Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest techniką powszechnie stosowaną w analizie białek. W zależności od zastosowanego układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości fizykochemicznych. Przyjmuje się, że elektroforeza w obecności SDS frakcjonuje białka zależnie od ich masy (długości łańcucha polipeptydowego).

Ten typ elektroforezy jest obecnie najczęściej stosowany i może być użyty jako jedna metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych, bardziej skomplikowanych badań (np. elektroforeza dwuwymiarowa, preparatywna, Western blotting).

Złożem, w którym następuje rozdział białek jest żel poliakrylamidowy, w czasie polimeryzacji oraz w trakcie elektroforezy ustawiony w pozycji pionowej (ang. vertical slab system). Standardowo SDS PAGE jest używana w wersji tzw. disc electrophoresis (ang. discontinuous pH), umożliwiającej maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce ta ?nieciągłość? dotyczy zarówno żelu, który składa się jakby z dwóch warstw, jak również buforu do elektroforezy: innego w górnym, innego w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki nakładane na żel w tym układzie mogą mieć stosunkowo dużą objętość, ponieważ w czasie przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma, które w dolnym żelu rozdziela się na pojedyncze, ?ostre? prążki.

W rzeczywistości białka rozdzielane są w SDS PAGE na zasadzie filtracji, analogicznie do metody chromatograficznej sączenia molekularnego.

Ponieważ frakcjonowanie zachodzi w zależności od długości łańcucha polipeptydowego, można ustalić masę danego białka przez porównanie z odpowiednimi standardami. Jest to metoda pozwalająca na oznaczenie masy białka z dokładnością do 5-10%, ale niestety nie każdy polipeptyd można w ten sposób scharakteryzować (jednym z wyjątków są białka histonowe).

ZASADA OGNISKOWANIA WIĄZEK JONOWYCH JEDNORODNYM POLEM MAGNETYCZNYM I RADIALNYM POLEM ELEKTRYCZNYM.

Spektrometria mas znajduje szerokie zastosowania w bardzo różnorodnych badaniach fizycznych i fizykochemicznych. Pomiar sprowadza się bezpośrednio do wyznaczania tylko jednego lub najwyżej trzech parametrów charakteryzujących daną wiązkę jonową:

• masy jonów

• zawartości jonów poszczególnych mas w wiązce

• i ich energii.

Chromatografia jonowymienna to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Jest to metoda preparatywna używana do wydzielenia z mieszaniny żądanej substancji.

W tej metodzie chromatografii faza stacjonarna, złoże, jest obdarzona ładunkiem. Stanowi je zazwyczaj żywica jonowymienna, zawierająca obdarzone ładunkiem grupy funkcyjne, oddziałujące z przeciwnie naładowanymi grupami związków, które mają zostać zatrzymane przez nośnik:

• pozytywnie naładowany jonowymieniacz (anionit) wiąże aniony

• negatywie naładowany jonowymieniacz (kationit) wiąże kationy.

Związki związane z jonowymieniaczem mogą być wymyte z kolumny przez stopniową elucję, a także poprzez zmianę stężenia soli lub pH.

Tego rodzaju chromatografii używa się do oddzielania takich związków jak aminokwasy, peptydy i białka. Chromatografia jonowymienna jest powszechnie stosowana do oczyszczania białek w systemie FPLC.

Odmianą chromatografii jonowymiennej jest chromatografia jonowa.

Spektrometria mas (MS, Mass Spectrometry) uniwersalna technika analityczna, zaliczana do metod spektroskopowych, której podstawą jest pomiar stosunku masy do jej ładunku elektrycznego (m/z).

Współcześnie istnieje wiele odmian tej techniki, z których każda posiada inne zastosowanie i wymaga stosowania aparatów o innej konstrukcji. Wszystkie te techniki są jednak oparte na jonizacji cząsteczek lub atomów, a następnie detekcji liczby i stosunku masy do ładunku (m/z) powstających jonów. Wyniki działania spektrometru mas są przedstawiane w postaci tzw. widma masowego.

Spektrometria mas służy do:

• identyfikacji związków chemicznych i ich mieszanin,

• ustalania struktury związków chemicznych,

• ustalania ich składu pierwiastkowego,

• ustalania składu izotopowego analizowanych substancji, co m.in. umożliwia określenie ich źródła pochodzenia

• precyzyjnego ustalania składu złożonych mieszanin związków o wysokich masach molowych w proteomice, badaniach materiałowych i chemii polimerów.

Masa cząsteczkowa, często mylona z masą molową, to masa:

• jednej cząsteczki związku (np. O₂, H₂O),

• formalnej jednostki danego związku (np. NaCl o budowie jonowej, a nie cząsteczkowej),

• jednego innego indywiduum chemicznego (np. jonu CH₃COO^-).

Masa cząsteczkowa wyrażana jest w atomowych jednostkach masy (tzw. unit); jednostka ta równa jest jednej dwunastej masy atomu izotopu węgla ¹²C.

Ładunek elektryczny ciała (lub ich układu) - własność materii przejawiająca się w oddziaływaniu elektromagnetycznym ciał obdarzonych tym ładunkiem. Oddziaływanie ciał obdarzonych ładunkiem odbywa się poprzez pole elektromagnetyczne. Związek między ładunkiem a polem jest istotą oddziaływania elektromagnetycznego.

Western-blot - metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca do wykrywania określonych białek.

Rozdziela zdenaturowane białka według ich mas oraz natywne (niezdenaturowane) według ich struktury 3-D, za pomocą elektroforezy w żelu (zwykle poliakrylamidowym). Później białka są przenoszone na membranę (zwykle nitrocelulozową lub PVDF). Obecność odpowiednich białek jest sprawdzana za pomocą barwników takich jak Ponceau S, czerń amidowa czy Coomassie Brilliant Blue lub za pomocą przeciwciał przyłączających się do ich epitopów.

Przed dodaniem przeciwciał membrana zostaje "zablokowana" przez zanurzenie w roztworze innego białka, zwykle żelatyny, albuminy surowicy krwi bydlęcej (BSA) lub odtłuszczonego mleka w proszku, często z dodatkiem detergentu (np. Tween 20) lub w roztworze samego detergentu, w celu uniemożliwienia niespecyficznego łączenia się przeciwciał z membraną.

Analogicznie do metody ELISA w metodzie Western-blot można używać jednego przeciwciała związanego ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwóch rodzajów przeciwciał - nieznakowanego, przeciwko wykrywanemu białku (przeciwciała pierwszorzędowe) oraz znakowanego, przeciwko danemu izotypowi immunoglobulin (przeciwciała drugorzędowe; metoda pośrednia).

Przeciwciała są znakowane zwykle enzymem (np. peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną), fluorochromem lub izotopem radioaktywnym. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję.

Punkt izoelektryczny, pI - wartość pH, przy której populacja cząsteczek posiadających grupy funkcyjne mogące przyjmować jednocześnie dodatni i ujemny ładunek elektryczny (np. aminokwasy) zawiera średnio tyle samo ładunków dodatnich co ujemnych, na skutek czego ładunek całkowity całej populacji wynosi zero. Stężenie jonu obojnaczego przyjmuje wtedy maksymalną wartość, a stężenia form anionowej i kationowej mają jednakowe, minimalne stężenie. W przypadku związków słabo rozpuszczalnych występują wtedy też niezdysocjowane cząsteczki.

Sytuacja taka może mieć miejsce w dwóch przypadkach:

• w roztworze istnieją wyłącznie jony obojnacze (tzw. zwitterjony)

• w roztworze istnieje taka sama liczba anionów i kationów

W punkcie izolektrycznym cząsteczki mają:

• najmniejszą rozpuszczalność

• najmniejszą lepkość

• najmniejsze ciśnienie osmotyczne

Wartość ta jest oznaczana najczęściej w odniesieniu do białek i aminokwasów, metodami polarymetrycznymi, chromatograficznymi (ogniskowanie chromatograficzne, ang. chromatofocusing, CF) i elektroforetycznymi.

W pH poniżej pI białka mają ładunek dodatni, zaś powyżej ich ładunek jest ujemny. Ma to duże znaczenie w czasie rozdziału metodą elektroforezy. pH żelu elektroforetycznego zależy od użytego buforu. Jeżeli pH buforu jest wyższe od pI białka, to będzie ono migrować w kierunku anody (ujemny ładunek - anion, jest przyciągany do niej).

Narzędzia	Charakterystyka	Przydatność
Polimerazy^a	enzymy uczestniczące w procesie replikacji DNA w komórkach	pomnażanie ilości DNA (metoda PCR — reakcji łańcuchowej polimerazy)
Enzymy restrykcyjne i ligazy	enzymy funkcjonujące w komórkach w procesach naprawy DNA i podczas replikacji	nacinanie nici DNA, jej rozcinanie na części (np. w celu wyizolowania genu), łączenie nici DNA (np. w celu zmodyfikowania wektora)
Wektory	odpowiednio spreparowane(zmodyfikowane) wirusy lub plazmidy, a także sztuczne chromosomy	można do nich wbudować obcy DNA, a wektor wprowadzić do komórki gospodarza, gdzie ulegnie ekspresji, powieleniu lub wbuduje się do jej genomu
cDNA	dwuniciowy DNA otrzymany z RNA^b za pomocą odwrotnej transkryptazy	poszukiwanie genów kodujących znalezione w komórce białko; tworzenie genów eukariotycznych wolnych od intronów
Banki genów	zbiór cząsteczek zawierających różne fragmenty DNA (np. geny)	identyfikacja wyizolowanych fragmentów DNA (np. przez sprawdzenie, z którą cząsteczką z banku najłatwiej ulegają hybrydyzacji)
^a Szczególnie często jest stosowana tzw. polimeraza taq (z Thermus aquaticus), wytrzymująca temperaturę 95^oC; ^b krótkie odcinki jednoniciowego RNA o żądanej sekwencji nukleotydów można syntezować dość łatwo.

---