(DNA-RNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji
określonego fragmentu RNA.
1. Izolacja i oczyszczanie RNA z komórek i tkanek.
Typowa komórka eukariotyczna zawiera około 10-5 mg RNA. 80-85% stanowią rybosomalne RNA (28S , 18S , 5S). Pozostałe 10-15% to różne rodzaje małocząsteczkowego RNA (tRNA , snRNA i in.). Poszczególne klasy RNA mają określoną wielkość i można je izolować w stosunkowo czystej formie za pomocą technik takich jak elektroforeza , wirowanie w gradiencie gęstości czy chromatografia jonowymienna. mRNA stanowi 1-5% całkowitej ilości RNA w komórce.
Komórki wszystkich organizmów zawierają rybonukleazy - enzymy biorące udział w różnych procesach związanych z metabolizmem RNA. Aby otrzymać niezdegradowany RNA wymagany jest czynnik inaktywujący RNazy np. DEPC (dietylopirowęglan). Dodaje się go do wszystkich odczynników. Ponadto szkło i sprzęt , który ma bezpośredni kontakt z preparatem musi być wysterylizowany w odpowiedni sposób ponieważ RNazy wytrzymują gotowanie i autoklawowanie. Jest to ochrona przed egzogennymi RNazami. Poprzez inkubację preparatu z proteinazą K , traktowanie tiocyjanianem guanidyny , który denaturuje białka czy merkaptoetanolem , który redukuje mostki dwusiarczkowe chroni się preparat przed RNazami endogennymi. Poza tym procedura izolacji RNA jest dość podobna do izolacji DNA.
Bardzo często interesuje nas tylko jeden rodzaj RNA , mianowicie mRNA. Od reszty oddziela się go metodą chromatografii powinowatwa (kolumnowej). Jak wiadomo mRNA ma 3` końcu ma ogon poliadenylowy. Wykorzystujemy tu komplementarność A=T. Wewnątrz kolumny znajduje się złoże (celuloza , sefaroza) z przyłączonymi na powierzchni odcinkami poli-T. Przez kolumnę przepuszczany jest roztwór całkowitego RNA. Adsorbcji ulegną tylko mRNA. Inne rodzaje RNA przepłyną przez kolumnę. Następnie po przeprowadzeniu przez kolumnę specjalnego buforu powodującego odłączenie mRNA od złoża , otrzymujemy u wylotu spływający roztwór oczyszczonego mRNA.
2. Elektroforeza RNA w żelach.
Z uwagi na silną tendencję RNA do tworzenia skomplikowanych struktur drugo- i trzeciorzędowych , które w znaczący sposób mogą wpływać na migrację cząsteczek w żelu , powodując tym samym rozdział uzależniony nie tylko od wielkości (czego chemy uniknąć) elektroforeza prowadzona jest w warunkach denaturujących. Najczęściej do tego celu stosuje się mocznik , formaldehyd , formamid lub środki , które powodują odwracalną chemicznie modyfikację znoszącą odziaływania prowadzące do wytwarzania struktur przestrzennych jak np. roztwór glioksalu. Elektroforeza może być przeprowadzana w żelach agarozowych lub akrylamidowych.
3. Przeniesienie RNA na filtr (Northern blot).
Technika nie różni się zasadniczo od Southern blot.
4. Hybrydyzacja z sondą i odpłukiwanie.
Aby nie narażać RNA na wysokie temperatury stosuje się w roztworze prehybrydyzacyjnym i hybrydyzacyjnym formamid co pozwala zredukować temperaturę do 42°C. Warunki te są odpowiednie dla hybrydyzacji kwasów o pełnej homologii. W samej procedurze nie ma znaczących różnic w porównaniu z poprzednią techniką.
5. Autoradiografia. Możliwa jest ilościowa analiza RNA , co znajduje zastosowanie np. przy porównywaniu ilości poszczególnych mRNA w komórce w różnych warunkach.
(c) 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster
|