WYKŁAD 2 7.03.2011
TECHNIKI IMMULOGICZNE W BADANIU BIAŁEK:
• Białka można lokalizować i oznaczać ilościowo stosując test immunologiczny w stałym podłożu
• Wykrycie określonego białka i jego izolacja
Struktura białka determinuje jego funkcję, ponieważ specyficzność miejsc aktywnych i miejsc wiązania zależy od precyzyjnej konstrukcji białka
KRYSTALOGRAFIA RENTGENOWSKA - izolowanie biomolekuł i organelli, określanie struktury biomolekuł, analiza funkcji i metabolizmu biomolekuł.
BLONA BIOLOGICZNA. KANAŁY RECEPTORY BŁONOWE
Komórka przez cały czas musi mieć kontakt ze środowiskiem zewnętrznym.
Błona komórkowa m.in. izoluje wnętrze komórki od ;przestrzeni pozakomórkowej, służy do transportu, rozpoznawania hormonów.
Błona komórkowa jest to mieszanina wody i fosfolipidów. Umożliwia utrzymywanie gradientu stężeń pewnych metabolitów pomiędzy komórką i jej środowiskiem oraz pomiędzy poszczególnymi przedziałami komórki.
Elementy składowe błony pełnią funkcję transportowa komórki (selektywność błony)
Błona komórkowa posiada wysoki współczynnik oporu elektrycznego i zachowuje się jak kondensator.
Zasadniczą funkcją każdej błony komórkowej jest tworzenie bariery kontrolującej przechodzenie cząsteczek pomiędzy komórka a jej środowiskiem lub pomiędzy przedziałami komórkowymi, które oddziela.
KANAŁY - ważne struktury błony komórkowej (przykład to pompa sodowo-potasowa)
KANAŁY JONOWE = białka przechodzące przez błonę, które tworzą błonę
Kanały:
• Są zbudowane z kilku podjednostek
• Selektywne
• Zmieniają konformację
• Nie są statyczne
Kanały jonowe mogą reagować na bodźce chemiczne, termiczne, mechaniczne lub mogą być sterowane przez napięcie.
Wyróżniamy kanały: sodowe, potasowe, wapniowe.
Nie można wykluczyć, że wszystkie kanały nie pochodzą od jednego wspólnego kanału.
Kanały można zablokować i aktywować.
TETRODOKSYNA - blokuje kanały sodowe aktywowane napięciem.
TEA - blokuje kanały potasowe aktywowane napięciem
KANALOPATIE - genetyczne defekty kanałów jonowych (np. mukowiscydoza - błąd kanału chlorowego)
KANALOPATIE dzielimy na:
• Mutacje genów kodujących kanały sodowe
*system nerwowy *mięśnie szkieletowe *mięsień sercowy
• Mutacje genów koordynujących kanały potasowe
*system nerwowy *mięsień sercowy
Kanały chlorowe znajdują się w mięśniach kręgowców trzy razy częściej niż potasowe, one umożliwiają w dużym stopniu repolaryzację potencjału czynnościowego.
Podczas repolaryzacji komórek mięśniowych dochodzi do przemieszczenia się jonów chloru, co pomaga ustabilizować potencjał membranowy.

METODA PATCH - CLAMP
Erwin Neher i Bert Sackmann z Getyngi opracowali metodę umożliwiającą pomiar prądów generowanych tylko w jednym kanale.
Przykładamy pipetą do komórki i badamy kanał. Żeby zbadać odpowiedni kanał odseparować odpowiednie mRNA dla danego kanału. Wyizolowane mRNA wstrzykujemy do oocytu (np. żaby), uzyskujemy odpowiedni kanał.
Kanałami można sterować (bramkowanie kanału). Kanał można zamknąć lub otworzyć impulsem elektrycznym pochodzącym z depolaryzacji. Bramkować można też za pomocą ligandów (glutamina, acetylocholina, itp.). Inna możliwość to naciąganie, rozciąganie błony komórkowej (bodziec mechaniczny).
Metabolity wewnątrzkomórkowe (m.in. ATP) również wpływają na kanały, tak samo jak substancje sygnałowe wewnątrzkomórkowe (cAMP, Comp, kinezy tyrozynowe).
Leki znane jako „oralne antydiabetika” stymulują wyrzut insuliny poprzez bezpośrednie zablokowanie kanału potasowego wrażliwego na ATP.
Wydzielanie insuliny jest regulowane przez poziom glukozy. Glukoza pobierana jest przez komórki beta-trzustki i tam metabolizowana. Wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, powoduje wydzielanie insuliny.

Połączenia szczelinowe (kanały międzykomórkowe = kanały łączące komórki = cell) umożliwiają przepływ Janów i małych cząsteczek między komunikującymi się komórkami.
• Kanał międzykomórkowy jest zbudowany z 12 cząsteczek koneksyny (białko)
• Kanały międzykomórkowe przechodzą przez dwie błony
• Łączą cytozol jednej komórki z cytozolem drugiej komórki
• Utworzony kanał z reguły pozostaje otwarty przez kilka sekund, a nawet minut
• Połączenia szczelinowe powstają łatwo, gdy komórki zestawione są ze sobą
• Duże stężenie jonów wapnia oraz niskie pH powoduje zamknięcie kanału
Komórką pobudliwą (wytwarzającą potencjał czynnościowy) jest neuron.
MECHANIZMY TRANSPORTU
• Aktywne
• Pasywne
*różnica stężeń *napięcie elektryczne *ciśnienie hydrostatyczne

TRANSPORTERY A KANAŁY:
• W transporterach jest ściśle przyporządkowana liczba jonów i kierunek transportu
• Są „wysycane” to znaczy maja określoną maksymalna zdolność transportową
• Są mniej lub bardziej specyficzne
• Ulegają zahamowaniu, gdy zakłócone jest zapotrzebowanie komórki w energię
Digitalis (odmiana rośliny) zwiększa siłę skurczu mięśnia sercowego, hamuje pompę sodowo-potasową.
Transport pierwotnie AKTYWNY - pompa ATP, zużycie energii
Transport wtórnie aktywny za pomocą przenośników sprzężony jest z biernym transportem jakiegoś jonu.

TRANSPORT Z UDZIAŁEM RUCHU BŁON:
• Endocytoza - proces dzięki któremu komórki pobierają duże cząsteczki. Endocytoza stanowi mechanizm regulujący zawartość niektórych składników błon (utrata błony)
*pinocytoza - właściwość wszystkich komórek umożliwiająca pobieranie przez komórkę płynów i ich zawartości
*fagocytoza - pochłanianie dużych cząsteczek (np.: komórek bakterii)
• Egzocytoza - proces wydalania różnych substancji hydrofilnych zawartych w cytoplazmatycznych pęcherzach błoniastych

WYKŁAD 3 14.03.2011

Mechanizmy uwalniania transmiterów (acetycholiny)

Integracja i regulacja metabolizmu

Główne sygnały metabolizmu. Sygnałem może być:
*niedobór lub nadmiar pewnych substratów
*stosunek ATP do ADP
*niedobór lub nadmiar enzymów
*obecność inhibitorów i aktywatorów różnych enzymów
*stężenia wapnia w cytozolu
*stosunek sodu i do potasu
*fosforylacja lub defosforylacja białek
*hamowanie zwrotne przez produkty końcowe pewnych procesów

Procesy sygnałowe w komórkach obejmują 4 kroki:
*pozakomórkowo prezentowanie sygnałów
*przyjęcie sygnału poza komórką
*przekazanie sygnału wewnątrz komórki ----- kaskady sygnałowe
*fizjologiczne przełożenie informacji sygnałowej ----- ekspansja genów, wewnątrzkomórkowe sieci sygnałowe

Podstawowe rodzaje komunikacji międzykomórkowej
1) Transmisje synaptyczne - związek sygnałowy pokonuje odcinek synaptycznej , dominuje w układzie nerwowym
2) Transmisje perakrynowe - komórki efektorowe znajdują się w bliskim sąsiedztwie komórek sygnałowych
3) Transmisje hormonalne - związki sygnałowe są wydzielane przez komórki gruczołów endokrynowych do układu krążenia

LIGANDY I RECEPTORY
Związki specyficzne łączące się z receptorami nazywamy ligandami. Są to zarówno naturalne substancje sygnałowe jak i związki egzogenne o takiej budowie chemicznej, która umożliwia ich związanie z określonym typem receptora.

Ligandy pobudzające receptory nazywamy agonistami, a ligandy blokujące receptory antagonistami.

Cechą charakterystyczna zarówno agonisty jak i antagonisty jest wysokie powinowactwo do receptora. Oznacza ono, że ligandy te zastosowane w niskich stężeniach specyficznie wiążą się z receptorem.

Zasadnicza cechą odróżniającą agonistę od antagonisty jest tzw. aktywność wewnętrzna.

Receptory ze względu na lokalizację dzielimy na:
*wbudowane w błonę *występujące w cytoplazmie

Klasyfikacja receptorów:
a) bezpośrednio związane z kanałami jonowymi
b) związane z układem efektorowym
c)sprzężone z białkami G

Białka G, trimeryczne białka G, heterotrimeryczne białka G, białka błon biologicznych występujące w komórkach organizmów eukariotycznych (jądrowych), będące przekaźnikami sygnałów, powstających w wyniku bodźców zewnątrzkomórkowych (m.in. wskutek działania większości hormonów czy też czynników fizycznych, takich jak np. światło, albo mediatorów nerwowych), do białek efektorowych, tj. m.in. do białek regulujących funkcje kanałów jonowych oraz do enzymów katalizujących powstawanie lub rozpad in. enzymów przekazujących sygnały (tzn. cyklazy adenylowej, fosfolipaz, fosfodiesterazy cyklicznego GMP - guanozynomonofosforanu).

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią najliczniejszą a zarazem najbardziej zróżnicowaną pod względem ligandów rodzinę receptorów białkowych odpowiedzialnych za przenoszenie sygnałów do wnętrza komórki. Pośredniczą one zarówno w rozpoznawaniu bodźców środowiskowych takich jak: światło, zapach i smak, jak również uczestniczą w szlakach sygnałowych hormonów i innych cząsteczek.

Białka G maja aktywność GTPazy; hamują działanie cyklazy adenlowej zmniejszając wytwarzanie cAMP.

Zaburzenia w metabolizmie białka G występują takich schorzeniach, jak:
*rzekoma niedoczynność tarczycy *cholera *krztusiec

Cholera - ostra i zaraźliwa choroba zakaźna przewodu pokarmowego, której przyczyną jest spożycie pokarmu lub wody skażonej Gram-ujemną bakterią - szczepami przecinkowca cholery produkującego enterotoksynę.

Cholera jest spowodowana zmianą aktywnością białka G. Mechanizm działania toksyny cholery:
*ostra biegunka - wywołuje obfite wydzielanie elektrolitów i płynów z jelit zainfekowanej osoby.

---