Adam Łapiński
Maciej Płoński gr.10
Sprawozdanie nr 4
Temat: Metodyka badań mikroorganizmów. Metody posiewu na podłoża płynne i stałe.
Cel:
Posiew bakterii na podłoża płynne i stałe. Określenie ilości kolonii bakterii w 1cm3 podłoża. Określenie wzrostu na podłożach płynnych i stałych.
Wstęp teoretyczny:
Metody określania liczebności organizmów:
1. Metody pośrednie
a) metoda płytkowa Koha polega na wykonaniu szeregu rozcięczeń danej próby oraz wykonaniu posiewu na podłoże stałe. Próbki inkubuje się w określonej temperaturze, a następnie liczy się wyrosłe kolonie przy założeniu, że z jednej komórki wyrosła pojedyncza kolonia
ZALETY: względna prostota, liczy się i uzyskuje jedynie żywe komórki
WADY: nie zawsze kolonia wyrasta z pojedynczej komórki, nie ma idealnego podłoża na którym wyrosłyby wszystkie bakterie
b)metoda nefelometryczna polega na pomiarze mętności hodowli bakterii i porównaniu z próbką wzorcową .
ZALETY: szybkie uzyskanie wyniku
WADY: nie możemy stosować tej metody w przypadku podłoży mętnych i barwnych
2. Metody bezpośrednie
a)liczenie w różnego rodzaju komorach pod mikroskopem biologicznym lub mikroskopem z kontrastem fazowym
WADY: liczone są martwe i żywe komórki (tylko w mikroskopie fluorescencyjnym można odróżnić komórki żywe od martwych)
b) liczenia bakterii na filtrach membranowych po uprzednim przesączeniu próby i zabarwieniu. Po dodaniu olejku imersyjnego filtr staje się przezroczysty i można policzyć bakterie.
Sposób wykonania ćwiczenia:
-wykonujemy szereg rozcieńczeń próby zawierającej bakterie w następujący sposób:
Do 5 próbówek wprowadzamy po 9ml wody jałowej, do I próbówki wprowadzamy pipetą 1ml badanej próby, po wymieszaniu wprowadzamy do II próbówki 1ml z próbówki I, następnie do próbówki III 1 ml z próbówki II, analogicznie postępujemy z pozostałymi próbówkami. W ten sposób otrzymaliśmy następujące rozcieńczenia badanej próbki:
10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5.
- wykonujemy posiew na skos agarowy zawarty w próbówce za pomocą oczka bakteriologicznego,
- wykonujemy posiew na bulion zawarty w próbówce za pomocą pipety wlewając 1ml roztworu o stężeniu 10-2,
- wykonujemy posiew na płytkach Petriego dwoma sposobami:
1) Posiew głębinowy - do 4 pustych płytek Petriego wprowadziliśmy po 1ml z rozcieńczeń próby od 10-2 do 10-5 . Po wprowadzeniu wszystkich rozcieńczeń do płytek, podłożem stałym
2) Posiew powierzchniowy- do 4 płytek Petriego z podłożem agarowym wprowadziliśmy po 0,1 ml rozcieńczoń próby od 10-2 do 10-5 i rozprowadziliśmy po powierzchni przy pomocy głaszczki.
- odstawiliśmy nasze posiewy do inkubacji na 7 dni w temperaturze pokojowej
Wszystkie czynności wykonywaliśmy w warunkach jałowych: pipety i oczka bakteriologiczny opalaliśmy nad płomieniem palnika, szklane głaszczki dezynfekowaliśmy w alkoholu następnie je opalając
WYNIKI:
Tabela 1:
Rodzaj posiewu |
Liczba kolonii w ilości badanej próby (cm3) |
Ogólna liczba bakterii w 1cm3 |
|||
|
10-2 |
10-3 |
10-4 |
10-5 |
JTK/1cm3 |
Powierzchniowy |
niepoliczalne |
niepoliczalne |
84 |
8 |
82*105 |
Głębinowy |
niepoliczalne |
niepoliczalne |
niepoliczalne |
77 |
77*105 |
Tabela 2:
Rodzaj podłoża |
Sposób wzrostu na podłożu |
Bulion |
Błonka na powierzchni, ogólne zmętnienie, osad denny |
Skos agarowy |
Wzrost wzdłuż linni posiewu |
Obliczenie ogólnej liczby bakterii w 1cm3 dla posiewu powierzchniowego : (84*104*10+8*105*10)/2=82*105
Obliczenie ogólnej liczby bakterii w 1cm3 dla posiewu głębionowego:
77*105
Tabela 3 przedstawiająca wyniki grupy sąsiedniej:
Rodzaj posiewu |
Liczba kolonii w ilości badanej próby (cm3) |
Ogólna liczba bakterii w 1cm3 |
||||
|
10-1 |
10-2 |
10-3 |
10-4 |
10-5 |
JTK/1cm3 |
Powierzchniowy |
niepoliczalne |
niepoliczalne |
69 |
7 |
0 |
6,95*105 |
Głębinowy |
niepoliczalne |
niepoliczalne |
niepoliczalne |
240 |
22 |
2,3*106 |
Wnioski:
W większości stężeń liczba kolonii była niepoliczalna. Mogło na to wpłynąć nieprawidłowe wykonanie posiewu powodujące nie jałowość prób, przez co dostały się do nich bakterie zarówno z powietrza jak i z powierzchni naszego ciała.
Analizując wyniki naszych posiewów z tabeli 1 widzimy, że w przypadku obu metod posiewów otrzymaliśmy zbliżone ilości kolonii , tak jak być powinno.
Jak widzimy sąsiednia grupa otrzymała wyniki różniące się od siebie o rząd wielkości. Przypuszczamy, że błąd nastąpił podczas wykonywania posiewu powierzchniowego, gdyż to właśnie jego wyniki odbiegają znacznie od naszych. Być może wykonali oni posiew nieprawidłową ilością rozcieńczenia prób bakterii lub niedokładnie rozprowadzili rozcieńczenie głaszczką.