MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA W OCHRONIE ŚRODOWISKA
Ćwiczenie 2
Temat:
Pozyskiwanie mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji związków ksenobiotycznych - identyfikacja szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu katecholu oraz fenolu (cz. 2)
Zagadnienia teoretyczne:
budowa ściany komórkowej bakterii gramdodatnich oraz gramujemnych, barwienie Grama
węglowodory aromatyczne pochodzenia antropogenicznego i ich wpływ na organizmy żywe
drogi rozszczepienia pierścienia aromatycznego (rozszczepienie typu orto i meta)
Część praktyczna:
Materiały:
szkiełka podstawowe
odczynniki do barwienia Grama
sól fizjologiczna, eza
denaturat
testy API 20NE - pokazowe
przygotowane, posiane skosy do założenia hodowli
kolby z płynną pożywką Kojima
sterylne pipety 5 ml
pipety automatyczne, końcówki
0,25 M roztwór fenolu
0,5 M roztwór katecholu
Procedura:
IDENTYFIKACJA SZCZEPÓW BAKTERYJNYCH:
z uzyskanych hodowli płytkowych (cz.1) wybrać pojedyncze kolonie bakterii i oczyścić metodą posiewu redukującego na płytkach z zestalonym bulionem agarowym oraz przesiać na skos agarowy. Inkubować 48 godzin.
Ze skosu oraz z płytki posianej redukcyjnie pobrać niewielką ilość materiału i wykonać rozmaz, na podstawie barwienia metodą Grama zaklasyfikować wyizolowane bakterie do grupy bakterii gramujemnych lub gramdodatnich.
ODCZYT PRZYGOTOWANYCH TESTÓW API 20 NE:
przeprowadzono charakterystykę biochemiczną i fizjologiczną wybranych szczepów G(-), wyizolowanych z prób środowiskowych, w oparciu o test kodowy API 20 NE firmy BioMerieux Marcy I'Etoile (Francja), który służy do oznaczania pałeczek gramujemnych, nie należących do rodziny Enterobacteriaceae. Test wykonano zgodnie z instrukcjami i w oparciu o odczynniki, podane przez producenta
po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 30oC należy odczytać wynik w postaci siedmiocyfrowego kodu, odpowiadającemu poszczególnym rodzajom i gatunkom bakterii, opisanym w katalogu API 20 NE.
ZAŁOŻENIE HODOWLI:
bakterie wyrosłe na skosach agarowych w sterylnych warunkach spłukać do kolby zawierającej pożywkę Kojima.
oznaczyć spektrofotometrycznie gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 600 nm wobec próby ślepej (wody destylowanej).
do każdej kolby dodać odpowiednio taką objętość 0,25 M roztworu fenolu lub 0,5 M katecholu aby stężenie substratu w kolbie wynosiło 5 mM (objętość podłoża wynosi 100 ml).
hodowlę prowadzić przez tydzień.
LITERATURA ŹRÓDŁOWA:
KUNICKI-GOLDFINGER W.: „Życie bakterii” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005
CHMIEL A.: „Biotechnologia - podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1998
RÓŻALSKI A.: „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej” - Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 1996
SCHLEGEL G. H.: „Mikrobiologia ogólna” - Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003
Źródła internetowe