Analiza żywności

Szybkie metody mikrobiologiczne

Wykonali

Marek Banasiak

Piotr Filipiak

Michał jurczyk

Tradycyjne metody posiewów

Metody badania zanieczyszczeń mikrobiologicznych gotowych produktów są określone

w rozporządzeniu ministra zdrowia z dnia 23 grudnia 2002 r. w sprawie określenia

procedur pobierania próbek kosmetyków oraz procedur przeprowadzania badań

laboratoryjnych (Dz. U. z 2003 r. Nr 9, poz. 107). Tradycyjnie, aby wykonać zliczanie

lub badanie mikroorganizmów w danym produkcie, mikrobiolog powinien wykonać

następujące operacje:

- przygotować, wysterylizować, skontrolować, przechować podłoża,

- wykonać posiew próbki na różnych podłożach po przygotowaniu rozcieńczenia,

- inkubować w okresie od 1-5 dni,

- zliczyć kolonie,

- przeszczepić, izolować i zidentyfikować kolonie.

Czas oczekiwania na wynik jest zasadniczą niedogodnością metod trakcyjnych.

Ponieważ rozporządzenie nie wskazuje obligatoryjnie metod, jakie mają być

zastosowane do kontroli CCP, istnieje możliwość zastosowania szybkich testów

mikrobiologicznych.

Szybkie testy mikrobiologiczne

Szybkie testy mikrobiologiczne można podzielić na następujące grupy:

1. metody mikroskopowe i pochodne,

2. związane z przemianą materii,

3. oparte o reakcje immunologiczne.

Metody mikroskopowe i pochodne

Metoda Prescott'a-Breed'a

Klasyczna metoda Prescott'a-Breed'a polega na zliczaniu bakterii obserwowanych pod

mikroskopem w próbce o znanej objętości. Próbkę umieszcza się na szkiełku

przedmiotowym. Mikroorganizmy są zabarwione zwykle błękitem metylenowy. Technika

ta jest żmudna i charakteryzuje się niską czułością. Wynik liczenia jest sumą

mikroorganizmów żywych i martwych. Wynik uzyskiwany tą metoda jest znacznie

wyższy od otrzymywanego metoda posiewu.

Metoda Frost'a

Metoda Frost'a polega na wykonaniu posiewu na szkiełku przedmiotowym. Najpierw

nanoszona jest określona objętość próbki, która następnie jest zalewana ciepłym agarem i

inkubowana od czterech do ośmiu godzin w temperaturze 37ºC, lub dwadzieścia cztery

godziny w temperaturze 24ºC. Zabarwione kolonie są zliczane pod mikroskopem.

Zautomatyzowana cytometria stacjonarna

W metodzie Direct Epifluorescent Filter Technique (DEFT) jako marker zastosowany

oranż akrydynowy, który wiąże się z DNA i RNA. Po filtracji testowanego produktu

przez membranę i zabarwieniu możemy za pomoca mikroskopu fluorescencyjnego

zliczyć mikroorganizmy z możliwością odróżnienia żywych komórek od martwych.

Komórki żywe pod dzianiem UV świecą w kolorze pomarańczowym, a martwe -

zielonym. Analiza obrazu zwiększa możliwości tej techniki, jakkolwiek jej zastosowanie

jest ograniczone do produktów, które można poddać filtracji. Jako markera można także

używać pochodnych fluoresceiny lub przeciwciał sprzężonych z fluoresceiną.

Inna odmiana tej metody jest zastosowana w systemie MicroStar (produkt firmy

Millipore) Pojedyncze komórki są wyłapywane na membranie filtracyjnej. Po krótkiej

inkubacji, powstałe mikrokolonie są poddawane działaniu środka, który powoduje

bioluminescencję w wyniku zużywania energii zgromadzonej w ATP. System

wyposażony w kamerę zlicza mikrokolonie. Powyższa technika jest doskonała w

zastosowaniu dla produktów słabo zanieczyszczonych, możliwych do filtrowania.

Cytometria przepływowa

Mikroorganizmy zawieszone w medium przepływającym przez komorę pomiarową

przechodzą przez wiązkę świetlną i emitują sygnał fluorescencyjny, tak jak w przypadku

opisanej powyżej cytometrii stacjonarnej. Światło emitowane przez każdy

mikroorganizm jest analizowane przez detektor umożliwiający szybkie i precyzyjne

zliczanie. Technika ta została w pełni zautomatyzowana i posiada wysoką czułość (około

100 mikroorganizmów/ml).

Metody związane z przemianą materii

Metody elektrochemiczne

Pomiar ma charakter pośredni. Rozwój mikroorganizmów stwierdza się poprzez

rejestrację zmian własności elektrochemiczne podłoża. Zmiany te wynikają z zaniku

substratu lub pojawiania się substancji wytworzonych przez mikroorganizmy.

Impedymetria

Mikroorganizmy rozkładają złożone związki, takie jak białka i wielocukry na

aminokwasy, kwasy organiczne i inne proste związki dysocjujące w roztworze. Zmiany

przewodności stwierdzone przy pomocy odpowiedniego systemu detekcji pozwalają

stwierdzić obecność mikroorganizmów. Jedną z mierzalnych właściwości jest

impedancja, czyli opór pozorny przewodnika określany dla prądu zmiennego. Na

wielkość impedancji składają się dwie wartości: opór czynny (rezystancja) i opór bierny

(reaktancja). Do badania podłoża mikrobiologicznego wykorzystuje się prąd zmienny,

gdyż prąd stały powodowałby hydrolizę próbki.

W przypadku niektórych mikroorganizmów większą czułość i szybkość można osiągnąć

stosując impedymetrię pośrednią. Np. drożdże w warunkach tlenowych przerabiają

cukier na biomasę dwutlenek węgla i wodę z praktycznie stuprocentową wydajnością. W

tym przypadku można wykorzystać reakcję dwutlenku węgla w roztworze zasadowym.

Zamiana jonów hydroksylowych na węglanowe daje mierzalny sygnał pozwalający

stwierdzić obecność drobnoustrojów. Impedymetrię pośrednią stosuje się także w

przypadku pożywek o dużej przewodności.

Możliwe jest też badanie selektywne drobnoustrojów, np. badanie miana coli.

Impedymetrię stasuje się wtedy po przeprowadzeniu wzorcowania w stosunku do

metody referencyjnej.

Czas potrzebny na przeprowadzenie analizy impedymetrycznej w przypadku urządzenia

Bactometer (bioMerieux, Hazelwood, Mo., U.S.A.) wynosi ok. czterech godzin. Metoda

da się w pełni zautomatyzować.

Zmiana potencjału oksydoredukcyjnego lub pH

Rozwój mikroorganizmów powoduje zmianę potencjału oksydoredukcyjnego podłoża.

Czas jaki upływa do wykrycia tej zmiany jest odwrotnie proporcjonalny do liczby

bakterii obecnych w podłożu oraz czasu ich wzrostu. Obecnie są dostępne testy, w

których wzrost mikroorganizmów powoduje zanik fluorescencji lub zmianę barwy

substancji wskaźnikowej wrażliwej na zmianę potencjału oksydoredukcyjnego. W

zależności od rodzaju sygnału stosowane są odpowiednie detektory.

Przykładowo, Omnispec Bioactivity Monitor System (Wescor, Inc., Logan, Utah,

U.S.A.) mierzy kolorymetrycznie zmianę jakim ulega dodany barwnik pod spływem

zmiany pH, potencjału oksydoredukcyjnego lub stężenia wolnych grup aminowych. Czas

przeprowadzenia analizy dla tego urządzania waha się od dwóch do dwudziestu czterech

godzin.

Detekcja zmiany stężenia substratu lub produktu

Przekładem systemu mierzącego wielkość emisji konkretnego produktu przemiany

materii jest urządzenie BacT/Alert Microbial Detection System (Organon Teknika,

Durham, N.C., U.S.A.), które bada stężenie dwutlenku węgla produkowanego przez

mikroorganizmy. Urządzenie do tego celu jest wyposażone w zaawansowany

technologicznie czujnik i oprogramowanie. Czas pomiaru dla kultury E. coli może

wynosić od 6 do 8 godzin.

Bioluminescencja

Adenozynotrifosforan (ATP) jest obecny w każdej żywej komórce. Detekcję ATP można

przeprowadzić wykorzystując zjawisko bioluminescencji. Efekt bioluminescencji jest

wynikiem następującej reakcji:

Lucyferaza katalizuje dekarboslylację oksydatywną lucyferyny ((LH₂), która jest

przekształcana w oksylucyferynę (P). Do zajścia reakcji niezbędna jest obecność ATP,

który ulega rozpadowi do adenozynomonofosforanu (AMP) i pirofosforanu (PPi).

Reakcji towarzyszy wydzielenie energii świetlnej. Emisja światła jest podstawą pomiaru.

Wynik pomiaru otrzymuje się po kilku minutach.

Zależność pomiędzy stężeniem ATP w analicie a wielkością emisji jest liniowa, ale z

uwagi na specyfikę testów higienicznych, stosowanie ATP-metrii napotyka następujące

trudności:

•Różne gatunki organizmów maja różną zawartość ATP. Np. drożdże zawierają

sto razy więcej ATP niż komórki bakteryjne.

•Komórki tego samego gatunku mają róże stężenia ATP, w zależności od fazy

wzrostu.

•Na wynik pomiaru może wpływać ATP pochodzące z innych źródeł, np.

niskoprzetworzonych surowców naturalnych lub krwi i innych wydzielin

pochodzących od człowieka.

Dlatego w praktyce wielkość emisji mierzy się w Relative Light Unit (RLU). Wartość

RLU jest proporcjonalna do stopnia zanieczyszczenia np. badanej powierzchni

urządzenia. Dla większości systemów pomiarowych różnych firm są opracowane

wartości akceptowalne, nieakceptowane i marginalne RLU dla określonych aplikacji

przemysłowych. Póki nie ma ustalonych norm całkowitego stężenia ATP

dopuszczalnego w konkretnych przypadkach praktyki produkcyjnej, wartości RLU są

ustalane zupełnie dowolnie.

Dużą zaletą ATP-metrii jest prostota przeprowadzenia testu i możliwość uzyskania

wyników w ciągu pięciu minut.

Wykorzystanie reakcji immunologicznych

Reakcja pomiędzy przeciwciałem i antygenem może być wykorzystywana do detekcji

wszystkich substancji o charakterze antygenu, a wiec nie tylko elementów żywych

komórek, ale także do wykrywania toksyn, alergenów antybiotyków i innych substancji,

których obecność w produkcie jest niepożądana. Reakcje immunolgiczne są

wykorzystywane między innymi w testach ELISA (enzyme-linked immunosorbent

assay), testach RIA (radio immuno assay), separacji immunomagnetycznej, czy jako

elementy markerów fluorescencyjnych stosowanych w cytometrii. Metody oparte o

powinowactwo przeciwciała do antygenu charakteryzują się dużą specyficznością.

ELISA jest metoda opartą na zjawisku wiązania określonych związków przez

przeciwciała oraz reakcji enzymatycznych z udziałem zawiązków połączonych z tymi

przeciwciałami. Enzymy związane z przeciwciałami lub antygenami pełnią rolę

markerów. Jest wiele odmian testów ELISA. Większość z nich bazuje na reakcji

przeciwciał zaadsorbowanych na stałym podłożu. Stosuje się wtedy płytki z

miniaturowymi probówkami. Przykładowy schemat realizacji testu ELISA jest

następujący:

1. Nanieść próbkę, będącą w postaci roztworu, na powierzchnię pokrytą

przeciwciałami, które wiążą antygen z próbki.

2. Spłukać powierzchnię, w celu usunięcia pozostałości próbki z niewiązanym

antygenem.

3. Dozować przeciwciała z przyłączonymi cząstkami enzymu. Przeciwciała

przyłączą się do cząstek antygenu zaadosbowanych na powierzchni.

4. Spłukać z powierzchni pozostałości niezwiązanych przeciwciał.

5. Zadozować substancję, która jest przekształcana przez enzym w reakcji barwnej.

Firmy diagnostyczne oferują zestawy do wykrywania typowych patogenów. Są dostępne

także systemy do całkowicie automatycznej realizacji testów. W zależności od

zastosowanych markerów, zwykle stosuje się pomiar kolorymetryczny lub

fluorescencyjny. System VIDAS (bioMerieux, Hazelwood, Mo., U.S.A.) wykonuje

automatycznie analizę, zależnie od zestawu, w czasie od czterdziestu pięciu minut do

dwóch godzin.

Separacja

Separacja imminomagnetyczna

Separacja imminomagnetyczna ma na celu wydzielenie cząstek o charakterze antygenu z

mieszaniny. Wydzielony materiał można poddać dalszej obróbce.

W metodzie tej przeciwciała są nanoszone na małe cząstki metalu o właściwościach

magnetycznych. Cząstki z naniesionymi przeciwciałami są dodawane do roztworu

zawierającego antygen. Po zajściu reakcji przeciwciał z antygenem, naczynie z

mieszaniną jest umieszczane w silnym polu magnetycznym, które zatrzymuje na ściance

naczynia cząstki metalu wraz z zaadsorbowanymi molekułami. Wtedy pozostałe cząstki

są wypłukiwane z naczynia. Po wyłączeniu pola magnetycznego cząstki antygenu

powracają do roztworu.

PCR

PCR (polymerase chain reaction) umożliwia wybiórczą amplifikację określonego

fragmentu DNA. Żeby zrealizować procedurę, trzeba dysponować starterami, czyli

fragmenty jednoniciowego DNA o długości od 20 do 30 nukleotydów, które są zdolne

do wiązania się z końcami fragmentu DNA, który ma być amplifikowany. Żeby metoda

była specyficzna, kod startera musi być specyficzny dla poszukiwanego organizmu.

Etapy cyklu reakcji PCR są następujace:

1. Rozłożenie podwójnej nici DNA w 95ºC.

2. Dodanie starterów do roztworu i obniżenie temperatury do 40-60ºC, aby startery

mogły się przyłączyć do badanych nici DNA.

3. Podwyższenie temperatury do temperatury 72ºC, w której polimeraza syntetyzuje

fragment DNA, poczynając od dwuniciowego fragmentu utworzonego przez

starter i badany odcinek.

4. Podniesienie temperatur do 95ºC w celu powtórzenia cyklu.

Po zakończeniu pierwszego cyklu zamiast jednej kopii DNA mamy dwie, ale po

powtórzeniu procedury dwadzieścia jeden razy mamy już milion kopii badanego

odcinaka DNA. Proces powielania wybranego fragmentu DNA jest realizowany

wielokrotnie, aż do momentu, gdy stężenie powielanych odcinków kwasu

dezoksyrybonukleinowego pozwala na ich detekcję np. metodą elektroforezy. Przy

wykorzystaniu automatycznych urządzeń, czas potrzebny na amplifikację jest rzędu

jednej godziny.

Biosensory

Biosensor jest to kompleks cząstek pochodzenia biologicznego osadzonych na materiale

pozwalającym na uzyskanie sygnału, gdy biosensor wejdzie w kontakt z analitem.

Obecnie opracowano wiele biosensorów, w których wykorzystuje się enzymy,

przeciwciała, kwasy nukleinowe, cale komórki itd. Biosensory, wykorzystujące znane i

częściowo wymienione powyżej techniki analityczne, mogą dawać odpowiedź w ciągu

kilku minut, jednak z uwagi na czułość może być potrzebne zastosowanie PCR, separacji

immunomagnetycznej lub innej techniki w celu zwiększenia stężenia badanych cząstek w

analicie. Wykorzystanie na szeroką skalę biosesorów do kontroli jakości w warunkach

przemysłowych pozostaje ciągle kwestią przyszłości.

Podsumowanie

Szybkie testy mikrobiologiczne pozwalają na stworzenie efektywnego systemu

monitoringu dzięki:

•możliwości wykonywania dużej liczby analiz w krótkim czasie,

•stosowaniu systemów mniejszych i tańszych w eksploatacji niż całe laboratorium

mikrobiologiczne,

•prostocie wykonania testów.

Szybkie testy, takie jak ATP-metria lub testy z wykorzystaniem reakcji

immunologicznych, pozwalają na uzyskanie wyników podczas realizacji procesu.

Niektóre szybkie metody, takie jak cytometria, umożliwiają wykrywanie

mikroorganizmów nie tworzących kolonii, a wiec niewykrywalnych metodami posiewu.

Szybkie testy, takie jak ELISA, pozwalają wykrywać nie tylko mikroorganizmy, ale

także substancje niepożądane. Takie testy, jak ELISA wykraczają poza granice kontroli

mikrobiologicznej i stają się elementem wszechstronnej kontroli jakości produktu. Z

drugiej strony testy ELISA pozwalają na wykrycie jedynie związków, dla których zostały

zaprojektowane, z uwagi na dużą selektywność.

Trudności w stosowaniu szybkich metod są związane z koniecznością właściwej

interpretacji wyników. Przykładem może ATP-metria, która jest uznaną metoda badania

ogólnej czystości np. powierzchni urządzenia lub wody procesowej. Chociaż zależność

między wynikiem otrzymanym w RLU (Relative Light Unit), a ilością CFU (Colony

Forming Unit) w jednostce objętości jest liniowa, to brak specyficzności uniemożliwia

jednoznaczną interpretację wyników w przypadku mieszaniny zanieczyszczeń zawierając

ATP.

Wybór metody analitycznej powinien być przeprowadzany w powiązaniu z analizą

zagrożeń i wyborem krytycznych punktów kontrolnych (CCP). Wybór metody zależy od

rodzaju badanego medium lub powierzchni, wymaganego progu detekcji oraz czynników

chemicznych lub biologicznych obecnych w próbce. Metoda analityczna powinna być

dostosowana do CCP, tak by analiza była wiarygodna. W przeciwnym razie należy

wprowadzić taką zmianę w technologii lub urządzeniu, żeby kontrola w CCP była

wykonalna lub CCP stał się niepotrzebny.

Szybkie testy mikrobiologiczne nie wyprą tradycyjnych metod badań, póki świat nauki

nie uzna ich za bardziej wiarygodne, a organy państwowe sprawujące nadzór nad

produkcją nie wprowadzą ich jako obligatoryjnych metod badania jakości, w zastępstwie

metod tradycyjnych.

Bibliografia

1. Aantrekker Esther D. den, Recontamination in food processing - quantitative

modeling for risk assessment, Uniwersytet Wageningen, Holandia, 2002;

2. Burianka Maria, Pliszka Anna, Janczura Ewa, Teisseyre Teresa, Załęska Helena,

Mikrobiologia żywności. Mikrobiologiczne metody badania produktów

żywnościowych. PZWL, 1971;

3. Dostálek Pavel, Brányik Tomáš, Prospects for Rapid Bioluminescent Detection

Methods in the Food Industry - a Review, 2005,

http://www.cazv.cz/attachments/1-Dostalek.pdf;

4. Fung Daniel Y.C. Rapid methods and automation in microbiology. Comprehensive

Reviews in Food Science and Food Safety, 2002,

http://members.ift.org/NR/rdonlyres/F13F34EA-B9FF-43A7-ADBC-

94E9B48F1D6E/0/crfsfsv01n1p003022ms20001206.pdf;

5. International Society for Pharmaceutical Engineering (ISPE), Tampa, FL, USA,

ISPE Baseline Guide: Volume 5 - Commissioning and Qualification;

6. Komisja SFSTP pod przewodnictwem E. Petat, Alternatywne metody kontroli

mikrobiologicznej. Prezentacja szybkich technik. Raport Komisji SFSTP.

Pharmaceutica nr 10, 2004;

7. U. S. Food and Drug Administration, U. S. Department of Agriculture, National

Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods, Hazard Analysis and

Critical Control Point Principles and Application Guidelines, 1997,

http://vm.cfsan.fda.gov/~comm/nacmcfp.htm

---