Krótkie interferujące RNA w onkologi.
WSTĘP
1 cząsteczki zdolne do wyciszania na poziomie mRNA:
>chemiczne modyfikowane antysensowne oligodeoksyrybonuklotydy(ODN)
-są to ok 20 nukleotydowe odcinki DNA łączące sie z pre-mRNA i mRNA
-kompleksy RN A-DNA degradowane sa przez rybonukleaze H
-ODN czasem sa toksyczne komórkowo --->wiązą nie specyficzne endogenne białka , indukuja odpowiedz ukłądu imunologiczne przez interferon i receptory TLR
>Rybozymy (hammerhead)
-po przyłączeniu do komplementarnej nici mRNA ulegaja aktywacji co prowadzi do degradacji mRNA / pre-mRNA
-hybrydyzuja bezposrednio z mRNA wymagajac uzycia duzychg stezen co pociaqga za soba ryzyko niespecyficznego dzialania
>siRna
-krótkie , dwu niciowe odcinki RNA
-są to głównie cząsteczki efektorowe interferencji RNA która to prowadzi do specyficznej degradacji mRNA
>PNA
-dawka powodujaca wyciszenie musi byc wyzsza niz w przypadku siRNA
-rzadko uzywany do wyciszania genow na poziomie mRNA
>DNA zymy
-rzadziej używany do wyciszania genow na poziomie mRNA
2badania dowodza ze :
>siRNA jest najbardziej skuteczne
>efekt dzialania si RNA utrzymuje sie dłużej niż w przypadku ODN,rybozymow i DNA zymów
>dawka siRNA powodująca wyciszenie jest ok 100 do 1000 niższa optymalna dawka PNA skierowana przeciwko temu samemu mRNA
>potrzebne jest niskie stezenie siRNA aby wywolac pozytywny efekt
>si RNA szybko i specyficznie wiaza sie z RISC oraz ogranicza wiążanie z innymi białkami kjomórkowymi
> wprowadzenie siRNA w stężeniu kilku nanomoli powoduje redukcje docelowego mRNA do 95%
>wystepowanie efektów off-target w przypadku si RNA jest mniejsze niż ODN . Prawdopodobnie dobre dobranie sekwencji antysensownej decyduje o selektywnosci działąnia siRNA i eleminuje efekt off-target(nie specyficzne wyciszenie genu.)
INERFERENCJA RNA ( RNA i )
> to jedna z postaci po transkrypcyjnego mechanizmu wyciszania ekspresji genów
>terminu tego uzywa sie zarówno do określania wyciszen u roślin jak i u zwierzą w celu ujednolicenia terminologi ( RNA i - u zwierząt , PTGS(potranskrypcyjne wyciszenie genów) - u roślin , quelling u grzybów )
> niektóre organizmy RNAi wykorzystuja do walkii z wirusami , wyciszania transpozonów ,potranskrypcyjnej regeneracji genów
MECHANIZM DZIAŁANIA siRNA .
>W cytoplaźmie pojawienie sie dsRNA / shRNA ---> rozpoznanie i hydrolizowanie dsRnNA przez nukleazę DICER--> krótkie, swuniciowe interferujace siRNA o długości 21-23 nukleotydy zakończone 2 wolnymi nukleotydami na końcu 3 --> siRNA+wyciszający kompleks RISC uczestniczą w degradacji homologicznego mRNA -->aktywacja RISC wymaga rozplecenia 2 niciowego siRNA -->kompleks RISC wiąże preferencyjnie jedną z nici siRNA --> jednoniciowy siRNA łączy się na zasadzie komplementarności z docelową sekwencją mRNA --> endonukleaza Ago2 tnie dupleks mRNA\siRNA --> dalsza degradacja pod wpływem egzonukleaz
>Nukleaza DICER:
w kom. Ludzkich należydo rodziny rybonukleaz typu III
- posiada 2 domeny o aktywności RNAzy III, domene PAZ ktora jest zależna od ATP i jest domena helikazowa oraz wiążącą dsRNA (dsRNA-długie dwuniciowe cząsteczki RNA)
>Białka Argonaute (np. Endonukleaza Ago2)
posiadaja 2 domeny
*PAZ odpowiada za wiązanie siRNA
*PIWI jest strukturalnie podobna do domeny rybonukleazy H i może wykazywać aktywność endorybonukleazy
SPOSOBY WPROWADZANIA siRNA DO ŻYWYCH ORGANIZMÓW
>dożylne wstrzyknięcie fiziologicznego roztworu siRNa pod wysokim cisnieniem
>systemy wirusowe m.in. Rekąbinowany AAV zapewniający nawet 7 tygodniową siRNA w komórkach dzielących sie jak i nie ulegającym podziałom
>bezpośrednie wstrzykniećie siRNA kodowanego przez adenowirusa do komóek wątroby i mózgu myszy
>podawanie siRNA w postaci areozolu przy schorzeniach płuc dróg oddechowych
>dostarczenie tzw. Nagiej cząsterczki si RNA lub za pomocą nosników opartych na lipidach .
PERSPEKTYWY TERAPI OPARTEJ NA INTERFERENCJI RNA
>stosowanie cząsteczki dwuniciowego RNA o długości 30pz indukują u ssaków ekspresje interferonu co powoduje zahamowanie translacji i degradacje wszystkich cząsteczek w kom .
>siRNA wyciszają geny docelowe bez indukcji ekspresji interferonu
BADANIA KLINYCZNE I PRZEDKLINYCZNE
>siRNA wykorzystywane w walce ze starczym zwyrodnieniem plamki
>wykorzystanie siRNA w infekcjach wirusowych górnych dróg oddechowych m.in. Grypy , astmy,prtzewlekłęj choroby płuc ( POChP), idiopatycznego włóknienia płuc (IPF)
>wlaka z HIV i AIDS oraz WZW typ B i C , mukowiscydoza,choroba Parkinsona
>walka z chorobami nowotworowymi i metabolicznymi , choroba Huntinktona
CHOROBY NOWOTWOROWE
>możliwość wykorzystania si RNA do wyciszania ekspresji genów w kom nowotworowych
>geny białek antyapoptotycznych ---> ichh wyciszenie moze redukować wcho0dzenie kom na szlak apoptozy
>siRNA znalazło zastosowanie przy wyciszaniu genów :
*K-RASV12 *PTTG
*FGF4 *hTERT
*c-myc *chimery E2A-PBX1
*STAT3 *PIK3CB
>zastosowanie siRNA może pomóc w problemie chemioterapi
>grupą genów stanowiącą celo w terapi mogą być geny kodujące białka naprawiająće uszkodzenia DNA głównie podwójne pęknięcia .
Z KSIĄŻKI !
> nową bardzo obiecująća strategią terapi genowej jest wyciszanie genów . Zastosowanie dla RNAi poszukuje sie w leczeniu szeregu chorub neurodegeneracyjnych, szczególnie tych powstałych w wyniku mutacji dynamicznych . Przewagi stosowania terapi RNAi nad strategią antysensu czy tripeksu upatruje sie w możliwsosci wykorzystania naturaslnych procesó kom . W których RN-aza docina specyficzne cząsteczki siRNA . Oczekuje sie żę leczenie z wykorzystaniem strategi antysensu , tripleksu , rybozymu czy RNAi znajdzie równierz szerokie zastosowanie w terapi chorób infekcyjnych .
>terapia genowa oparta na technice interferencji RNA polecga np na wprowadzeniu do kom dwuniciowego RNA na wektorze wirusowym któy następnie dzięki naturalnym procesom kom zostałbym przekształcony do si RNA . Wykazano równierz żę skojarzenie z terapią genową chemio-radioterapi w znaczący sposób zwiększa skutecznosć tej metody leczenia . :)