1.Wymień techniki analityczne wykorzystywane do oznaczania śladów metali w próbkach środowiskowych.

a. AAS - absorpcyjna spektrometria atomowa

b. fotometria płomieniowa

c. emisyjna spektrometria atomowa

d. ICP - MS - spektrometria mas z jonizacją w plazmie sprzężonej indukcyjnie

2.Najlepszą czułością i najniższymi granicami wykrywalności spośród nich charakteryzuje się technika: ICP - MS

Granice wykrywalności dla tej techniki są na poziomie: ppt

Osiągnięcie takiej czułości jest możliwe dzięki:

a. zastosowaniu pułapek jonów badanych, które umożliwiają wysokoselektywną analizę jonów w zależności od ich stężenia i ładunku

b. jonizacji atomów w plazmie

3. Atomowa spektrometria absorpcyjna to technika pomiarowa oparta na zjawisku absorpcji promieniowania o specyficznej długości fali przez wolne atomy metali. Procedura pomiarowa polega na wprowadzeniu próbki do aparatu, atomizerem, pomiarze absorbancji i obliczeniu na jej podstawie stężenia. (Atomowa spektrometria absorpcyjna to technika pomiarowa oparta na: wykorzystaniu zjawiska absorpcji promieniowania charakterystycznego (o odpowiedniej długości fali) przez wolne atomy oznaczanego pierwiastka. Wielkość absorpcji jest miarą stężenia pierwiastka w badanej próbce).

4. Próbka może być wprowadzona do atomizera w ASA w postaci (Przy każdym punkcie podaj nazwę odmiany techniki ASA):

a. aerozolu FAAS

b. cieczy GFAAS

c. zawiesiny ETAAS

d. ciała stałego ETAAS

5. W jaki sposób w technice spektrometrii cząsteczkowej możesz wyeliminować interferencje pochodzące od nakładania się pasm?

a. zastosowanie promieniowania o max absorpcji dla oznaczanego analitu

b. zastosowanie monochromatorów promieniowania

c. zastosować wydzielanie oznaczanego analitu z matrycy

6. Dzięki jakim rozwiązaniom aparaturowym technice atomowej spektrometrii emisyjnej prowadzić można analizę wielopierwiastkową?

7. Analiza specjacyjna jest to:

Analiza specjacyjna to analiza mająca na celu identyfikację i/lub pomiar zawartości jednej lub kilku form chemicznych pierwiastka w próbie. (Analiza specjacyjna to : ma na celu identyfikację i/lub pomiar zawartości jednej lub kilku form chemicznych pierwiastka występującego w próbce. Jest to inaczej też oznaczanie ilościowe poszczególnych form chemicznych pierwiastka).

8. W analizie specjacyjnej wykorzystuje się techniki sprzężone, tzn:

• technikę chromatografii gazowej ze spektrometrem mas z plazmą generowaną indukcyjnie (GC - ICP - MS, GC - IR, GC - MS)

• są to techniki łączące metody rozdzielania poszczególnych form analitu oraz metody

LC, EC Absorption, QF, QP MASS, ICP, EI

Chromatografia + Spektrometria

• Super… GC Emisyjne fluororescencyjne

9. Jakie rodzaje substancji i z jakich względów znajdują się w obszarze zainteresowań analizy specjacyjnej?

• pierwiastki na różnym stopniu utlenienia

• izotopy pierwiastków

• związki metaloorganiczne

• nieorganiczne związki kompleksowe

Jest to spowodowane występowaniem pierwiastków w różnych formach, różną mobilnością i biodostępnością.

10. W technikach chromatograficznych wykorzystywane są następujące rodzaje oddziaływań pomiędzy agalitem a fazą stacjonarną:

a. adsorpcja

b. powinowactwo jonowe

c. podział substancji między dwie fazy

d.

e.

11. Jakie fazy stacjonarne i fazy ruchome stosowane są w chromatografii odwróconych faz (RP). Do rozdzielania jakich związków zanieczyszczających środowisko stosowana jest ta technika chromatograficzna?

• fazy stacjonarne - niepolarne - węgiel aktywny, Al₂O₃

• fazy ruchome - mieszanina wody i rozpuszczalników organicznych (tzw. modyfikatorów); najczęściej stosowane rozpuszczalniki to acetonitryl, metanol i tetrahydrofuran; polarne - woda, kwas octowy, pirydyna

Chromatografia RP jest używana do rozdzielania związków niepolarnych, np. pestycydów niepolarnych. Służy ona do rozdzielania mieszanin substancji istotnie różniących się właściwościami, zarówno polarnych, średniopolarnych jak i niepolarnych.

12. Jakie rodzaje detektorów stosowane są w technikach chromatograficznych?

• detektor wychwytu elektronów

• detektor fotojonizacyjny

• detektor płomieniowy - FID

• detektor DAD

• detektor masowy MS

• detektor foto - jonizacyjny

• detektor UV - VIS

• detektory konduktometryczne

13. Jednoczesne oznaczanie chloranów (III) (ClO₂^-), chloranów (V) (ClO₃^-), bromianów (V) (BrO₃^-) w wodzie można przeprowadzić metodą: chromatografii gazowej.

14. Kiedy korzystne jest prowadzenie rozdziału chromatograficznego techniką SFC? Jakie są różnice pomiędzy HPLC i SFC?

Chromatografia w stanie nadkrytycznym (SFC) jest korzystna do analizy związków silnie polarnych. SFC jest prowadzona przy pomocy gazu w stanie nadkrytycznym jako fazy ruchomej. Gazem tym może być, np. gaz, który w odpowiednich warunkach ciśnienia i temperatury wykazuje właściwości cieczy i gazu. W HPLC fazą ruchomą stanowi rozpuszczalnik lub ich mieszanina o zdolności elucyjnej odpowiedniej do składników próbki,. Fazy ruchome zmieniają się od niepolarnych cieczy do wodnych roztworów buforowych zmieszanych z rozpuszczalnikiem organicznym. Dlaczego jednak w ostatnich latach tak wiele uwagi poświęcono rozwojowi chromatografii i ekstrakcji w stanie nadkrytycznym? Otóż SFC wypełnia lukę między chromatografią gazową a wysokosprawną chromatogfafią cieczową. Chromatografia gazowa stosowana jest głównie do rozdziału związków termicznie stabilnych, niepolarnych i małocząsteczkowych. Z kolei chromatografia cieczowa może być stosowana do rozdziału związków polarnych, wielkocząsteczkowych, mniej termicznie stabilnych. Główną jednak jej wadą jest brak uniwersalnego detektora, takiego jak np. detektor płomieniowo-jonizacyjny używany w chromatografii gazowej.

SFC posiada zalety zarówno chromatografii cieczowej jak i gazowej. Wykorzystanie CO₂ w stanie nadkrytycznym pozwoliło skrócić czas ekstrakcji do kilku minut w wielu przypadkach, gdzie klasyczna ekstrakcja rozpuszczalnikowa trwała kilka godzin a czasami dni. Wynika to z faktu, że ciecz nadkrytyczna ma własności penetrujące gazów (dużo łatwiej dyfunduje w ciele stałym niż zwykła ciecz), a zarazem ma własności solwatujące cieczy, czyli silniej wiąże się z ekstrahowanymi substancjami niż czynią to gazy. Wykorzystanie CO₂ w stanie nadkrytycznym zwiększa atrakcyjność chromatografii i ekstrakcji, gdyż CO₂ jest nietoksyczny, łatwo dostępny i tani. Zastosowanie CO₂ eliminuje problemy związane z utylizacją rozpuszczalników organicznych, wykorzystywanych w chromatografii cieczowej czy ekstrakcji. Poza tym uzyskanie substancji z roztworu po ekstrakcji odbywa się poprzez zwyczajne zmniejszenie ciśnienia i przemianę CO₂ w gaz. Intensywne prace nad SFC i SFE trwają w laboratoriach od początku lat osiemdziesiątych, lata dziewięcdziesiąte prawdopodobnie przyniosą szerokie zastosowania tych technik w wielu gałęziach przemysłu.

15. Jakie są główne różnice pomiędzy chromatografią jonową i jonowymienną?

• jonowa - szybkie i precyzyjne oznaczanie jonów

Jonowymienna - stosunkowo długi czas trwania oznaczeń

• Jonowa - oznaczanie mieszanin wielu różnych jonów

Jonowymienna - oznaczanie najwyżej kilku jonów

• Jonowa - eluent o niskiej sile jonowej (0,1 - 100 mM)

Jonowymienna - eluent o wysokiej sile jonowej (0,1 - 10 M)

• Jonowa - uniwersalna detekcja konduktometryczna po uprzedniej supresji eluentu

Jonowymienna - detekcja z wykorzystaniem klasycznych metod w zależności od oznaczanego składnika

• Jonowa - próg detekcji ograniczony wartością przewodnictwa oznaczanych jonów

Jonowymienna - próg detekcji ograniczony czułością wybranej metody

• Jonowa - żywice rozdzielające o małej pojemności jonowej

Jonowymienna - żywice rozdzielające o dużej pojemności jonowej

JONOWA JONOWYMIENNA

- słabe eluenty - silne eluenty

- oznaczanie mieszanin - pojedyncze składniki

- duża szybkość analizy - niewielka szybkość analizy

- rożne metody detekcji - detekcja konduktometryczna

- granica wykrywalności ug/l - granica wykrywalności mg/l

- jonity o małej pojemności wymiennej - jonity o dużej pojemności wymiennej

16. W jaki sposób należy przygotować próbki powietrza do analizy dioksyn i PCB?

Zanim przystąpi się do analizy dioksyn i PCB należy wydzielić je z powietrza stosując, np. ekstrakcję do fazy stałej lub mikroekstrakcji SPME. Zatężanie i wydzielenie umożliwia uchronienie przed interferencjami w czasie pomiaru.

17. Na czym polega metoda SPME i do analizy jakich związków może być stosowana?

SPME - mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej - polega na adsorpcji/ absorpcji a następnie desorpcji związków oznaczanych. Adsorpcja i absorpcja zachodzą na włóknie, np. IBHS, CAR, a desorpcja zachodzi już w odpowiedniej aparaturze do pomiaru. SPME może być używana do analizy lotnych związków organicznych w próbkach wody i powietrza, a także do analizy pestycydów i WWA w próbkach gleby.

SPME jest odmianą SPE, umożliwiająca zatężanie śladowych i ultraśladowych ilości analitów w ciekłych lub gazowych próbkach. Sorbentem jest cienka warstwa substancji polimerowej, takiej jak PDMS, naniesiony na włókno z topionej krzemionki, które jest przyczepione do zmodyfikowanej mikrostrzykawki. Włókno styka się z próbką, a następnie zostaje wprowadzone bezpośrednio do dozownika próbki w chromatografie gazowym lub cieczowym. SPME znajduje zastosowanie szczególnie w analizie wody, analizie środków zapachowych i lotnych w żywności przez pobieranie próbek równowagowej fazy nadpowierzchniowej, do monitorowania jakości powietrza w miejscach pracy. SPME - jest to mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej, jest techniką wzbogacania analitów, opartą na sorpcji analitów obecnych np. w fazie ciekłej lub gazowej, na mikrowłókno pokryte warstwą sorbenta chromatograficznego i zamkniętym w mikrostrzykawce. Polega na ekstrakcji substancji organicznych z fazy gazowej lub ciekłej do warstwy adsorpcyjnej osadzonej na włóknie. Metoda ta łączy w sobie pobieranie próbek, wzbogacanie i izolacje oraz eliminuje używanie rozpuszczalników. Może być stosowana do analiz np. LZO

18. Każdy sensor chemiczny składa się z następujących części:

• selektywna membrana (w większości sensorów)

• receptor

• przetwornik (część przetwornikowa, np. elektroda potencjometryczna, spektrometr UV - do zamiany informacji chemicznej na sygnał analityczny)

19. Sygnał analityczny w czujnikach optycznych uzyskuje się w wyniku:

a. w warstwie receptorowej badana wartość jest przetwarzana na sygnał optyczny

b. zamiana informacji chemicznej na sygnał użyteczny analitycznie

c. zajście reakcji oznaczanego analitu z receptorem - informacja chemiczna (np. absorpcja promieniowania lub pomiar luminescencji)

d. Badana wielość polega przetworzeniu w warstwie receptorowej na skorelowany ze stężeniem sygnał optyczny. W warstwie przetwornikowej sygnał zamieniany jest na końcowy sygnał elektryczny.

e. odpowiadają na absorpcję lub fluorescencyjną emisję promieniowania przez anality, wskaźniki lub kompleksy analit - receptor.

20. Sensory optyczne wykorzystywane są w badaniach stanu środowiska do…

Podstawowa różnica pomiędzy sensorem chemicznym a biosensorem polega na….

Podstawowa różnica pomiędzy sensorem chemicznym a biosensorem polega na tym, że biosensory posiadają receptory zbudowane z komórki bakteryjnej, tkanki roślinnej lub zwierzęcej, przeciwciał. Biosensory w przeciwieństwie do sensorów chemicznych są wysoce selektywne i charakteryzują się dużą czułością na mierzony analit; analit łącząc się z receptorem powoduje zaistnienie reakcji chemicznej/ zmiany na receptorze, które następnie jest odbierane na przetwornik i przekształcane na użyteczną analitycznie.

21. W ostatnich latach w analizie środowiska popularne stało się stosowanie metod chemometrycznych. Metody te służą do:

• analizy win

• Analizy oliwy z różnych regionów Włoch

• Analizy porównawczej testów czystości wody

• Wieloparametrowa charakterystyka szczepów bakterii

• Monitorowanie biologicznej oczyszczalni ścieków

Chemometryczne metody służą np.

- identyfikacji źródeł pochodzenia amfetaminy (PCA)

- optymalizacji procedur

- wieloparametrowa analiza szczepów arylobakterii

- analiza win

Metody chemometryczne wykorzystywane są w celu uzyskania maksymalnej ilości informacji użytecznej o obiekcie badań na podstawie analizy danych, z wykorzystaniem takich dziedzin jak: statystyka, rachunek prawdopodobieństwa, matematyka, teoria podejmowania decyzji.

22. Jakie jest chemometryczne podejście do rozwiązywania problemów z zakresu analizy zanieczyszczeń środowiska.

Chemometria - dziedzina chemii wykorzystująca matematykę, statystykę, rachunek prawdopodobieństwa, informatykę oraz teorię podejmowania decyzji do optymalizacji procedur eksperymentalnych w celu uzyskania maksymalnej ilości użytecznej informacji o obiekcie badań na podstawie analizy danych.

Etapy rozwiązywania problemów:

• sformułowanie problemu

• planowanie pomiarów

• wykonanie pomiarów

• przechowywanie i kontrola wyników - eliminacja błędów grubych za pomocą, np. analizy

• wnioskowanie oparte na testach statystycznych

Chromatografia w układzie faz normalnych (NP) - układem faz normalnych nazywa się układ chromatograficzny, w którym faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma, a podstawowym zjawiskiem decydującym o rozdzielaniu jest adsorpcja na powierzchni fazy stacjonarnej.

Fazy stacjonarne:

• 1.

adsorbenty nieorganiczne

-żel krzemionkowy

-tlenek glinu

-tlenek cyrkonu

-siarczan magnezu itp.

• 2.

fazy wiązne- otrzymuje się je w wyniku modyfikacji polarnych sorbentów nieorganicznych np. żelu krzemionkowego za pomocą:

a) związków chemicznych z grupami

- cyjanową

- aminową

- nitrową

- diolową

- fenolową

b) cyklodekstrynami

Faza ruchoma- eluent

Zazwyczaj dobiera się dwuskładnikowa fazę ruchomą stosując rozpuszczalnik o dużej sile elucyjnej (polarny) i rozpuszczalnik niepolarny, o małej sile elucyjnej (“rozcieńczalnik” eluentu). Eluent w układzie faz normalnych składa się z niepolarnego rozpuszczalnika o małej sile elucyjnej. W wielu przypadkach do fazy ruchomej- niepolarnego rozpuszczalnika dodaje się niewielkiej ilości rozpuszczalnika polarnego (ok. 0,1- 2%).

Zastosowanie układu NP

Generalnie można powiedzieć, że chromatografię w układzie faz normalnych (NP), można stosować do rozdzielania związków niejonowych i raczej nisko oraz średnio polarnych, jako alternatywę dla układów faz odwrócony. Bardzo ważne znaczenie praktyczne ma szczególna “zdolność” układów faz normalnych do wysoce selektywnego rozdzielania izomerów strukturalnych, a w przypadku stosowania chiralnych faz stacjonarnych, do rozdzielanie izomerów optycznych. Na podkreślenie zasługuje zdolność adsorbentów do rozróżniania substancji pod względem polarności grup funkcyjnych. To powoduje, że praktycznie tylko układy faz normalnych znajdują zastosowanie do rozdzielenia mieszanin substancji na klasy związków chemicznych. Rozdzielanie grupowe, np. składników ropy naftowej i produktów ropopochodnych, nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych, mono-, di-, i tri-glicerydów itp., może być z powodzeniem wykonywane, tylko, z zastosowaniem układów faz normalnych.

CHROMATOGRAFIA W UKŁADZIE FAZ ODWRÓCONYCH (RP- ang. reversed phase)

Układ faz odwróconych (RP), to taki układ, w którym faza stacjonarna jest mniej polarna

niż faza ruchoma.

Fazy stacjonarne

fazy związne- otrzymywanie niepolarnych faz związanych opiera się na reakcji powierzchniowych grup OH z odpowiednimi silanami.

Fazy stacjonarne stosowane w układzie faz odwróconych, zamiast grup OH, o charakterze kwasowym, mają na powierzchni niepolarne łańcuchy węglowodorowe, ewentualnie alkilonitrylowe, albo podobne. Powierzchnia jest tym bardziej hydrofobowa, im większy jest stopień pokrycia niepolarną fazą stacjonarną oraz im więcej atomów węgla zawiera łańcuch węglowodorowy.

Faza ruchoma- eluent

W chromatografii w układach faz odwróconych fazami ruchomymi są mieszaniny wody i rozpuszczalników organicznych (tzw. modyfikatorów) mieszających się z wodą. Najczęściej stosowane rozpuszczalniki organiczne to acetonitryl, metanol i tetrahydrofuran.

Kolejność elucji

Substancje eluują w kolejności od najbardziej polarnych (ściśle najbardziej hydrofilowych) do niepolarnych (najmniej hydrofilowych), a w szeregach homologicznych od nisko- do wysokocząsteczkowych.

Retencja substancji rośnie ze wzrostem:

- stopnia pokrycia powierzchni związaną fazą organiczną

- długości łańcucha fazy związanej

- hydrofobowości grupy funkcyjnej decydującej o charakterze powierzchni sorpcyjnej

- hydrofobowości substancji rozdzielanych

- zawartości wody w fazie ruchomej

Zastosowanie układu RP

Nazwa „układ faz odwróconych” jest nazwą zwyczajową wynikającą z historii rozwoju chromatografii cieczowej. W początkowym okresie stosowania technik chromatograficznych fazami stacjonarnymi były polarne sorbenty, a fazami ruchomymi mniej polarne rozpuszczalniki (układ faz normalnych). Obecnie chromatografia w układzie faz odwróconych ma ogromny zakres zastosowań, natomiast chromatografie w układzie faz odwróconych stosuje się wyłącznie w omówionych wcześniej przypadkach. RP-HPLC służy ona do rozdzielania mieszanin substancji istotnie różniących się właściwościami, zarówno polarnych, średniopolarnych, jak i niepolarnych.

CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA/PLANARNA (TLC- ang. Thin layer chromatography)

Chromatografia planarna lub cienkowarstwowa (Thin Layer Chromatography - TLC) jest jednym z przykładów chromatografii cieczowej gdzie rozdzielenie mieszaniny zachodzi na fazie stacjonarnej w postaci cienkiej warstwy. Gdy fazą jest warstwa bibuły jest to chromatografia bibułowa a kiedy mamy do czynienia z warstwą rozprowadzoną na płytce szklanej, aluminiowej lub z tworzywa sztucznego jest to chromatografia cienkowarstwowa. Mechanizm rozdzielenia polega na migracji składników mieszaniny wraz z fazą ruchomą wzdłuż warstwy sorbentu. W zależności od energii oddziaływań składników z fazami wykazują one różny stopień retencji tzn. mają różną drogę migracji i znajdują się w różnych miejscach warstwy. Głównym mechanizmem oddziaływań międzycząsteczkowych jest adsorpcja a najczęściej stosowanymi adsorbentami są żel krzemionkowy, tlenek glinu, krzemian magnezu i krzemian wapnia. Warstwy tych substancji mogą być modyfikowane różnymi związkami chemicznymi, w zależności od użytego czynnika impregnującego otrzymuje się warstwy hydrofilowe lub hydrofobowe. Warstwy hydrofilowe uzyskuje się stosując dimetyloformamid, dimetylosulfoamid, dimetylosulfotlenek a warstwy hydrofobowe stosując substancje takie jak olej parafinowy, skwalan, undekan, olej silikonowy i inne.

Aby uzyskać informacje o rozdzielonych substancjach należy umiejscowić je na warstwie chromatograficznej. Detekcję substancji przeprowadzić można za pomocą metod fizycznych, chemicznych lub biologiczno-fizjologicznych. Do metod fizycznych zaliczyć możemy: fotometrię absorpcyjną, fluorescencję, fosforescencję a w przypadku substancji znakowanych izotopami promieniotwórczymi, metody radiometryczne. Najczęściej stosuje się lampę emitującą promieniowanie UV, ponieważ większość związków organicznych wykazuje absorpcję tego promieniowania. Dodatkową fluorescencje można wzbudzić impregnując warstwy odpowiednim „wywoływaczem”. Na płytce obserwować można tzw. Świecenie plamki.

Detekcja chemiczna polega na przeprowadzeniu badanych substancji w substancje barwne z pomocą reagentów chemicznych, które reagują z wybranymi grupami funkcyjnymi.

Detekcja biologiczno-fizjologiczna wykorzystuje aktywność biologiczną rozdzielanych substancji, gdy są one specyficzne. Metody te służą do oznaczania antybiotyków, insektycydów, fungicydów i innych.

Chromatografia powinowactwa jest szczególnym typem chromatografii adsorpcyjnej,

w której wykorzystuje się wzajemne powinowactwo dwóch substancji. Ze względu na swe

unikalne właściwości pozwala znacznie uprościć procedurę izolowania wybranej substancji,

przy jednoczesnym zachowaniu jej biologicznej aktywności.

Podstawy teoretyczne chromatografii powinowactwa

Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej z unieruchomionym ligandem

może mieć różny charakter, może to być oddziaływanie pomiędzy:

- hormonem i receptorem,

- enzymem i substratem,

- enzymem i inhibitorem,

- przeciwciałem i antygenem lub haptenem,

- komplementarnymi odcinkami kwasów nukleinowych,

- kwasami nukleinowymi i białkami,

- lektynami i glikoproteinami,

- dopełniaczem i przeciwciałami z grupy IgG, itp.

Warto zwrócić uwagę na to, że w przypadku każdej pary oddziałujących cząsteczek, nie

ma znaczenia, która z nich zostanie wybrana jako ligand. Przykładowo, jeżeli dysponujemy

czystym antygenem możemy wyizolować monospecyficzne przeciwciała poliklonalne

z surowicy odpornościowej, ale działając odwrotnie, możemy wyodrębnić antygen po

przygotowaniu złoża, które zawiera unieruchomione odpowiednie przeciwciała.

Chromatografię powinowactwa przeprowadza się zwykle w dwóch etapach.

W pierwszym etapie przez kolumnę przepuszcza się materiał zawierający molekuły

komplementarne do liganda. Przemieszczające się w obrębie złoża molekuły odnajdują

unieruchomiony ligand i wiążą się z nim. Po odmyciu nieswoiście zaadsorbowanych molekuł

rozpoczyna się drugi etap, w którym dochodzi do dysocjacji powstałych kompleksów i elucji

swoiście związanych makromolekuł. Dysocjacji kompleksów można dokonać w różny

sposób. Można zastosować specyficzny eluent, zawierający kompetytor współzawodniczący

o miejsca wiążące z ligandem. Na przykład plazminogen związany z unieruchomioną lizyną

można odmyć kwasem ε-aminokapronowym, który - podobnie jak lizyna - jest inhibitorem

plazminy, aktywnej formy plazminogenu. Zarówno kwas ε-aminokapronowy jak i lizyna

wiążą się do tego samego miejsca w cząsteczce plazminogenu. Można jednak eluować

związane substancje w sposób niespecyficzny, za pomocą buforów o niskiej lub wysokiej

wartości pH (np. bufor octanowy, bufor węglanowy, itp.), roztworów o wysokiej sile jonowej

(2,5 M roztwór NaCl), czy związków rozrywających wiązania wodorowe (4-8 M roztwór

mocznika, 6 M roztwór guanidyny). Po zakończeniu elucji należy usunąć zastosowane w tym

celu substancje od wyizolowanych makromolekuł. Można to zrobić różnymi metodami, np.

stosując dializę, ultrafiltrację lub filtrację żelową.

Zalety i wady metody chromatografii powinowactwa

Zalety:

- brak ograniczeń w stosunku do objętości nanoszonej na kolumnę próbki oraz do stężenia separowanego materiału w próbce

- możliwość silnego zatężenia izolowanej molekuły

- bardzo wysoka specyficzność

- możliwość uzyskania w czystej postaci molekuł, które często nie mogą być izolowane innymi metodami

- wyizolowany materiał charakteryzuje się bardzo wysokim stopniem czystości pomimo zastosowania tylko jednego kroku preparatywnego.

Wady:

- trudności z uzyskaniem niektórych specyficznych ligandów

- częsta konieczność przygotowania złoża we własnym zakresie

- niska trwałość niektórych ligandów.

Chromatografia jonowa i jonowymienna.

Zastosowanie: Rozdzielanie i oznaczanie nieorganicznych, albo organicznych kationów,

albo/i anionów, a także aminokwasów, peptydów, białek, nukleotydów, sacharydów, amin, alkanoloamin

i innych wysoce polarnych i jonizowalnych, albo trwale spolaryzowanych oraz silnie

polaryzowalnych substancji, m. in. takich, jak w/w cukry, peptydy itd. W przypadku wykorzystywania

dla substancji makromolekularnych należy zapewnić taką wielkość porów wymieniacza

jonowego (w zakresie 300 do 1000, a nawet 5000 ), aby cząsteczki rozdzielanych substancji

miały możliwość penetrować wszystkie pory wype³nienia.

TYPY WYMIENIACZY JONOWYCH

a. Kationit (kwas związany na powierzchnią porów wypełnienia kolumny): mocny, średni, albo

słaby - konkurencyjne oddziaływania z kationami: H⁺, Na⁺, K⁺, Ca²⁺

b. Anionit (zasada związana na powierzchni wypełnienia kolumny): mocny, średni, albo

słaby - konkurencyjne oddziaływania z anionami: OH^-, Cl^-

c. wymieniacze jonów z dodatkowymi oddziaływaniami sorpcyjnymi, np. jednocześnie grupy

typu C18 oraz -SO3H, albo/i NR4 +OH.

Fazy stacjonarne (jonity) stosowane w HPIC.

Jonit	Grupa jonowymienna
Anionity :
Silnie zasadowe	-N+(CH3)3 ,-N+(CH3)2C2H4OH
Średnio i słabo zasadowe	-NH2, =NH, -N+R2H, -N+RH2
Kationity:
Silnie kwasowe	-SO3^-, -PO3^2-
Średnio kwasowe	-COO-
Słabo kwasowe	-CH2N(CH2COO-)2
Bardzo słabo kwasowe	-OH
Amfoteryczne	-COO- i -N+(CH3)3 równoczeoenie, albo inne

Parametry CHARAKTERYZUJĄCE CZUJNIKI CHEMICZNE:

czułość (ang. sensitivity) - nachylenie krzywej charakterystyki chemosensorycznej sensora

wyrażone jako wartość sygnału przypadającą na jednostkę stężenia bądź aktywności np.:

mV/pX. (X oznacza stężenie bądź aktywność oznaczanego jonu),

selektywność (ang. selectivity) - zdolność sensora do pomiaru stężenia jednego chemicznego

składnika w obecności innych,

granica oznaczalności (ang. detection limit) - stężenie (aktywność), w którym średnia wartość

mierzonego sygnału jest równa wartości dwóch odchyleń standardowych,

czas odpowiedzi czujnika (ang. response time) - czas, w którym wyjściowy sygnał sensora

osiąga poziom 95% wartości końcowej,

czas życia sensora (ang. life time) - okres poprawnego działania sensora przy uwzględnieniu

jego odpowiedniego kondycjonowania. W niektórych przypadkach określany jako średni czas

między awariami (MBTF ang. mean time between failures),

stabilność - zdolność czujnika do zachowania parametrów pomiarowych, określonych w

procesie kalibracji, przez określony czas, wyrażona w procentach zakresu pomiarowego,

liniowość - maksymalna różnica pomiędzy wartościami zmierzonej charakterystyki czujnika a

wartościami jego idealnej charakterystyki liniowej odniesiona (w procentach) do wartości

zakresu zmian sygnału wyjściowego,

zakres pomiarowy - zakres zmian stężeń (aktywności) mierzonych przez czujnik,

histereza - zależność zmian parametrów charakteryzujących system od stanów

poprzedzających dany stan.

Ze względu na rodzaj sygnału wyjściowego czujniki chemiczne dzielimy na:

•potencjometryczne (pomiar napięcia)

•amperometryczne (pomiar prądu)

•konduktometryczne (pomiar przewodnictwa)

BIOSENSORY.

Postęp w biotechnologii, pozwalający na pozyskiwanie biologicznie aktywnych składników żywych organizmów oraz ich wiązanie ze sta­łym nośnikiem, pozwolił na opracowanie nowych metod analitycz­nych, które mogą zastępować niektóre fizykochemiczne metody instru­mentalne. Do nich należą metody enzymatyczne i ich rozwinięcie, tj. metody z zastosowaniem biosensorów.

Klasyczne metody analizy chemicznej mimo wielu zalet, jak: dokładność, czułość i duża precyzja, stają się mało przydatne w tych zastosowaniach gdzie pożądane są szybkie oznaczenia, możliwość pracy w trybie monitorowania oraz automatyzacja pomiarów.

Wymienione wymogi spełniają biosensory (rys.1.1), łączące czułość i selektywność klasycznych metod analizy z szerokim wachlarzem rozwiązań konstrukcyjnych, dostosowanych do określonego zastosowania takiego urządzenia.

Termin biosensor pojawił się w literaturze analitycznej w 1977 roku dla opisania jonoselektywnej elektrody modyfikowanej enzymem. Początków należy jednak szukać w roku 1962, kiedy to Clark i Lyons zbudowali pierwszy bioczujnik, w którym jonoselektywna elektroda tlenowa została wyposażona w enzym jako membranę do detekcji glukozy [Brzózka Z., 1999].

Bioczujniki (biosensory) to sensory chemiczne składające się z dwóch zasadniczych elementów: warstwy receptorowej w postaci materiału biologicznego oraz przetwornika elektrycznego lub optycznego

Należy zaznaczyć, że przedrostek „-bio” odnosi się do czujnika (sensora), a nie do oznaczanej substancji, a zastosowanie biosensorów nie ogranicza się do analizowania związków biologicznych [Przybyt M., 1999]. Warstwa receptorowa służy do “rozpoznawania" oznaczanego związku, a przetwornik do “przetłumaczenia" sygnału biologicznego na parametr mierzalny fizycznie oraz do obróbki tego parametru. W części receptorowej sensora informacja chemiczna jest przekształcana w formę energii, która może być mierzona przez przetwornik. Reakcja analitu z częścią biologiczną przetwornika generuje w nim sygnał, który może być łatwo zmierzony, wzmocniony i zanotowany. Receptorem mogą być enzymy, najczęściej w postaci unieruchomionej, mikroorganizmy lub przeciwciała, organelle tkanek roślinnych i zwierzęcych.

Przetworniki to zwykle potencjometryczne lub amperometryczne elektrody jonoselektywne, tranzystory, termistory, piezokryształy, systemy optyczne.

Głównym zadaniem przetwornika jest konwersja mierzonego parametru na sygnał: elektryczny, optyczny lub akustyczny.

Biosensory wykorzystują podstawową cechę materiału biologicz­nego jako warstwy detekcyjnej - selektywność, to znaczy zdolność do reagowania na jeden określony związek w obecności innych. Selektywność biosensora zależy ściśle od użytego materiału biologicznego. Połączenie chemicznie selektywnej warstwy z fizyczną częścią sensora jest bardzo ważne i ma znaczący wpływ na selektywność całego sensora. Jego sygnał może być przetwarzany na wiele sposobów z różnym stopniem skomplikowania, przedstawiany w formie analogowej, odejmowany od sygnału odniesienia, przetwarzany na sygnał cyfrowy i następnie przetwarzany metodami statystycznymi.

Atrakcyjność stosowania bioczujników wynika głównie z tego, że pozwalają one w sposób prosty i szybki oznaczyć interesujący nas składnik najczęściej bardzo złożonej, kompleksowej mieszaniny, jaką jest np. produkt spożywczy czy substancja biologicznie aktywna.

Pomiar za pomocą bioczujnika najczęściej nie wymaga pracochłonnego przygotowania próby. Poza tym bioczujnik może być stosowany zwykle przez kilka tygodni, a nawet miesięcy wykonując w tym czasie setki pomiarów, co sprawia, że koszt analizy jest bardzo mały [Filipiak M., 1993].

Opracowanie metod unieruchamiania enzymów, a następnie innych bioaktywnych elementów, pozwalające na wielokrotne ich stosowanie, dało podstawy do budowy układów pomiarowych, które nazwano biosensorami.

Bioczujniki stanowią w pewnym sensie krok naprzód w dziedzinie analizy składu chemicznego w stosunku do czujników chemicznych, ponieważ na ogół charakteryzują się lepszymi od nich parametrami metrologicznymi (większą selektywnością i większą czułością).

Sensor chemiczny, jako urządzenie, jest określany wieloma parametrami użytkowymi. Obok podstawowych jak: dokładność, powtarzalność, definiowanych jak dla każdego pomiaru, występują parametry analityczne:

·        czułość - nachylenie krzywej odpowiedzi sensora, wyrażonej jako wartość sygnału na jednostkę stężenia, np. mV/j.pH,

·        zakres dynamiczny - zakres stężeń, w których czułość jest większa od zera,

·        selektywność - zdolność sensora do pomiaru stężenia jednego chemicznego składnika w obecności innych,

·        czas odpowiedzi - czas, w którym wyjściowy sygnał sensora osiąga 63% wartości końcowej w odpowiedzi na skokową zmianę stężenia oznaczanej substancji (w praktyce częściej używa się wartości t_95%, tj. czasu odpowiedzi kiedy sygnał osiągnie 95% wartości końcowej,

·        czas życia - okres czasu poprawnie działającego sensora z zaznaczeniem trybu stosowania (przechowywanie, w użyciu), [ Brzózka Z., 1999].  

Wszelkie próbki są w swo­jej istocie produktami złożonymi i oznaczanie w nich określonych składników jest często trudne, wymaga skomplikowanego przygotowania, jest czaso­chłonne i kosztowne. Ponadto wszelkie substancje zawie­rają wiele składników, które mogą przeszkadzać w oznaczaniu określonego analitu. Dlatego stale po­szukuje się nowych, lepszych metod analizy. Krokiem naprzód w tej dziedzinie są wlaśnie biosensory.

Biosensor - jest to czujnik, kórego element biologiczny oddziałuje z substancją oznaczaną, a efekt jest przekształcany przez zespolony z nim element niebiologiczny (transduktor) na sygnał elektryczny.

Biosensory są urządzeniami zminiaturyzowanymi, co niesie za sobą zmniejszenie czułości. Są wykorzystywane m.in. w badaniach środowiska, analityce medycznej i kontroli procesów technologicznych.
Ogólne różnice w budowie biosensorów dotyczą elementu biologicznego oraz transduktora.
Ze względu na sposób przekształcenia sygnału (transdukcji) wyróżnia się biosensory:
- potencjometryczne
- woltametryczne i amperometryczne
- optoelektroniczne
- piezoelektryczne
- termistorowe
Elementem biologicznym biosensora może być enzym, przeciwciała, żywe mikroorganizmy, tkanki rośline lub zwierzęce.
Przykładowy biosensor: czujnik amperometryczny glukozy, w którym glukoza jest zamieniana przez umieszczoną w biosensorze oksydazę glukozy w reakcji:
glukoza + O2 -> kwas glukonowy + H2O2
Detekcja odbywa się przez pomiar spadku ilości redukowanego tlenu na elektrodzie platynowej Clarka.

W ochronie środowiska biosensory mogą być używane do detekcji i identyfikacji substancji toksycz­nych i mutagennych w otaczającym środowisku. Spadek aktywności immobili­zowanego biokatalizatora może być mierzony jako zmniejszenie się szybkości reakcji biokatalitycznej. Wielkość tego spadku jest proporcjonalna do stężenia właściwej trucizny. Ogólnie, izolowany biokatalizator enzymatyczny może być użyty jako wskaźnik klasy związków. Przykładem jest wykrywanie fosfora­nów organicznych, wykorzystujących inhibitowanie acetylocholinosterazy. Reakcję enzymatyczną można monitorować elektrodą pH, a szybkość reakcji jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia związków fosforoorganicznych.

---