WYKŁAD 1

Biotechnologia

-termin wymyślony przez Węgra Karola Ereky w 1919;

-w latach 20 Niem. - kierunki prac, których produkty zostały wytworzone z surowca za pomocą żyjących organizmów;

-1939 - termin „biotechnologia” w zestawieniu z inżynierią chemiczną i mechaniczną;

-1940 - oznaczał gałąź technologii związanej z rozwojem i eksploatacją maszyn;

-1960 - aspekty związane z wykorzystaniem i kontrolą układów biologicznych;

-przełom 70/80 - zaczęto wiązać z inżynierią genetyczną;

Biotechnologia (def. Wg Europejskiej Federacji Biotechnologicznej) - ingerencja nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu osiągnięcia zastosowań organizmów, komórek lub innych części i molekularnych analogów (jeśli są) do pozyskania produktów, usług.

Biotechnologia (PWN) - interdyscyplinarna dziedzina nauki, obejmuje różne kierunki technicznego wykorzystania materiałów i procesów biologicznych. W szczególności procesy biosyntezy i biotransformacji przebiegające przy udziale drobnoustrojów, kultur tkankowych, in vitro i enzymów, a także izolację tak otrzymanych bioproduktów.

Biotechnologia (Ministerstwo Ochrony Środowiska) - odnosi się do wszystkich technicznych zastosowań, które wykorzystują systemy biologiczne, żywe produkty lub ich pochodne, w celu ich wytwarzania, przetwarzania lub zmiany określonych celów. Różnica między biotechnologią tradycyjną a nowoczesną polega na tym, że obecnie naukowcy potrafią pobrać pojedynczy gen z komórki i przenieść je do innych komórek aby wyposażyć je w określone cechy.

Biotechnologia (Wielka Internetowa Encyklopedia Multimedialna) - naukowe podstawy i zakres zastosowań biotechnologii: ekologia - mikrobiologia - biologia komórki - genetyka - informatyka - ekonomia wykorzystane w ochronie zdrowia, rolnictwie, przemyśle chemicznym i spożywczym.

Trzy obszary biotechnologii:

-biała - wykorzystuje systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska. Opiera się na biokatalizie i bioprocesach. Dzięki tej gałęzi surowce odnawialne są przekształcone z udziałem mikroorganizmów, enzymów w różne cenne chemikalia wykorzystywane w innych dziedzinach.

-czerwona - w ochronie zdrowia, rozwoju diagnostyki genetycznej, genoterapii

-zielona - związana z rolnictwem, obejmuje stosowanie metod inżynierii genetycznej w celu doskonalenia produkcji roślinnej czy zwierzęcej

Biotechnologia tradycyjna - przebiega z użyciem naturalnych enzymów lub drobnoustrojów, komórek organizmów wyższych nie zawierających obcego materiału genetycznego. Otrzymywanie produktów mlecznych, kiszonych sięga kilka tysięcy lat p.n.e.

Biotechnologia nowoczesna - stosowane są procedury przenoszenia lub modyfikacji (w sposób aseksualny) określonych genów między różnymi osobnikami. Wykorzystuje się również szczepy drobnoustrojów lub inne komórkowe, skonstruowane metodami inżynierii genetycznej, względne enzymy modyfikowane technikami inżynierii białka.

Nowoczesne metody i rozwiązania biotechnologii obejmują:

-rekombinację genetyczną in vitro i klonowanie;

-fuzję komórek (protoplastów) i inżynierię cytogenetyczną;

-inżynierię białek i inżynierię genetyczną;

-technikę hodowli in vitro komórek organizmów wyższych;

-technologia enzymów unieruchamiających;

-biokatalizę;

-nowoczesne technologie mikrobiologiczne;

-komputerowe modelowanie i sterowanie bioprocesami;

Rekombinacja - wymiana materiału genetycznego w wyniku, którego powstają nowe genotypy. U organizmów rozmnażających się płciowo rekombinacja jest wynikiem przypadkowej, niezależnej segregacji chromosomów

a)rekombinacja uprawniona - między odcinkiem DNA o przynajmniej częściowo homologicznej sekwencji nukleotydów

b)rekombinacja nieuprawniona - gdy pewne odcinki DNA genoforu np. bakterii, fagów, plazmidów, rekombinują mimo braku homologiczności sekwencji nukleotydów DNA

Zastosowanie przy:

-klonowaniu i ekspresji genów kodujących określone białka;

-optymalizacji poziomu ekspresji genu kodującego białko (wybór promotorów);

-kontrolowaniu modyfikacji sekwencji nukleotydowych kodujących dane białko;

-tworzeniu wyższych transgenicznych roślin lub zwierząt;

-somatycznej terapii genowej dojrzałych organizmów;

-diagnostyce genowej związane z określeniem sekwencji nukleotydów pojedynczych genów lub pełnych genomów;

Metody:

-in vivo: koniugacja, transdukcja, transformacja, transfekcja;

-in vitro;

Koniugacja - dotyczy tylko bakterii, u komórek prokariotycznych przeciwstawnych typów wymieniają się materiałem genetycznym.

Transdukcja - przenoszenie małych fragmentów DNA z 1 komórki bakteryjnej do 2 za pomocą bakteriofaga.

Transformacja - wprowadzenie natywnych bądź zrekombinowanych fragmentów DNA do kompetentnych komórek bakterii.

Transfekcja - przeniesienie fragmentu DNA wirusa do komórki bakteryjnej. Tego terminu używa się tylko do transponowanych komórek eukariotycznych.

In Vitro i klonowanie:

-wydzielenie odpowiedniego DNA, oczyszczenie, fragmentowanie (enzymy restrykcyjne);

-łączenie odpowiednich fragmentów DNA z cząsteczkami wektora;

-transformacja lub transfekcja;

-klonowanie;

Wektor - może być nośnikiem DNA, która posiada zdolność do automatycznej replikacji w danym typie komórek. W wektorze możemy namnożyć interesujący nas fragment lub można też przeprowadzić wydajną syntezę kodowanego przez gen białka (wektory ekspresyjne). Najczęściej wektory plazmidowe - nieduże, koliste cząsteczki DNA, zawierające ori replikacji, gen markera selekcyjnego (najczęściej odporności na antybiotyk) i miejsce do klonowania.

Miejsce ori - start replikacji

WYKŁAD 2

Tranformacja

W plazmidzie mamy fragment, który chcemy klonować, namnożenie w komórkach bakteryjnych (to muszą być specjalne komórki - komórki kompetentne), muszą przyjąć obce DNA - replikacja w komórkach bakteryjnych.

Dziki plazmid + gen nas interesujący -> zrekombinowany plazmid do komórek kompetentnych E.coli -> namnożenie -> wysiew na pożywkę selekcyjną, zawierającą odpowiedni antybiotyk. Rosną tylko te bakterie kompetentne, które zawierają ten sam zrekombinowany plazmid.

Klonowanie - w potocznym rozumieniu to proces tworzenia idealnej kopii z oryginału. W biologii mianem klonu określa się organizmy o identycznym lub prawie identycznym materiale genetycznym.

Fuzja komórek i inżynieria cytogenetyczna - inżynieria genetyczna na poziomie komórki. Praktyczne wykorzystanie to między innymi fuzja protoplastów. Trzeba usunąć ścianę komórkową, umieszczając w odpowiednich warunkach i następuje zlanie się komórek, powstają mieszańce somatyczne.

Inżynieria białka i inżynieria genetyczna:

1.Inżynieria białka - modyfikacje enzymu w celu zmiany ich charakterystyki funkcjonalnej

2.Inżynieria genetyczna - zespół technik badawczych pozwalający na wyizolowanie i charakterystykę określonych genów, umożliwiający manipulacje genetyczne poza komórką, czyli rekombinowanie DNA in vitro.

Technologia hodowli in vitro komórek organizmów wyższych

In vitro - praca z żywymi komórkami wyizolowanymi z organizmu macierzystego i umieszczonym z warunkach sztucznych, umożliwiających przeżycie.

Hodowla tkankowa (komórkowa) - hodowla komórek, tkanek i narządów utrzymanych przy życiu lub rosnący in vitro przez okres dłuższy niż 24h.

3 główne typy hodowli tkankowej:

-komórkowa - hodowla pojedynczych komórek in vitro nie wykazujących cech tkankowych;

-hodowla tkankowa - otrzymanie lub wzrost tkanek in vitro, która zachowuje swoje funkcje i strukturę;

-hodowla narządów - utrzymanie lub wzrost związków całych lub części narządów in vitro z zachowaniem ich funkcji i struktury;

Technologia enzymów unieruchomionych:

Technologia enzymów - obejmuje procesy pozwalające na unieruchomienie (immobilizację) enzymów przy pomocy nośników, powodując większą stabilność i możliwość wielokrotnego użycia.

Biokataliza - przyspieszenie/opóźnienie reakcji chemicznej, przebiegającej w żywym organizmie w skutek obecności biokatalizatorów.

Technologia mikrobiologiczna - obejmuje procesy mikrobiologicznej biosyntezy i biotransformacji, dotyczy głównie bakterii i grzybów.

Rys historyczny biotechnologii:

Okres I - przedpasterowski - od zarania ludzkości do połowy XIX w. to okres procesów fermentacyjnych - warzenie piwa, fermentacja mlekowa.

Okres II - II połowa XIX w do lata 40te XX w ludzie tłumaczyli sobie procesy biotechnologiczne zachodzące w czasie fermentacji. Opracowano produkcję kwasu mlekowego i cytrynowego, acetonu, butanolu, technologię otrzymywania drożdży.

Clostridium acetobutylicum - fermentacja - butanol, aceton

Aspergillus niger - fermentacja - kwas cytrynowy

Okres III - era nowoczesna, rozpoczął się od opracowania przemysłowej produkcji penicyliny

a)podokres 1 (do roku 1970) opracowano owe technologie m.in. biosyntezy antybiotyków, enzymów i biotransformacji steroidów. Pierwsze technologie, w których zastosowano biokatalizatory immobilizowane. Powszechnie stosowane w mutagenezie.

Mutacje - nagła trwałą zmiana dziedzicznej właściwości organizmu, spowodowana w obrębie genu, w strukturze chromosomów lub genomu, powstają samorzutnie lub wywołane sztucznie (działaniem mutagenów)

Mutageny:

-fizyczne - promieniowanie jonizujące, rentgenowskie, UV, zmiany w strukturze genu;

-chemiczne - analogi puryn, pirymidyny włączające do DNA, czynniki deaminujące, powodujące deaminację zasad, czynniki alkilujące - dodają grupy alkilowe do nukleotydów w cząsteczce DNA.

Najczęściej mutageny punktowe. Musimy wziąć pod uwagę, że część mutacji może być latalna, bo są to niekorzystne mutacje. Trzeba dobrać odpowiednią dawkę motagenu.

b)podokres 2 (od roku 1970) praktyczne wykorzystanie genetyki i biologii molekularnej w biotechnologii, rozwój rekombinacji DNA in vitro, in vivo, mikrobiologiczna produkcja insuliny, hormonów wzrostu, interferonów, wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych.

Wybrane zagadnienia z genetyki, biologii molekularnej i inżynierii genetycznej.

Budowa DNA:

2 niciowa cząsteczka, z zasad azotowych, reszty fosforanowej, cukru.

Wszystkie rozpuszczalne na zewnątrz łańcucha, nie rozpuszczalne wewnątrz helisy.

Puryny: A, G Pirymidyny: C, U, T

Cukier: ryboza, deoksyryboza

WYKŁAD 3

Właściwości chemiczne i fizyczne kwasów nukleinowych:

-hydroliza - rozpad kwasów nukleinowych na podstawowe składniki: zasadę azotową, cukier, resztę kwasu fosforowego pod wpływem silnych kwasów (nadchlorowy) i wysokiej temperatury. Jest to proces nieodwracalny.

-denaturacja (topnienie) - zerwanie metodami chemicznymi lub fizycznymi oddziaływań niekonwencjonalnych, takich jak wiązania wodorowe między komplementarnymi parami zasad. Proces odwracalny. Ogrzewana w 90^o przez kilka min i przełożony do niskiej temperatury - mamy pojedyncze, zdenaturowane cząsteczki DNA

-renaturacja - powrót zdenaturowanej cząsteczki do stanu naturalnego.

-hybrydyzacja - połączenie przez tworzenie par dwóch komplementarnych nukleotydów.

Ekstrakcja DNA (dotyczy materiały roślinnego i zwierzęcego)

1.Homogenizacja tkanki świeżej lub zmrożonej, rozdrobnienie materiału genetycznego.

2.Traktujemy buforem ekstrakcyjnym w celu oddzielenia tkanki od kwasów nukleinowych, białek, polisacharydów

3.Usunięcie białek, by otrzymać czysty kwas nukleinowy poprzez wielokrotne wytrącanie i wirowanie np. chloroform, alkohol etylowy

4.Rozpuszczenie DNA

5.Za pomocą spektrofotometru mierzymy absorbancję w celu sprawdzenia czystości i stężenia preparatu DNA (A₂₆₀/A₂₈₀=1,8 poniżej 1,8 zanieczyszczenie białkiem)

6.Sprawdzenie DNA na żelu agarozowym

Elektroforeza agarozowa DNA (kwasu nukleinowego) - cząsteczki w polu elektrycznym migrują od „-„ do „+”. W żelu powstają różnej wielkości pory, zastygają. DO studzienki nanosimy DNA. Im krótsze cząsteczki DNA uzyskujemy tym dłużej się .......?....... Żeby preparat był widoczny na żelu agarozowym, należy dodać bromek atylowy, który wchodzi między zasady azotowe i w ultrafiolecie widać prążki DNA wyizolowanego.

Enzymy restrykcyjne - podstawowe narzędzie inżynierii genetycznej. Są enzymami izolowanymi z bakterii zdolnymi do rozpoznawania specyficznych sekwencji DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA. Enzymy restrykcyjne typy II wymagają jako substratu dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej co najmniej jedną sekwencję rozpoznawaną przez enzym, oaz jonów Mg Enzymy restrykcyjne rozpoznają sekwencję nukleotydowe 4 lub 6 nukleotydowe fragmenty.

Nacięcia w obu niciach mogą leżeć naprzeciwko siebie i powstają „tępe końce” Haell II, „lepkie końce” enzym EkoR I. Uzyskuje się 2 fragmenty o wystających końcach 3'

Replikacja - synteza nowej kopii genomu ma miejsce przed podziałem komórki w fazie S

a)konserwatywna replikacja;

b)przypadkowa replkacja;

c)Semikonserwatywna replikacja - każda nowa zsyntezowana cząsteczka DNA posiada 1 łańcuch DNA „stary” i był matrycą do powstania nowej cząsteczki DNA;

Polimerazy DNA

1.U prokariotycznych 3 polimerazy - to głównie enzymy uczestniczące w replikacji;

2.U eukariotycznych 5 polimeraz:

a)polimeraza DNA α - synteza starterów, niezbędne by zaszła replikacja;

b)polimeraza DNA δ - główny enzym replikacyjny na nici wiodącej;

c)polimeraza DNA ε - na nici opóźnionej;

Replikacja:

-inicjacja;

-elongacja;

-terminacja;

Potrzebne:

-starter RNA;

-matryca DNA;

-polimeraza DNA;

-nukleotydy dNTP;

-ligaza (enzym łączący fragmenty okazaki);

Prokariota - enzym prymaza syntezuje krótki oligonukleotydowy DNA (synteza), polimeraza DNA III gdy już mamy odcinek. 1000 nukleotydów na sekundę - tak szybko pracuje polimeraza DNA III

Eukariota - polimeraza DNA α (syntezuje starter), polimeraza DNA δ

W 1 miejscu w dwóch kierunkach rozpoczyna się replikacja. 50 nukleotydów na sekundę, wolniej, bo rozpoczyna się w wielu miejscach.

Elongacja:

-synteza startera po nici opóźnionej;

-polimeraza DNA syntetyzuje fragment nici;

-egzonukleaza wycina fragment starterów;

Łańcuchowa reakcja polimerazy:

Replikacja in vitro

Potrzebne do PCR:

-matryca DNA;

-wolne nukleotydy (dNTP);

-polimeraza (najczęściej TagPlimeraza, nie ulega denaturacji w 95^o);

-bufor z jonami Mg²⁺ Mn²⁺ by działała polimeraza;

Etapy:

1.denaturacja 95^o - 1 min, rozdzielają się na pojedyncze nukleotydy

2.przyłączenie starterów 60^o - 30 sek. Obniżamy temperaturę, startery które są cząsteczkami komplementarnymi wytwarzają wiązania wodorowe.

3.podwyższenie temperatury do 72^o - 2 min to powoduje wydłużenie starterów w kierunku

5' - 3'. Liczba zsyntezowanych fragmentów DNA rośnie wykładniczo 2ⁿ, gdzie n to liczba cykli. Np. 2³⁵ = 34 miliardy kopii

WYKŁAD 4

Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR wymaga:

1.Matrycy DNA(lub RNA);

2. Startery( dwa różne);

3.Wolne nukleotydy(DTP);

4.Polimeraza (najczęściej Taq Polimeraza);

5. Bufor, jony Mg²⁺, Mn ^2+.

Przykładowy program PCR:

1 etap-denaturacja 95^o C - 1 minuta;

2 etap- przyłączanie starterów 60 ^o C- 30 sekund;

3 etap - wydłużanie starterów 72^o C- 2 minuty.

Pierwszy i drugi etap powtarzamy 35 razy otrzymując z 2 nici komplementarnych DNA 34 miliardy kopii wydajność procesu rośnie wykładniczo 2ⁿ gdzie n to liczba cykli.

Gen jest to wyróżniony funkcjonalnie ciąg nukleotydów łańcucha DNA genomu. Jest to strukturalna jednostka DNA odpowiedzialna za wykształcenie określonej cechy. Pojedynczy gen koduje za pośrednictwem mRNA pojedynczy łańcuch polinukleotydowy lub jedną cząsteczkę RNA innego rodzaju- np. tRNA, rRNA lub inny rybozy. W skład wielu białek wchodzi więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy - są zatem kodowane przez więcej niż jeden gen.

Allele - para lub więcej genów, które zajmują jednakowe położenie w chromosomach homologicznych wywołują odmienne wykształcenie określonej cechy, np. różny kolor kwiatów. W organizmach diploidalnych wykluczają się w gametach, występują parami w komórkach somatycznych; ten sam gen może wskutek mutacji wytwarzać szereg alleli, są to tzw. Allele wielokrotne.

Promotor - położona na końcu 5' genu sekwencja nukleotydowa, którą wiąże się polimeraza RNA w czasie inicjacji transkrypcji.

Enhancery to sekwencje wzmacniające aktywność promotorów. Położone mogą być nawet w znacznej odległości od genu i zachowują zdolność regulacyjną także po eksperymentalnej zmianie orientacji o 180 stopni względem genu. Do enhancerów wiążą się czynniki transkrypcyjne określane jako aktywatory.

Gen eukariotyczny składa się z: promotora, miejsc inicjacji i terminacji (start i stop), właściwej sekwencji kodującej, sekwencji wzmacniających (enhancery) i wyciszających (silencery).

Ekspresja genu - seria zdarzeń prowadzących do uwolnienia informacji genetycznej niesionej przez gen i uczynienia jej dostępną dla komórki.

Transkrypcja - jest enzymatyczna synteza RNA na matrycy DNA. Jest to pierwszy etap procesu ekspresji genów, który ostatecznie prowadzi do syntezy białka kodowanego przez gen. Transkrypcja katalizowana jest przez polimerazę RNA, wymaga obecności matrycy dsDNA, rybonukleotydów (ATP, GTP, CTP, UTP), jonów magnezu lub manganu.

Nić kodująca (nić sensowna) - nić DNA, która jest transkrybowana.

Nić matrycowa (nić antysensowna) - jest matrycą dla RNA.

Odwrotna transkrypcja - transkrypcja przebiegająca w przeciwnym kierunku niż powszechnie zachodzący w przyrodzie. W odwrotnej transkrypcji RNA jest matrycą do syntezy DNA. Proces ten zachodzi w cyklu rozwojowym niektórych wirusów np. wirusa HIV. Odwrotna transkrypcja jest wykorzystywana przez ludzi jako metoda laboratoryjna: dysponując cząsteczką RNA, można na jej podstawie odtworzyć w przybliżeniu strukturę cząsteczki DNA, użytej przez komórkę do jej wytworzenia.

Transkrypcja składa się z trzech etapów: inicjacji - polimeraza RNA wiąże się z dsDNA w miejscu paromotorowym, DNA ulega lokalnemu rozpleceniu i polimeraza RNA rozpoczyna inicjację transkrypcji.

Elongacji - polimeraza RNA przesuwa się wzdłuż DNA i zgodnie z jego sekwencją syntetyzuje łańcuch RNA

Terminacji - polimeraza RNA ropoznaje sekwencję, terminacyjną, co powoduje przerwanie wbudowywania rybonukleotydów.

WYKŁAD 5

Rodzaje dojrzewania RNA

Dojrzewanie (obróbka) jest to proces, w którym pierwotne cząsteczki RNA ulegają zmianom.

Najczęstsze typy zmian obejmują: usunięcie nukleotydów przez endo- entonukleazy; dodanie nukleotydów do końca 5 lub 3 pierwotnego transkryptu lub produktów jego rozcięcia; modyfikacje pewnych nukleotydów w obrębie zasady azotowej lub w części cukrowej.

Dojrzewanie mRNA rozpoczyna się w trakcie jego syntezy i polega na: dołączeniu 7- metyloguanozyny (czapeczki) do końca 5; poliadenylacji końca, składaniu transkryptu; wycinaniu intronów (splicing); redagowaniu transkryptu - zmianie właściwości kodującego mRNA;

Kod genetyczny - sposób zapisu budowy łańcucha polipeptydowego (kolejności aminokwasów) w budowie DNA ( kolejności nukleotydów);

Pierwszym aminokwasem w powstającym polipeptydzie jest zawsze metionina oznaczana kodem AUG.

Kodony terminacyjne to: UGA, UAG, UAA;

Cechy kodu: trójkowy, bezprzecinkowy, niezachodzący, praktycznie uniwersalny, zdeterminowany czyli jedna trójka oznacza dokładnie jeden aminokwas, zdegenerowny czyli jedna trójka może oznaczać ten sam aminokwas;

Translacja - biosynteza białka;

Translacja - jest to odbywająca się na rybosomach synteza łańcucha pilipeptydowego na podstawie informacji zawartej w mRNA, zawartej w tRNA oraz odpowiednich enzymów i czynników białkowych

Budowa rybosomów:

Mała podjednostka, duża podjednostka; łańcuch aminokwasów, nić mRNA

Rybosom 80S: eukariotyczny- podjednostka mała 40 : 32 białek i RNA 18 S

Podjednostka duża 60S : 40-50 białek i RNA - 28 S, 5.8 S i 5 S

Translacja składa się z trzech etapów: inicjacji, terminacji, elongacji;

Elongacja translacji:

Cykl elongacji składa się z trzech etapów; dostarczenia amicylo-tRNA, tworzenia wiązań peptydowych, translokacji;

Następuje połączenie dwóch aminokwasów wiązaniem peptydowym. Reakcje katalizuje enzym transferaza peptydylowa, która odłącza aminokwas od inicjatorowego tRNA i przenosi na aminokwas znajdujący się w pozycji A. Następuje translokacja- rybosom przesuwa się o trzy kolejne nukleotydy, następny kodon wchodzi w miejsce A. Dipeptyd odpowiadający dwóm pierwszym kodom zostaje przesunięty w miejsce P. wolny tRNA zostaje usunięty z rybosomu. W miejsce A przyłącza się kolejny aminocylo-tRNA. Z udziałem transferazy peptydylowej powstaje kolejne wiązanie peptydowe itd...

Kolejne białko ma strukturę trójwymiarową:

-struktura pierwszorzędowa- kolejność aminokwasów, stabilizowana przez wiązania peptydowe;

-struktura drugorzędowa: łańcuchy peptydowe są poskręcane w helisy lub też inne regularne struktury np.: harmonijki które są utrzymywane przez wiązania wodorowe;

-struktura trzeciorzędowa- ponowne skręcanie lub pofałdowanie skręconego już białka, jest stabilizowana przez wiązania wodorowe, kowalencyjne wiązania hydrofobowe;

-struktura czwartorzędowa-tę strukturę posiadają białka zbudowane z kilku łańcuchów polipeptydowych, stabilizowana przez wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe i mostki dwusiarczkowe. W zależności od pełnionej funkcji białka ze strukturą czwartorzędową mogą rozpadać się na składowe polipeptydy lub zmieniać swoje podjednostki;

potranslacyjna obróbka białek

polipeptyd uwolniony z rybosomu jest nieaktywny i zanim będzie spełniać swoje funkcje musi być poddany obróbce:

Są 4 typy mechanizmów obróbki potranslacyjnej:

-proteolityczne rozszczepienie białek- niektóre białka muszą zostać pocięte proteazami, które usuwają fragmenty z jednego lub dwóch końców polipeptydu, w efekcie powstaje skrócone białko, które po sfałdowaniu staje się aktywnym białkiem, cięte mogą być również proteiny na segmenty, które również stają się aktywnymi białkami;

-fałdowanie się białka- polipeptyd musi zostać sfałdowany w prawidłową strukturę trzeciorzędową , białka opiekuńcze pomagają w fałdowaniu się białek;

-modyfikacje chemiczne- poszczególne aminokwasy mogą być modyfikowane przez przyłączenie nowych grup chemicznych np. acetylowej, metylowej, fosforanowej; innymi mechanizmami modyfikującymi są np. glikolyzacja, acylacja, fosforylacja;

-wycinanie itein- iteiny są to sekwencje w białku, które są odpowiednikami intronów w mRNA, iteiny mają długość od 300-600 aminokwasów, po wycięciu itein eksteiny muszą być ze sobą połączone;

Klonowanie genów- wektory

Wektor- cząsteczka DNA mogąca być nośnikiem interesującego nas kawałka DNA, która posiada zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek. W wektorze możemy namnożyć interesujący nas fragment (sklonować, jak również możemy przeprowadzić wydajną syntezę kodowanego przez gen białka(wektory ekspresyjne);

Wektory plazmidowe - Nieduże, koliste cząsteczki DNA zawierające oli replikacji, gen markera selekcyjnego (najczęściej odporność na antybiotyk)oraz miejsce do klonowania;

Transformacja E. Coli:

1.w wektorze umieszczamy DNA;

2.wektor w insertem wprowadzamy do komórek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska transformacji;

3.każda komórka komplementarna inkorporuje jeden plazmid;

4.przeprowadzamy selekcje komórek transformowanych;

5.izolujemy DNA plazmidowe;

WYKŁAD 6

Biblioteki (banki) DNA - stanowi zbiór fragmentów DNA danego organizmu włączonych do cząsteczek wektorów i wprowadzonych do komórek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska transformacji. Wyróżniamy dwa rodzaje bibliotek: genomowe, cDNA;

Cel tworzenia: przechowywanie DNA, aby móc je w przyszłości badać i wykorzystywać do różnych celów; biblioteki umożliwiają dostęp do różnych sekwencji DNA; w jednej probówce zebrany jest cały genom.

Biblioteka genomowa - jest reprezentacją całego DNA danego organizmu. Fragmentacji poddaje się genomowe DNA, które następnie łączy się z cząsteczkami określonego wektora. Każda cząsteczka wektora zawiera jedne wbudowany fragment DNA.

Biblioteka musi być reprezentatywna:

Drożdże - genom 2x10⁷pz (20000000 pz);

Potrzeba 5000 klonów w wektorach plazmidowych.

Człowiek - genom 3,3x10⁹ pz;

Potrzeba 80000 klonów w wektorach plazmidowych.

Biblioteka cDNA - zawiera fragmenty cDNA powstałe na matrycy mRNA w wyniku odwrotnej transkrypcji. Jest to reprezentacja tylko aktywnych genów występujących w tkance, z której został wyizolowany mRNA.

Screening banku genów - identyfikacja odpowiedniego klonu;

Bibliotekę wysiewamy na pożywkę stałą z antybiotykiem; potem:

-znajdujemy sondę molekularną do przeszukiwania biblioteki z bazy danych ściąga się informacje na temat genów homologicznych;

-projektujemy startery i amplifikujemy przez PCR fragment genu;

Sonda molekularna - jest to odcinek DNA lub RNA homologiczny do fragmentu, który chcemy odnaleźć (niekoniecznie w pełni komplementarny do poszukiwanej sekwencji). Sonda musi być wyznakowana, czyli związana ze znacznikiem, który umożliwi jej uwidocznienie a zarazem zlokalizowanie zhybrydyzowanej z nią sekwencji.

Metody przeszukiwania:

Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek o komplementarnych sekwencjach nukleotydów. Specyficzność hybrydyzacji zależy od sekwencji i składu nukleotydów, siły jonowej stosowanych buforów oraz temperatury. Stosując warunki „ostre” każda sonda może łączyć się tylko z sekwencją DNA komplementarną w 100%, w warunkach „łagodnych” sonda może łączyć się z sekwencją DNA, nawet jeśli jeden lub kilka nukleotydów nie jest komplementarnych.

Przeszukiwanie bibliotek DNA:

-umieszczenie filtra nitrocelulozowego na szalce w celu przeniesienia fagów z każdej łysinki;

-inkubacja filtra w roztworze alkalicznym w celu lizy fagów denaturacji uwolnionego DNA;

-hybrydyzacja z wyznakowaną sondą, przeprowadzenie autoradiografii;

-sygnał pojawia się w tym miejscu, w którym zachodzi komplementacja DNA faga i sondy;

WYKŁAD 7

Organizmy Modyfikowane Genetycznie - GMO (z ang. Genetically Modified Organism) są to organizmy, które zawierają w swoim genomie (czyli informacji genetycznej organizmu) obce geny, pochodzące z obcego organizmu.

Organizm modyfikowany genetycznie - to organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób nie zachodzący w warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji, w szczególności przy zastosowaniu:

-technik rekombinacji DNA z użyciem wektorów, w tym tworzenia materiału genetycznego poprzez włączenie do wirusa, plazmidu lub każdego innego wektora cząsteczek DNA wytworzonych poza organizmem i włączenie ich do organizmu biorcy, w którym w warunkach naturalnych nie występują, ale w którym są zdolne do ciągłego powielania;

-technik stosujących bezpośrednie włączenie materiału dziedzicznego przygotowanego poza organizmem, a w szczególności: mikroiniekcji, makroiniekcji i mikrokapsułkowania;

-metod nie występujących w przyrodzie dla połączenia materiału genetycznego co najmniej dwóch różnych komórek, gdzie w wyniku zastosowanej procedury powstaje nowa komórka zdolna do przekazywania swego materiału genetycznego odmiennego od materiału wyjściowego komórkom potomnym.

GMO - organizmy modyfikowane genetycznie, są to organizmy, które zawierając w swoim genomie, obce geny pochodzące z obcego organizmu.

Zmodyfikowane zostało większość roślin mających znaczenia dla człowieka. Cele modyfikacji to:

-odporność na herbicydy - chemiczne środki ochrony roślin (np. soja, rzepak);

-odporność na szkodniki - modyfikacja Bt (np. kukurydza, bawełna);

-odporność na choroby wirusowe, grzybowe, bakteryjne (chitynaza, glukanaza, osmotyna, białka płaszcza wirusa, replikazy, proteazy);

-odporność na niekorzystne warunki środowiska (zasolenie gleby, mróz, susza, metale ciężkie);

-poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych (pomidor Flavr Savr, Golden Rice, szczepionki w warzywach);

Strategia postępowania przy modyfikacji genetycznej roślin:

-występowanie cechy przeznaczonej do modyfikacji;

-ustalenie szlaku przemian biochemicznych związanych z daną cechą;

-określenie enzymów katalizujących kluczowe ogniwa szlaku metabolicznego;

-identyfikacja genów kodujących główne enzymy kontrolujące dany szlak metaboliczny;

-przeprowadzenie modyfikacji genetycznej (wyciszyć, wznowić jego ekspresję);

-analiza ekspresji nowej cechy;

-potwierdzenie przydatności technologicznej nowego surowca;

-badania związane z bio-ryzykiem i bezpieczeństwem konsumentów;

Charakterystyka wprowadzanych konstrukcji genowych:

Konstrukcja genowa powinna zawierać:

-gen lub fragment genu niosącego informację o danej właściwości;

-promotor - fragment, który znajdzie się przed genem i do niego przyłącza się polimeraza, najczęściej 355 z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV). Promotor konstytutywny ulega ekspresji we wszystkich komórkach;

-terminator - sekwencja decydująca o zakończeniu transkrypcji, najczęściej z genu kodującego syntezę napalinową u Agrobacterium tumejaciens;

-gen selekcyjny np. oporność na antybiotyk lub herbicyd, służy do selekcji bakterii, do których wprowadzamy gen;

-gen reporterowy - pozwalają na szybkie stwierdzenie czy doszło do transformacji (wizualizujący np. gen vidA, GFp, gen lucyferazy);

vidA - nieprzyżyciowy, przy użyciu można sprawdzić, ale dalej nie można go generować, mimo, ze wiemy, że zaszła transformacja

Transformacja komórek roślinnych

Wprowadzenie do komórki roślinnej egzogennego DNA, a następnie jego integracja z genomem rośliny.

Komórki przeznaczone do transformacji powinny być:

-kompetentne (zdolne do tranformacji);

-totipotentne (zdolne do regeneracji całych organizmów) np. z komórki epidermalnej zregeneruje nam całą roślina;

Komplementarne i totipotentne uzależnione od odmiany a także od organizmu i tkanki.

Do najważniejszych metod transformacji należą:

-transformacja z użyciem Agrobacterium tumefaciens i agrobacterium rhizogenes (u roś) wektory wprowadzane przez plazmidy;

-bezpośrednia transformacja protoplastów - bezwartościowe;

-mikrowstrzelanie cząsteczek metali pokrytych DNA - bezwartościowe;

Agrobacterium tumefaciens:

-żyją w środowisku glebowym;

-plazmid Ti - kolisty;

-składa się z kilku elementów;

Sekwencje graniczne:

-prawy (bez tej proces nie zajdzie, odpowiedzialne za rozpoznawanie i przenoszenie DNA) - - lewy (nie jest niezbędna, poprawiają efektywność procesu);

T-DNA między prawą a lewą sekwencją graniczną

Onkogeny - geny odpowiedzialne za syntezę auksyn i cytokinin, geny warunkujące syntezy opin

Rozwój ....?.... - synteza fitohormonów

Geny wirulencji (region) tam geny odpowiedzialne za

-zabezpieczenie transgenu, tu też kodowane;

-przenoszenie;

-wycinanie T-DNA;

-katalizę opin (źródło N);

W miejscu T-DNA wstawiamy naszą konstrukcję genową, z naszym genem

Infekcja Agrobacterium tumefaciens:

Tylko rośliny dwuliścienne przez nią infekowane. Do środowiska glebowego wprowadzane związki fenolowe, które aktywują geny wirulencji. Powstają białka odpowiedzialne za wycinanie białka T-DNA. Po infekcji powstaje guzowata narośl. T-DNA włączony do genomu komórki roślinnej.

Etapy procesu transformacji:

-bakterie przyczepiają się do komórek roślinnych ( do 200 bakterii może się przyczepić do 1 komórki);

-przeniesienie komórki DNA do komórki roślinnej (kilka obszarów T-DNA może być przeniesione do 1 komórki roślinnej.

Uogólniony model przeniesienia i integracji T-DNA:

-nić T jest przenoszona do komórki roślinnej w postaci kompleksu DnA-białko. Transfer wymaga genów vir zlokalizowanych na plazmidzie Ti i genów chromosomalnych, gdy transgen na terenie jądra komórkowego;

-białko które znajduje się na końcu 5' nić T-DNA wchodzi w interakcję z roślinnym DNA i nacina je;

-jednoniciowa T-DNA jest przyłączona do jedne nici roślinnego DNA a napięcia torsyjne z tym związane powodują rozerwanie drugiej nici roślinnej DNA;

-końce nici 5' są łączone końcami roślinnego DNA na drodze ligacji, dosyntezowana zostaje nić komplementarna do nici T;

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium

Przygotowana konstrukcja genowa, po namnożeniu stransformowanych komórek:

1.Inokulacja -przygotowane komórki bakteryjne w pożywce. Pocięte fragmenty liścia zalewamy tymi bakteriami. Po kilku minutach inkubacji:

2.odpłukanie bakterii. Te co weszły na teren komórki roślinnej to te genomy zostają

3.Umieszczenie eksplantatów na pożywce stymulowanej regeneracją. Dobrze gdyby były czynniki selekcyjne np. antybiotyki, pożywka wzbogacona fitohormonami

4.Gdy wykształcone korzenie, pędy zwiększamy czynnik selekcyjny by przeżyły tylko te, które zostały stransformowane

5.Zregenerowane rośliny trzeba sprawdzić

Efektywność:

-liczba pędów zregenerowanych w warunkach selekcyjnych;

Metoda „floral dip”

-metoda wektorowa;

-unika kultur in vitro;

-wykorzystuje się komórki które w sposób naturalny są przyzwyczajone do dzielenia się. Są to komórki jajowe w woreczku zalążkowym;

-komórki generatywne muszą znajdować się w odpowiednim momencie;

-też wykorzystywany wektor ale pomija kultury in vitro;

-normalnie wysiewany na pożywce z czynnikiem selekcyjnym;

Metody wektorowe

Zalety:

-ochrona wprowadzanego transgenu (chroniony przez białka, które sam produkuje);

-duża wydajność ( kilka % do 10%);

-wysoka częstość integracji fragmentu T-DNA;

Wady:

-mało skuteczna dla roślin 1iściennych, bo po zranieniu nie wytwarzają związków fenolowych, niezbędnych do aktywacji genu vir;

WYKŁAD 8

Bezpośrednia transformacja protoplastów:

-elektroporacja:

--wysokie napięcie (2-10 kV/cm - 5-200 μs) i małe stężenie soli;

--małe napięcie (0,2-0,8 kV/cm - 1-50 ms) i duże stężenie soli;

-zastosowanie PEG-u;

Bezpośrednia transformacja protoplastów:

Zalety:

-możliwość uzyskania dużej liczby protoplastów;

-otrzymuje się klony;

-mniejsza chimeralność w regenerowanych roślinach);

Wady:

-złożone procedury i problemy z regeneracją roślin;

Efektywność transformacji:

Metody tradycyjne - liczba pędów zregenerowanych w warunkach selekcyjnych po potwierdzonej integracji transgenu (metodami molekularnymi) w stosunku do liczby inokulowanych eksplantatów, z których zregenerowano co najmniej jedną roślinę (średnio kilka - kilkanaście roślin ze 100 eksplantatów);

Transformacja protoplastów - liczba kolonii komórkowych rozwijających się na podłożach selekcyjnych z potwierdzoną integracją transgenu w stosunku do wyjściowej liczby protoplastów (kilka - kilkadziesiąt koloni transgenicznych z 10⁶ protoplastów);

Metodyka transformacji:

-przygotowanie mikronośników;

-przygotowanie tkanki roślinnej;

-strzał (prędkość pocisku kilkaset m/s);

-selekcja i regeneracja;

Jeden strzał to:

-500 μg pocisków;

-1 μg DNA;

-jeden pocisk: 0,01-0,1 pg;

Efektywność mikrowstrzeliwania zależy od:

-rodzaju aparatu;

-ciśnienia gazu napędzającego mikronośniki;

-wielkości i rodzaju mikronośników;

-dystansu jaki muszą pokonać;

-podciśnienia w komorze podczas strzału;

-formy plazmidu;

-rodzaju transformowanej tkanki;

Mikrowstrzeliwanie:

Zalety:

-można transformować praktycznie wszystkie tkanki;

Wady:

-wymaga wielu udoskonaleń technicznych (rodzaj nośnika, sposób opłaszczania, parametry strzału);

-wysokie koszty;

Rozpoznanie i identyfikacja roślin transgenicznych:

W genom rośliny zostaje wbudowana tylko część konstrukcji genowej zawarta wewnątrz krótkich fragmentów T-DNA, składa się ona z:

-promotora;

-sekwencji kodującej;

-terminatora;

-markera selekcyjnego, reporterowego;

Kontrolę jakościową i ilościową:

-PCR - analiza kwasów nukleinowych;

-immunodetekcja - analiza produktów białkowych;

Opracowano metody detekcji dla:

-pomidora - z obniżonym poziomem poligalakturonazy;

-ziemniaka - z drożdżową inwertazą;

-soi, kukurydzy, tytoniu, bawełny - z odpornością na choroby wirusowe;

Delta - endotoksyna (Bt):

-najczęściej stosowaną toksyną jest delta - endotoksyna (Bt) z bakterii Bacillus thuringensis;

-Bacillus thuringensis występuje naturalnie w glebie, wodzie i powietrzu. Jeden z najbezpieczniejszych znanych insektycydów.

-odkryta w 1911 roku jako patogen moli mącznych w prowincji Thuringia w Niemczech;

-zastosowanie jako komercyjnego pestycydu rozpoczęło się w 1938 we Francji, potem w latach 50-tych w USA;

-pierwotnie używana tylko jako środek przeciwko Lepidiptera;

Działanie Bt:

-delta - toksyna jest produkowana w postacji protoksyny (130-140 kDa). Do aktywacji wymaga wysokiego pH ~9,5;

-u larw stawonogów z rodziny Lepidopterae w środkowym odcinku jelita pierwotnego występuje pH ~9,5 oraz odpowiednie proteazy;

-po rozpuszczeniu w wysokim pH, protoksyna ulega rozcięciu w specyficznym miejscu. Powstaje toksyna o masie 60 kDa - aktywna delta - toksyna;

-forma ta wiąże się do receptorów na komórkach jelita tworząc pory w błonie komóre jelita i powodując wypływ jonów - destabilizacja;

-jelito ulega zniszczeniu poprzez liże komórek jelita, zahamowanie odżywiania larwy, perforacja jelita umożliwia bakterii zakażenie całej larwy. Następnie obumarcie larwy.

Sposoby pobrania toksyny przez organizmy:

-bezpośrednie zjadanie części rośliny;

-zjadanie owadów, które zjadły wcześniej tą roślinę;

Delta - endotoksyna (Bt);

-stosowanie delta - toksyny w formie Bt - spray;

-w USA stosowany od ponad 30 lat:

-bardzo małe ilości - 5 litrów na hektar;

-nieszkodliwy dla ludzi i zwierząt - przez 30 lat stosowania prowadzono badania;

-obecne badania skupiają się na analizie i obserwacji efektów pobrania produktów obcego genu, poprzez organizmy będące bezpośrednio związane z tymi roślinami w łańcuchu troficznym;

-istnieje konieczność badania efektów tych modyfikacji na gatunki pośrednio związane ze zmienionymi roślinami;

---