Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.
Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery (primery), oraz termostabilną polimerazę DNA - polimeraza Taq
Primery (startery) są krótkimi (zazwyczaj 18-24 nukleotydów długości), jednoniciowymi fragmentami DNA, które łączą się z komplementarnym fragmentem DNA i umożliwiają polimerazie DNA rozpoczęcie reakcji.
Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja podwójnej helisy DNA, która zachodzi w temperaturze ok. 95˚C. Następnie temperatura jest obniżana do ok. 50˚C, co umożliwia połączenie się primerów z komplementarnymi sekwencjami. W końcu, temperatura jest podnoszona do ok. 72˚C i rozpoczyna się reakcja polimeryzacji, w wyniku której powielany jest fragment zawarty pomiędzy dwoma primerami. Ta sekwencja cykli jest powtarzana wiele razy, w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać.
Enzymy restrykcyjne, restryktazy, enzymy z grupy endonukleaz, wykazujące dużą specyficzność substratową. Rozpoznają one specyficzne, krótkie sekwencje nukleotydowe (zwykle 4 do 6 par zasad) i przecinają nici DNA (kwasy nukleinowe) w obrębie sekwencji (z reguły są to sekwencje palindromowe) (lub w pewnej od niej odległości) w ściśle określonych miejscach. Występują w komórkach bakteryjnych, gdzie służą do niszczenia obcego DNA, np. bakteriofagowego.
Odwrotna transkrypcja - wywoływany przez wirusy proces odtwarzania komplementarnej cząsteczki DNA na matrycy RNA wirusa, przez enzym zwanym odwrotną transkryptazą (wirusowa polimeraza DNA).
Odwrotna transkryptaza, rewertaza, polimeraza DNA zależna od RNA - enzym syntetyzujący nić DNA na matrycy RNA, występuje u retrowirusów.
Organizmy Modyfikowane Genetycznie - GMO (z ang. Genetically Modified Organism) - Organizmy Transgeniczne - są to organizmy które zawierają w swoim genomie (czyli informacji genetycznej organizmu) obce geny, pochodzące z obcego organizmu.
Ogólnie mówiąc modyfikacja polega na wszczepieniu do genomu modyfikowanego organizmu fragmentu DNA z innego organizmu, który odpowiedzialny jest za daną cechę, lub też na modyfikacji genu, lub usunięciu go całkowicie z organizmu.
Przenoszony gen to tzn. transgen - stąd organizmy transgeniczne. Po przeniesieniu transgenu jest on na stałe włączony do genomu gospodarza i od tej pory już będzie obecny u wszystkich organizmach potomnych - nie utraci transgenu.
W Ustawie o GMO zapisana jest definicja:
Organizm modyfikowany genetycznie to organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób nie zachodzący w warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji, w szczególności przy zastosowaniu:
- technik rekombinacji DNA z użyciem wektorów, w tym tworzenia materiału genetycznego poprzez włączenie do wirusa, plazmidu lub każdego innego wektora cząsteczek DNA wytworzonych poza organizmem i włączenie ich do organizmu biorcy, w którym w warunkach naturalnych nie występują, ale w którym są zdolne do ciągłego powielania,
- technik stosujących bezpośrednie włączenie materiału dziedzicznego przygotowanego poza organizmem, a w szczególności: mikroiniekcji, makroiniekcji i mikrokapsułkowania,
- metod niewystępujących w przyrodzie dla połączenia materiału genetycznego co najmniej dwóch różnych komórek, gdzie w wyniku zastosowanej procedury powstaje nowa komórka zdolna do przekazywania swego materiału genetycznego odmiennego od materiału wyjściowego komórkom potomnym.
Plazmidy bakteryjne to koliste, dwuniciowe cząsteczki DNA. Mają one miejsce startu replikacji DNA oraz geny kodujące białka niezbędne do tego procesu. Niektóre plazmidy powielają się tak wydajnie, że w każdej komórce powstaje kilka tysięcy kopii plazmidowego DNA. Plazmidy decydują o oporności na jeden lub kilka antybiotyków, dzięki genom kodującym białka, które zmieniają odpowiedź komórki na dany antybiotyk. Niektóre geny plazmidowe kodują enzymy rozkładające lub w inny sposób modyfikujące cząsteczki antybiotyku. Przykładem jest enzym degradujący penicylinę. Inne geny oporności działają odmiennie. Oporność na tetracyklinę, na przykład, wynika z wytwarzania białka, które utrudnia komórkom bakteryjnym pobieranie tetracykliny ze środowiska.
Plazmidy bakteryjne wykorzystuje się do namnażania wstawek obcego DNA
Plazmidowy DNA można łatwo wydzielić z hodowli komórek bakteryjnych w znacznych (miligramowych) ilościach i w czystej postaci. Ponieważ plazmidy mogą powielać się w komórkach, poświęcono wiele wysiłku na opracowanie metod umożliwających wykorzystanie ich jako wektorów wprowadzających nowe fragmenty DNA do komórek. Łączenie DNA plazmidu z DNA wstawki można przeprowadzić w roztworze, w probówce, podobnie jak łączenie wstawki z wektorem fagowym. Aby jednak sklonować te wstawki, należy wprowadzić zrekombinowane plazmidy do komórek, w których będą one mogły się powielać. Ale w odróżnieniu od fagów, które wnikają do bakterii wprost z pożywki, plazmidy są przekazywane z jednej komórki do drugiej. Opracowano jednak techniki ułatwiające wprowadzanie plazmidowego DNA do określonych komórek bakteryjnych bezpośrednio z otaczającego je roztworu. Dysponując takimi metodami, można pojedyncze komórki transformować zrekombinowanym plazmidowym DNA, a następnie wyhodować pojedyncze kolonie zawierające nowe sklonowane cząsteczki zrekombinowanego DNA. Należy zaznaczyć, że ponieważ każda komórka gospodarza pobiera jeden plazmid, każda kolonia ma tylko jeden rodzaj zrekombinowanego plazmidu. Ponieważ wiele wektorów plazmidowych ma zaledwie kilka tysięcy par zasad, wzbogacenie ich w nowy gen, fragment eukariotycznego DNA jest jeszcze znaczniejsze niż w przypadku wektorów fagowych. Plazmidy były pierwszymi wektorami, jakie wykorzystano do molekularnego klonowania DNA w bakteriach.