Transformacje mikrobiologiczne steroidów- hydroksylowanie progesteronu

Materiały:

- 48-godzinna hodowla Fusarium oxysporum na pożywce o składzie:
glukoza: 40 g/l
ekstrakt drożdżowy: 5 g/l
NH₄NO₃: 5 g/l
KH₂PO₄: 2 g/l
MgSO₄ * 7H₂O: 1 g/l
pH 6.9
- roztwór progesteronu w etanolu o stężeniu 25 mg/ml
- dichlorometan
- eluent: dichlorometan : octan etylu (2:1)
- płytka do chromatografii TLC pokryta żelem krzemionkowym

progesteron

Część I

1. Do 48-godzinnej hodowli płynnej badanego szczepu grzyba sterylnie dodać 0.8 ml roztworu substratu. Równocześnie przygotować 2 hodowle kontrolne (dla całej grupy):

• hodowla płynna danego szczepu bez dodatku substratu

• substrat dodany do pożywki bez badanego szczepu grzyba

2. Przygotowane kolby z pkt 1. należy następnie umieścić na wytrząsarce i inkubować w temperaturze 28°C przez 7 dni.

Część II

Sprawdzenie przebiegu reakcji metodą chromatografii cienkowarstwowej:

1. Po 7 dniach biotransformacji oddzielić grzybnię od płynu pohodowlanego przez odwirowanie (4000 rpm, 10 min, 4°C), zarówno w przypadku hodowli kontrolnej jak i właściwej.

2. Z obydwu uzyskanych supernatantów oraz z kontroli bez grzybów pobrać do probówek wirówkowych po 4 ml i ekstrahować 2 ml dichlorometanu.

3. Próbki pozostawić do rozdzielenia się faz.

4. Ostrożnie pobrać pipetą po 400 µl frakcji organicznej i przenieść do probówek Eppendorfa.

5. Wykonać chromatografię TLC:

• Przygotować płytkę TLC (zaznaczyć ołówkiem linię startu i miejsca naniesienia prób).

• Na płytkę TLC nanieść ostrożnie i powoli kapilarą:

1. próba właściwa (50x w tym samym miejscu)

2. próba kontrolna bez substratu (50x w tym samym miejscu)

3. próba kontrolna bez grzybów (50x w tym samym miejscu)

4. wzorzec substratu (10x w tym samym miejscu)

• Pomiędzy jednym a drugim spotem należy wysuszyć płytkę.

• Po naniesieniu próbek, jeszcze raz dokładnie wysuszyć płytkę TLC i rozwijać w eluencie: dichlorometan : octan etylu (2:1).

• Gdy front eluentu zbliży się do górnego brzegu płytki TLC (około 1 cm poniżej krawędzi), wyjąć płytkę i zaznaczyć ołówkiem linię mety.

1. Uzyskany chromatogram wysuszyć i umieścić w komorze jodowej w celu detekcji badanych związków.

2. Obliczyć odpowiednie wartości Rf.

3. Na podstawie uzyskanych wyników ocenić przebieg reakcji hydroksylowania substratu.

---