się także wskaźnik - pasek nasycony roztworem błękitu metylenowego, czynnika redukującego i stabilizatora. Część reagująca, koloru niebieskiego, odbarwia się w warunkach beztlenowych (reakcja ta może trwać kilka godzin)
Anaerocult A (Merck) - generator w postaci koperty umożliwiający po dodaniu wody bez katalizatora uzyskanie warunków beztlenowych w przejrzystej plastikowej puszce mieszczącej 12 płytek Petriego. Wskaźnik warunków beztlenowych - błękit metylenowy stosowany jest w postaci pasków (Anaerotest).
Bakterie z rodzaju Clostridium
nie wytwarzają katalazy
nie wytwarzają oksydazy cytochromowej nie wytwarzają peroksydazy
Przy identyfikacji bakterii beztlenowych powinny być uwzględnione takie cechy jak:
test na tolerancję tlenu (przesiew na podłoże i hodowla w warunkach tlenowych)
morfologia kolonii barwienie metodą Grama
ruch
testy biochemiczne produkty metaboliczne (GLC)
wrażliwość na antybiotyki testy serologiczne
Ostatnio również wprowadzono sondę genetyczną. Do identyfikacji biochemicznej dostępne są gotowe zestawy handlowe:. API 20 A z 24 godzinną inkubacją w warunkach beztlenowych i Rapid ID 32 A w ramach systemu ATB Expressibn (bioMerieux) - test 4 godzinny nie wymagający inkubacji beztlenowej.