Bakteriofag λ
Wiron złożony jest z dwu części: kubicznej główki i cienkiego niekurczliwego ogonka zakończonego cienkim centralnie położonym włókienkiem. Brak płytki podstawowej i charakterystycznych wypustek jak u faga T- parzystego. Wirionowy DNA to liniowa, 2-niciowa cząsteczka- 57 genów o komplementarnych końcach. Na obu końcach występują jednoniciowy, wzajemnie komplementarne odcinki DNA w skład których wchodzi po 12 par zasad. Dzięki obecności tych tzw. lepkich końców po przedostaniu się do komórki, DNA tego wirusa ulega cyrkulacji i za pośrednictwem ligazy jest łączone i we wczesnych stadiach zakażenia występuje w postaci kołowej.
Ogonek bierze udział w rozpoznawaniu swoistych receptorów na powierzchni komórki, po czym DNA zostaje wstrzyknięty do komórki.
Ten bakteriofag jest prototypem tzw. wirusa lizogenicznego, tzn. takiego który może wystąpić w zakażonej komórce w postaci utajonej tzn. wbudować się do komórki gospodarza jako tzw. profag i wraz z chromosomem bakteryjnym być przekazywanym komórkom potomnym. Nie prowadzi do zaburzeń metabolizmu komórki.
Komórkę w której chromosomie znajduje się bakteriofag lambda, nazywamy komórkę lizogenią a faga, łagodnym lub lizogennym.
Genom wirusowy ulega integracji poprzez rekombinację między swoistymi odcinkami DNA faga lambda i E. Coli zwanymi miejscami wiążącymi. Stwierdzono, że w genomie faga lambda i bakterii E. Coli występuje wspólna sekwencja 15 nukleotydowa, która służy do utworzenia kompleksu między rekombinującymi nićmi DNA faga lambda i E. Coli. Są tez odpowiednie rejony łatwo ulegające rozpleceniu co znacznie ułatwia rekombinację .
Bakteriofag ten może również w komórce namnażać się i powodować jej lizę.
O losach bakteriofaga lambda decyduje wczesne stadium zakażenia. DNA faga ulega w komórce gospodarza cyrkulacji. Ta kołowa forma ulega wczesnej replikacji i powstaje kilka kopii genu. Następnie w fazie transkrypcji powstaje mRNA dla konkretnych białek. Miedzy innymi powstaje represor faga lambda, który wiążąc się z genomem hamuje transkrypcję wszystkich mRNA poza informacyjnym dla syntezy białka represora, powstaje enzym biorący udział w integracji genomu profaga z chromosomem.
Z drugiej strony mogą powstać białka antagonistyczne, hamujące gen białka represora i wtedy wirus odbywa normalny cykl lityczny, który przebiega podobnie jak u innych bakteriofagów.
- faza replikacji zgodnie z mechanizmem toczącego się koła
III faza- synteza białek strukturalnych
IV faza- kompletowanie cząsteczek potomnych
Komórka bakterii która w swoim genomie posiada bakteriofaga w stanie profaga nie luega zakażeniu przez inne bakteriofagi.
Profag w pewnych warunkach ulega indukcji, najczęściej pod wpływem czynników niekorzystnych dla bakterii np. temperatura, promieniowanie, szok toniczny. Komórka uruchamia mechanizm obronny, syntetyzuje enzymy inaktywujące wszystkie represory w komórce przez proteazy komórkowe. Wtedy genom profaga ulega transkrypcji. Są tworzone enzymy biorące udział w wycięciu profaga i litycznym rozwoju wirusa.
Z taką indukcją bakteriofaga wiąże się zjawisko tzw. transdukcji. Bakteriofag może być niedokładnie wycięty i zabrać część materiału genetycznego do innej komórki i przenieść nowe cechy np. lekooporność.
Bakteriofag może też dać komórce nowe właściwości wtedy znajduje się w chromosomie- tzw. konwersja lizogeniczna. Np. maczugowiec błonicy jest chorobotwórczy kiedy posiada faga lizogenicznego, bo wytwarza toksyny.
Bakteriofagi- mechanizmy replikacji, składanie fagów o złożonej strukturze i uwalnianie cząstek fagowych.
Jednoniciowy DNA b-fagów zawsze jest przekształcany w kolistą formę DNA, a następnie jest replikowany podobnie jak DNA dwuniciowy. Wytworzenie formy kolistej DNA- jest to ochrona przed działaniem egzonukleaz komórkowych i ułatwienie ewentualnej integracji DAN profaga z chromosomem komórki.
Tworzenie form kolistych odbywa się na drodze specyficznych mechanizmów inicjacji i elongacji. Przekształcenie do formy kolistej odbywa się dzięki obecności na końcach DNA jednoniciowego komplementarnych sekwencji (tzw. miejsca cos, lepkie końce). W czasie replikacji kolistych form DNA powstają struktury konkatamerowe, odpowiadające wielu kopiom DNA, które ulega cięciu do form pełnogenomowych.
Genom wszystkich fagów posiadających ogonek jest zbudowany z liniowego dsDNA. Proces ich namanżania prowadzi na ogół do lizy komórki.
Cykl lityczny tych fagów obejmuje:
Adsorpcję
Wprowadzanie genomu do cytoplazmy
Transkrypcję
Translację
Replikację DNA
Morfogenezę
Składanie cząsteczek wirusowych i ich uwalnianie
Proces transkrypcji obejmuje zwykle 3 częściowo nakładające się etapy- wczesny, średni i późny.
Wczesny: ekspresja genów kodujących białka przygotowujące komórkę do namanżania faga. Zahamowanie syntezy makrocząsteczek komórkowych, degradacja DNA gospodarza, białka związane inicjacją replikacji DNA fagowego, białka regulacyjne. Większość fagów wykorzystuje do syntezy fagowego mRNA komórkową RNA zależną polimerazę RNA.
Średni: białka związane z replikacją genomowego DNA, ich aktywność jest kontrolowana przez geny fagowe.
Późny: białka strukturalne, lityczne oraz związane z pakowaniem i składaniem cząstek fagowych
Składanie cząsteczek fagowych o złożonej strukturze
W początkowym okresie morfogenezy składanie główek fagowych i struktur ogonka przebiega oddzielnie, dopiero w końcowej fazie następuje ich łączenie się. Proces morfogenezy obejmuje również pakowanie DNA. Najpierw powstają pregłówki, które są zawsze okrągłe o grubych ścianach. W wyniku cięcia proteolitycznego głównego białka kapsydu pregłówki ulegają rozciągnięciu przyjmując typową strukturę o cienkich ścianach.
Pakowanie DNA do główek fagowych jest ostatnim etapem ich tworzenia. Pregłówki zawierają białko łącznikowe i enzym tnący DNA- terminaza. Siłą motoryczną jest rozszerzanie się główki, ruchy obrotowe białka łącznikowego i terminazy.
Terminazy to specyficzne białka które łączą się z DNA i tną w specyficznych miejscach ułatwiających translokację do główki fagowej przez specjalny otwór utworzony przez białko wejściowe. Koniec DNA jest pakowany jako ostatni, ale jest pierwszym wprowadzanym do komórki. Pakowanie odbywa się do momentu wypełnienia główki.
Uwalnianie cząsteczek fagowych z komórki
Dwa podstawowe mechanizmy: fagi, które uwalniają genom w postaci dsDNA kodują dwa białka endolizynę degradującą mureinę ściany komórkowej oraz holinę, która ułatwia transport endolizyny do ściany komórkowej. W momencie rozpoczęcia degradacji ścinany komórkowej następuje liza komórek co jest wywołane działaniem siły osmotycznej.
Druga grupę stanowią taki fagi jak ØX174 kodujące tylko jeden gen- białko lityczne E nie degraduje ściany komórkowej tylko hamuje syntezę mureiny. Jeszcze inne fagi degradują ścianę komórek w sposób dokładnie jeszcze nie poznany.
Bardzo ważna jest regulacja procesu lizy komórki, zbyt wczesna liza prowadzi do zahamowania najbardziej produktywnej części cyklu komórkowego, jakim jest składanie cząstek fagowych. Z drugiej strony zbyt późna liza- utrata możliwości zakażania następnych komórek. Istnieje presja na optymalny moment lizy.
Fagi jako modele do badań w zakresie biologii molekularnej: szybkie namnażanie i bardzo prosta budowa (białko i kwas nukleinowy). Badania nad fagami umożliwiły uzyskanie cennych, podstawowych informacji w zakresie wirusologii, biologii molekularnej a szczególnie genetyki:
Dowód roli kwasów nukleinowych ( zarówno DNA jak i RNA) jako jedynego nośnika informacji genetycznej
Poznano ich morfologie, cechy chemiczne i funkcjonalne
Poznano szczegółowo ich genomy co dało początek poznawaniu genomów organizmów wyższych
Znalazły zastosowanie jako wektory w inżynierii genetycznej
Znaczenie bakteriofagów
Naturalne oczyszczenie środowiska z bakterii- dotyczy to tez organizmu człowieka i zwierząt
Metoda izotypii do typowania bakterii- wykorzystywana bardzo duża swoistość bakteriofagów
Izotypia w dochodzeniach epidemiologicznych, ustalenie źródeł zakażenia- wykrywanie nosicieli zarazków
W terapii chorób bakteryjnych ludzi i zwierząt (wolno narasta oporność na bakteriofagi). Nie mogą być stosowane bakteriofagi, które mają geny dla toksyn i łatwo ulegają zjawisku lizogenii
W zwalczaniu infekcji roślin wywołanych przez fitopatogenne bakterie
Do walki z drobnoustrojami np. Salmonella czy E. Coli w przemyśle spożywczym
W inżynierii genetycznej do syntezy różnych substancji biologicznych
Ujemne działanie
Bakteriofagi mogą być przyczyną dużych strat w przemyśle serowarskim, mleczarskim, winnym ponieważ mogą niszczyć bakterie i grzyby zaangażowane w procesy fermentacji.
Skutki biologiczne cyklu lizogenicznego- są bardzo poważne i różnorodne gdyż kwas nukleinowy faga zostaje inkorpowany do materiału genetycznego komórki bakteryjnej, a ponadto fag może przekazywać bakterii biorcy chromosomalnie i pozachromosomalne elementy biorcy zabrane z bakterii biorcy
Dwa zjawiska:
Transdukcja- przeniesienie przez faga fragmentów materiału genetycznego komórki dawcy do komórki biorcy
Konwersja lizogeniczna- oddanie komórki biorcy części własnego materiału genetycznego faga
Oba te zjawiska powodują ważne z punktu widzenia lekarskiego zmiany właściwości bakterii:
wzrost zjadliwości bakterii np. u maczugowca błonicy wskutek przekazania informacji własnej faga pojawia się nowa cecha- zdolność produkowania toksyn (zjawisko to spotyka się u innych bakterii np. Clostridium, mykoplazm)
Powstanie lekooporności (przeniesienie genu, oporności na dany chemioterapeutyk)
Zmiana właściwości biochemicznych bakterii- trudności diagnostyczne
Zmiana właściwości antygenowych bakterii
Bakterie w stanie lizogenii nie są wrażliwe na zakażenie fagami zjadliwymi tego samego gatunku. A więc te ostanie nie wywierają ograniczającego wpływu na liczebność takich bakterii w danym środowisku.
Obecność fagów w żywych szczepionkach, może zmieniać właściwości bakterii jak też niszczyć je.
Wykorzystanie bakteriofagów w leczeniu chorób człowieka i zwierząt
Zalety:
Wybiórcze działanie na określony gatunek a nawet typ fagowy zarazka przy braku wpływu na komórki leczonego organizmu
Wybiórcze działania bakteriofagów nie uszkadza fizjologicznej flory organizmu
Szybko uzyskuje się poziom terapeutyczny bakteriofagów i długo utrzymuje się w organizmie, ponieważ bakteriofagi się namnażają
Z chwilą zniszczenia bakterii bakteriofagi są eliminowane z organizmu
Bakteriofagi mogą się rozprzestrzeniać na nie leczone zwierzęta będące w kontakcie z leczonymi, co ułatwia zapobieganie i leczenie zakażeń bakteryjnych
Mutacje bakterii w kierunku oporności na bakteriofagi zachodzą rzadziej aniżeli na antybiotyki
Brak oporności krzyżowej na bakteriofagi i antybiotyki, a także równoczesne pojawienie się oporności na antybiotyki i bakteriofagi jest bardzo małe
Możliwość stosowania kompozycji dwóch fagów lub stosowania enzymów produkowanych przez bakteriofagi zamiast bakteriofagów
Możliwość stosowania bakteriofagów łącznie z antybiotykami
Istnieje możliwość wyprodukowania tzw. „koktajlów bakteriofagowych” cechujących się szerszym spektrum działania przeciwbakteryjnego, jak super bakteriofaga który cechuje się selektywnym niszczeniem równocześnie kilku gatunków bakterii i szczepów bakterii
Brak reakcji alergicznych przy stosowaniu leczenia bakteriofagami
Ograniczenia terapii fagami:
Nie można wykluczyć replikacji bakteriofagów w komórkach ssaków
Mogą wywierać niekorzystne działanie na efekty uodparniania przy stosowaniu żywych atenuowanych szczepionek
Wystąpienie zjawiska transdukcji- przekazywanie genów z komórki do komórki ( lekooporność, zjadliwość, inwazyjność)
Bakteriofagi wzbudzają wytwarzanie przeciwciał przeciwko ich antygenom, które pojawiają się po kilku tygodniach i mogą interferować z fagami w przypadku terapii fagowej trwającej kilka do kilu tygodni
Z terapii muszą być wykluczone bakteriofagi które posiadają geny o dużym stopniu homologii ze znanymi genami lekooporności bakterii, czy też geny kodujące toksyny lub czynniki wirulencji, a także takie które łatwo poddają się lizogenii
Przy masowym zabijaniu bakterii prze bakteriofagi uwalniane endotoksyny mogą wpływać niekorzystnie na organizm ( wzrost temperatury ciała, bóle wątroby)
Perspektywy, stosowanie terapii genowej
Fagi będą zapewne stosowane jako leki ostatniego ratunku w leczeniu infekcji opornej na antybiotyki. U zwierząt gdzie konieczny jest okres karencji nie będzie potrzeby oznaczania pozostałości leków.