DRUGA I TRZECIA GENERACJA SEKWENCJONOWANIA

Druga generacja

- wyizolować DNA z dowolnej próbki - eDNA - environmental DNA, DNA wyizolowane np. z wody, gleby, z wszystkich obecnych tam bakterii

- zaopatrzyć pofragmentowane DNA (kilkaset nt) w dodatkowe fragmenty DNA za pomocą ligazy - dołączanie krótkich oligonukleotydów które mogą być starterami do PCR ale nie muszą, ligacja musi być bardzo wydajna

- nie ma etapu wklonowywania do wektorów - stosując tradycyjne metody nie udawało się uzyskiwać reprezentatywnej biblioteki, bo fragmentów DNA w przypadku eDNA jest bardzo dużo - ważne, bo każdy odcinek każdego genomu każdego mikroorganizmu obecnego w próbce musi być dostępny

- zalety: szybciej niż pierwszej generacji, bo zautomatyzowane, nie ma etapu klonowania

Metoda 454 sequencing - pirosekwencjonowanie 454

- Life Sciences

- shotgun sequencing

- etapy:

- DNA fragmentujemy dołączając oligonukleotydy do reakcji PCR oraz związek który można swoiście przyczepić do powierzchni kulek magnetycznych opłaszczonych ligandem np. biotyna-streptawidyna, najczęściej oligonukleotydy znakuje się biotyną, bo wiązanie biotna-streptawidyna jest bardzo silne, roztwór musi być odpowiednio rozcieńczony żeby teoretycznie każda kulka magnetyczna miała jeden fragment DNA

- emPCR - emulsyjny PCR, PCR robi się w kropelce wody zmieszanej z olejem, w każdej kropelce jest taka mała kulka, do której przyczepiony jest DNA

- denaturacja DNA, przemywanie, otrzymujemy kulkę z przymocowanym jednoniciowym DNA, taki jeżyk

- kropelki trafiają do mikrodołków i prowadzi się sekwencjonowanie - jedna płytka może zawierać kilkaset tysięcy mikrodołków - możemy jednocześnie prowadzić kilkaset tysięcy reakcji sekwencjonowania na raz - high throughput

Sekwencjonowanie - 3 enzymy (polimeraza, ATP-sulfurylaza, lucyferaza)

(Matryca)_n + nukleotyd ^polimeraza (Matryca)_n+1 + PPi

PPi + APS (adenozyno - 5`-fosfosiarczan) ^{ATP-sulfurylaza} ATP + SO₄^2-

ATP + lucyferyna + O₂ ^lucyferaza AMP + PPi + oxylucyferyna + CO₂ + światło

Mamy kuleczki w mikrodołkach

Dodajemy jeden nukleotyd

Jeśli jest komplementarny mamy światło i kamera to rejestruje

Przemywamy dołki - apyraza - degraduje niewłączone nukleotydy, w tym ATP

Dodajemy kolejny nukleotyd

Tak mogą wyglądać wyniki. Jak pik jest wysoki znaczy, że były dwa po sobie np. G.

Sekwencjonowanie drugiej i trzeciej generacji -wyzwanie dla bioinformatyki żeby było możliwe przeanalizowanie tych ogromnych ilości danych.

Zastosowanie:

- możemy sekwencjonować eDNA

- możemy wyizolować całkowite RNA, przepisać na DNA i znowu sekwencjonować

-zastosowanie w badaniach populacji np. wykrywaniu mutacji pomiędzy osobnikami

-zastosowanie w badaniach nad zastosowaniem leków w przyszłości - jak podanie jakiegoś leku wpływa na zmianę ekspresji jakiś genów u człowieka

Trzecia generacja

- pojedynczą nić można odczytywać całą, obojętnie jak jest długa

- SMS - single molecule sequencing - nie trzeba amplifikować DNA, którego sekwencję chcemy poznać

- problem - polimeraza dodaje ok. 1000 nt/s trzeba ją więc trochę „zepsuć”, bo nie mamy na tyle wydajnych urządzeń które nadążyłyby z detekcją

-stosuje się zmodyfikowane nukleotydy np. z fluorofortami

2 główne strategie:

1. dołączamy nukleotydy i każdy z nich jest inaczej oznaczony np. fuloroforami albo

2. mamy nić gdzie na matrycy są nukleotydy zaznakowane fluoroforami i odcinamy nukleotyd po nukleotydzie kawałki matrycy i maszyna odczytuje jaki to był nukleotyd

Metoda VisiGen

-Stosuje FRET

-Polimeraza z donorem

-Akceptorem jest fluorescencyjny nukleotyd

-Jeśli nukleotyd jest przyłączany do matrycy to następuje jego zbliżenie do polimerazy i zachodzi FRET i emisja światła, które jest sczytywane przez komputer

Metoda GridION system - Nanopore Technologies

- zastosowanie α-hemolizyny

- mikromaszynka wciąga DNA, odcinająca nukleotyd po nukleotydzie, a kolejna maszynka rejestruje jaki to nukleotyd

Link do filmiku, który był na wykładzie, opisującego jak to działa:

https://nanoporetech.com/technology/the-gridion-system/movie-an-introduction-to-the-gridion-system

Pacific Biosciences - SMRT sequencing

-reakcja polimeryzacji

-10^-21 l studzienki, w których dokonuje się rejestracji dołączanych nukleotydów już nawet bez FRET tak czułe są urządzenia

Link

https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI

Ion Torrent

- metoda pomiaru pH

Link

http://www.lifetechnologies.com/pl/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-technology.html#

16s rRNA jest molekularnym markerem

Mamy gen 16S rRNA i on ma jakieś regiony zmienne, które są oflankowane sekwencjami silnie konserwatywnymi, amplifikujemy sobie te regiony zmienne żeby zanalizować ich sekwencje używając starterów komplementarnych do regionów konserwatywnych.

Jak to się robi?

-izolujemy albo DNA albo RNA i przepisujemy na DNA

-sekwencjonujemy ścieżką metagenomiczną wszystko na raz -stosując sekwencjonowanie 2 generacji możemy sprawdzić ile różnych regionów zmiennych mamy w danej populacji - im więcej tym więcej organizmów w tej populacji jest -umiemy hodować i tak tylko ułamek procenta tych mikroorganizmów

-w obrębie danego gatunku zróżnicowanie jest małe 1-2 nt, pomiędzy gatunkami już więcej - można szacunkowo określić ile grup organizmów mamy w próbce -w 1 g ziemi jest około 10 000 gatunków organizmów

-w ciele człowieka jest 10 razy więcej komórek bakteryjnych niż naszych własnych - kim w zasadzie jesteśmy skoro tych komórek bakteryjnych jest tak dużo?

-człowiek ok. 30 000 genów, reszta to sekwencje „milczące”

-organizm ludzki powinno się rozpatrywać całościowo razem z naszymi mikrobraćmi

---