RÓŻNE TECHNIKI CZYLI TRZY ŁYKI PRAKTYKI.
TECHNIKA SOUTHERN
(DNA-DNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji określonego fragmentu DNA.
Etapy :
1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.
Jeżeli musimy wyizolować DNA z tkanki lub organizmu pierwszym etapem będzie homogenizacja czyli roztarcie na jednolitą masę. Nie jest to konieczne gdy materiałem są komórki w roztworze np. bakterie w pożywce czy krew. Następne etapy są na ogół dość podobne. Obejmują cykl dodawania różnych roztworów (np. lizozymu - enzymu niszczącego ściany komórkowe w przypadku bakterii , detergentów destabilizujących błony komórkowe itp.) , wielokrotnego wirowania a także jeśli zachodzi potrzeba podczyszczania preparatu z białek (np. denaturacja przy użyciu fenolu) i RNA (np. wytrącanie octanem amonu i trawienie RNazą).
2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.
3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ. Po rozdziale na żelu DNA zostaje zdenaturowany pod wpływem NaOH a następnie poddaje się go działaniu roztworu neutralizującego o pH 7,4.
4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z zachowaniem ich charakterystycznego rozmieszczenia. Umożliwia to siła ssąca bibuły przy transferze kapilarnym. Możliwy jest także elektrotransfer. Następnie DNA zostaje związany z filtrem przez zapiekanie w 80°C lub przez naświetlanie UV.
5. Hybrydyzacja z sondą.
a. Prehybrydyzacja - polega na moczeniu filtru w odpowiednim roztworze , którego składniki blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze. Nylon i nitroceluloza , z których produkuje się filtry mają wysokie powinowactwo do jednoniciowego DNA czy RNA. Po przeniesieniu badanego materiału jest to już cecha niekorzystna. W celu zminimalizowania tła wynikającego z hybrydyzacji sondy do losowych cząsteczek DNA lub RNA dodaje się również niehomologiczne DNA nośnikowe. Od tego etapu uzależniona jest czułość i specyficzność eksperymentu. Eliminuje niespecyficzne tło. Warunki prehybrydyzacji - stężenie soli , temperatura - są takie same jak właściwej hybrydyzacji.
b. Właściwa hybrydyzacja - w tym właśnie etapie wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi. Dobranie odpowiednich warunków zapewnia specyficzność czyli wiązanie sondy tylko z określonymi fragmentami oraz czułość. W przypadku gdy mamy 100% lub dość wysoką homologię stosujemy ostrzejsze warunki : wyższą temperaturę (65°C) , mniejsze stężenie soli , czasami dodatek formamidu. Gdy homologia jest częściowa , wymagane są mniej ostre warunki : niższa temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli. Sondę przed dodaniem należy zawsze zdenaturować w wysokiej temperaturze ponieważ musi być ona w postaci jednoniciowej , co umożliwi jej związanie na filtrze.
c. Płukanie filtru - pozwala na usunięcie niezhybrydyzowanej sondy co jest warunkiem specyficznego obrazu hybrydyzacji.
6. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.
TECHNIKA NORTHERN
(DNA-RNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji
określonego fragmentu RNA.
Etapy :
1. Izolacja i oczyszczanie RNA z komórek i tkanek.
Typowa komórka eukariotyczna zawiera około 10-5 mg RNA. 80-85% stanowią rybosomalne RNA (28S , 18S , 5S). Pozostałe 10-15% to różne rodzaje małocząsteczkowego RNA (tRNA , snRNA i in.). Poszczególne klasy RNA mają określoną wielkość i można je izolować w stosunkowo czystej formie za pomocą technik takich jak elektroforeza , wirowanie w gradiencie gęstości czy chromatografia jonowymienna. mRNA stanowi 1-5% całkowitej ilości RNA w komórce.
Komórki wszystkich organizmów zawierają rybonukleazy - enzymy biorące udział w różnych procesach związanych z metabolizmem RNA. Aby otrzymać niezdegradowany RNA wymagany jest czynnik inaktywujący RNazy np. DEPC (dietylopirowęglan). Dodaje się go do wszystkich odczynników. Ponadto szkło i sprzęt , który ma bezpośredni kontakt z preparatem musi być wysterylizowany w odpowiedni sposób ponieważ RNazy wytrzymują gotowanie i autoklawowanie. Jest to ochrona przed egzogennymi RNazami. Poprzez inkubację preparatu z proteinazą K , traktowanie tiocyjanianem guanidyny , który denaturuje białka czy merkaptoetanolem , który redukuje mostki dwusiarczkowe chroni się preparat przed RNazami endogennymi. Poza tym procedura izolacji RNA jest dość podobna do izolacji DNA.
Bardzo często interesuje nas tylko jeden rodzaj RNA , mianowicie mRNA. Od reszty oddziela się go metodą chromatografii powinowatwa (kolumnowej). Jak wiadomo mRNA ma 3` końcu ma ogon poliadenylowy. Wykorzystujemy tu komplementarność A=T. Wewnątrz kolumny znajduje się złoże (celuloza , sefaroza) z przyłączonymi na powierzchni odcinkami poli-T. Przez kolumnę przepuszczany jest roztwór całkowitego RNA. Adsorbcji ulegną tylko mRNA. Inne rodzaje RNA przepłyną przez kolumnę. Następnie po przeprowadzeniu przez kolumnę specjalnego buforu powodującego odłączenie mRNA od złoża , otrzymujemy u wylotu spływający roztwór oczyszczonego mRNA.
2. Elektroforeza RNA w żelach.
Z uwagi na silną tendencję RNA do tworzenia skomplikowanych struktur drugo- i trzeciorzędowych , które w znaczący sposób mogą wpływać na migrację cząsteczek w żelu , powodując tym samym rozdział uzależniony nie tylko od wielkości (czego chemy uniknąć) elektroforeza prowadzona jest w warunkach denaturujących. Najczęściej do tego celu stosuje się mocznik , formaldehyd , formamid lub środki , które powodują odwracalną chemicznie modyfikację znoszącą odziaływania prowadzące do wytwarzania struktur przestrzennych jak np. roztwór glioksalu. Elektroforeza może być przeprowadzana w żelach agarozowych lub akrylamidowych.
3. Przeniesienie RNA na filtr (Northern blot).
Technika nie różni się zasadniczo od Southern blot.
4. Hybrydyzacja z sondą i odpłukiwanie.
Aby nie narażać RNA na wysokie temperatury stosuje się w roztworze prehybrydyzacyjnym i hybrydyzacyjnym formamid co pozwala zredukować temperaturę do 42°C. Warunki te są odpowiednie dla hybrydyzacji kwasów o pełnej homologii. W samej procedurze nie ma znaczących różnic w porównaniu z poprzednią techniką.
5. Autoradiografia. Możliwa jest ilościowa analiza RNA , co znajduje zastosowanie np. przy porównywaniu ilości poszczególnych mRNA w komórce w różnych warunkach.
TECHNIKA WESTERN BLOT
(białko-przeciwciało) - wiązanie przeciwciała w celu identyfikacji określonego białka.
Etapy :
1. Przygotowanie ekstraktów komórkowych.
Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek są bardzo różnorodne a ich wybór zależy od właściwości danego białka.
2. Rozdział białek w żelach poliakrylamidowych. W zależności od zastosowanego układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości fizykochemicznych. Przyjmuje się , że elektroforeza w obecności SDS (dodecylosiarczan sodowy) - detergent - frakcjonuje białka zależnie od ich masy czyli zarazem długości łańcucha polipeptydowego. Eliminuje efekt różnicowania pod względem kształtu. SDS powoduje denaturację białka , dysocjację podjednostek (rozbija wiązania niekowalencyjne) i opłaszczenie. Około1,4 gr SDS wiąże się z 1 gr białka. Ten typ elektroforezy jest najczęściej stosowany i może być użyty jako metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych badań. Złożem , w którym następuje rozdział jest żel poliakrylamidowy. Z reguły do rozdziału białek używana jest szczególna wersja elektroforezy tzw. elektroforeza nieciągła , która umożliwia maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce oznacza to , że zarówno żel składa się jakby z dwóch warstw (żel rozdzielający i zatężający różniące się składem procentowym) jak również bufor do elektroforezy inny jest w górnym inny w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki nakładane na żel mogą mieć stosunkowo dużą objętość ponieważ w czasie przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma aby w dolnym żelu ulec rozdzieleniu na pojedyncze , ostre prążki. Dzięki temu , że frakcjonowanie zachodzi w zależności od długości łańcucha polipeptydowego jesteśmy w stanie ustalić masę cząsteczkową danego białka przez porównywanie z odpowiednimi standardami o znanych masach , z dokładnością do 5-10%.
3. Renaturacja.
Inkubacja z odpowiednim buforem.
4. Transfer białek z żelu na membranę nitrocelulozową.
Z reguły elektrotransfer.
5. Immunoblotting.
Jednym z niebezpieczeństw jest to , że białka zaadsorbowane do nitrocelulozy mogą mieć nieco zmieniony układ przestrzenny aminokwasów a ponieważ rozdzielane są w żelu w formie zdenaturowanej a następnie muszą ulec renaturacji , mogą w ogóle nie przyjmować swojej natywnej postaci.
a. Zablokowanie miejsc niespecyficznych.
b. Inkubacja ze specyficznymi dla poszukiwanego białka przeciwciałami.
c. Inkubacja z odczynnikiem używanym do detekcji.
Najczęściej są to II (drugorzędowe) przeciwciała czyli przeciwciała , dla których antygenem jest przeciwciało specyficzne. II przeciwciała związane są z barwnikami fluorescencyjnymi , cząstkami złota lub enzymami. Systemy detekcyjne muszą być proste i czułe. Można wykryć za ich pomocą nawet 10-9 do 10-12 gr białka. II przeciwciała mogą być skoniugowane z enzymem , który zmienia kolor substratu podczas reakcji np. z AP - alkaliczną fosfatazą (w zależności od użytego substratu utworzony związek jest ciemno niebieski lub purpurowy) lub z HRP - peroksydazą szczurzą (utlenienie odpowiednich substratów prowadzi do powstawania ciemnego strątu w miejscu reakcji). Innym systemem detekcji jest awidyna lub streptawidyna skoniugowana z enzymem (AP lub HRP). Awidyna i streptawidyna silnie wiążą się z biotyną. I przeciwciała znakuje się biotyną a zamiast II przeciwciał do detekcji używa się awidyny lub streptawidyny skoniugowanej z enzymem. Ponieważ jedna cząsteczka awidyny lub streptawidyny związana jest z kilkoma cząsteczkami enzymu system detekcji jest bardziej czuły niż w przypadku użycia przeciwciał.
Następny system to tzw. system NIP. Stworzony aby ograniczyć ilość niespecyficznych reakcji II przeciwciał. I przeciwciała znakuje się nitrojodofenolem (NIP) , II przeciwciała skoniugowane z enzymem są skierowane przeciwko NIP. Ponieważ NIP jest związkiem drobnocząsteczkowym reakcja przeciwciał jest bardzo specyficzna. Kolejny rodzaj to systemy nieenzymatyczne. Na przykład II przeciwciała wyznakowane koloidalnym złotem lub radioaktywnie (125I). W pierwszym przypadku uzyskuje się bezpośrednie uwidocznienie reakcji , w drugim detekcja wymaga autoradiografii.
ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU
Wiele metod biologii molekularnej opiera się na wykorzystaniu wyznakowanych cząsteczek kwasów nukleinowych. Dobra sonda powinna mieć wysoką aktywność , odpowiednią czystość i specyficzność. Najpowszechniej wykorzystywane do znakowania są cząsteczki nukleotydów, w których jeden z atomów zastąpiony został izotopem radioaktywnym. Aktywność specyficzna zależy od proporcji włączonych nukleotydów radioaktywnych do normalnych. Krótszy okres półtrwania izotopu również powoduje zwiększenie aktywności specyficznej. Najczęściej stosowane są dwa izotopy : fosfor 32P (włączany w pozycji a lub g cząsteczki trifosforanu nukleotydu) oraz siarka 35S (włączana w miejsce atomu tlenu odpowiedniej reszty fosforanowej - a lub g). Fosforu radioaktywnego używa się gdy wymagane jest uzyskanie sondy o wysokiej aktywności co zapewnia dużą czułość i krótki czas detekcji. Podstawowym zastosowaniem siarki jest sekwencjonowanie DNA a także badanie metabolizmu białek.
Najczęściej używane radioizotopy. |
|||
Radioizotop |
Czas półtrwania |
Energia emitowanych cząstek (MeV) |
Specyficzna aktywność wyznakowanych składników (mCi/mmol) |
Tryt |
12,35 lat |
0,0186 |
102-105 |
Węgiel - 14 |
5730 lat |
0,156 |
1 - 102 |
Siarka - 35 |
87,5 dnia |
0,167 |
1 - 106 |
Fosfor - 33 |
25,5 dnia |
0,248 |
10 - 104 |
Fosfor - 32 |
14,3 dnia |
1,709 |
10 - 105 |
* MeV = 106 elektronowoltów. Powyżej podana maksymalna energia. |
|||
# mCi (miliCurie) - miara liczby rozpadów na jednostkę czasu. 1 mCi = 2,2.109 rozpadów na minutę. |
W zależności od konkretnego zastosowania stosuje się różne metody znakowania DNA :
Nick translation
- DNaza I wprowadza do cząsteczki jednoniciowe pęknięcia (nick). Polimeraza I dzięki swojej aktywności 5`-3` egzonukleazy usuwa nukleotydy przed sobą a za sobą dobudowywuje nowe włączając między innymi również nukleotydy radioaktywne. W ten sposób przesuwa niejako miejsce pęknięcia. Wydajność inkorporacji wynosi około 50%. Metoda ta daje najlepsze wyniki przy znakowaniu całych plazmidów a nie jest raczej zalecana do fragmentów liniowych.
Random priming
- najczęstsza , oparta jest na hybrydyzacji oligonukleotydów (6 do 9 nukleotydów) o przypadkowej sekwencji do DNA , który ma być wyznakowany. Następnie polimeraza Klenowa (fragment polimerazy DNA I nie posiadający aktywności egzonukleolitycznej 5`-3`) dosyntetyzowuje komplementarną nić DNA poczynając od 3` OH końca przyłączonego startera. W mieszaninie reakcyjnej znajdują się także radioaktywne nukleotydy włączane stopniowo do nowo syntetyzowanej nici. Długość znakowanych fragmentów nie wpływa na wydajność reakcji. Można w ten sposób uzyskać sondę o wysokiej aktywności. Metoda jest doskonała zarówno do znakowania całych plazmidów jak i liniowych fragmentów.
Znakowanie DNA na końcach.
- Znakowanie 5` końca.
W tej metodzie używa się kinazy polinukleotydowej faga T4 , która przenosi grupę fosforanową z pozycji g ATP na DNA lub RNA zawierające grupę hydroksylową na 5` końcu.
Ponieważ normalnie cząsteczki DNA zawierają grupę fosforanową na 5` końcu należy przed znakowaniem poddać je działaniu alkalicznej fosfatazy , która spowoduje jej usunięcie. Metoda najczęściej stosowana do znakowania syntetycznych oligonukleotydów.
- Znakowanie 3` końca.
Terminalna transferaza dołącza deoksyrybonukleotydy na 3` końcu. Nie wymaga matrycy. Substratem dla tego enzymu może być zarówno jednoniciowe jak i dwuniciowe DNA.
- Wypełnianie lepkich końców. W tej metodzie używa się fragmentu Klenowa , który dobudowuje brakujące na 3` końcu nukleotydy w cząsteczkach strawionych enzymami restrykcyjnymi tworzącymi lepkie końce 5`. Wydajność inkorporacji sięga niekiedy nawet 90%.
Po znakowaniu niezbędne jest oddzielenie niewłączonych radioaktywnych dNTP , które mogłyby ujemnie wpływać na jakość hybrydyzacji dając zbyt wysokie tło czyli zmniejszając specyficzność reakcji. Rozdzielenie uzyskuje się przez sączenie na kolumienkach ze specjalnym złożem , które zatrzymuje związki drobnocząsteczkowe przepuszczając makrocząsteczki.
Ilościowe oznaczenie wyznakowania osiąga się przez pomiar aktywności sondy. Jest on możliwy za pomocą dwóch urządzeń : licznika Geigera i licznika scyntylacyjnego . Zliczają one zarejestrowane rozpady promieniotwórcze w jednostce czasu. Jednostką podstawową jest cps - (counts per second) zliczenie na sekundę lub dpm - (disintegrations per minute) liczba rozpadów promieniotwórczych na minutę.
Wykrywanie wizualne wyznakowanych cząsteczek w celu zlokalizowania prążka , który z sondą zhybrydyzował jest możliwe dzięki autoradiografii. Starszą metodą jest poddanie naświetlaniu kliszy pokrytej emulsją fotograficzną czułą na napromieniowanie w specjalnych kasetach. Klisza położona na filtr ulega zaczernieniu w miejscu hybrydyzacji z sondą. Kasetę taką przechowuje się przez pewnien czas , odwrotnie proporcjonalny do aktywności sondy , w temperaturze - 70°C. Niska temperatura sprzyja ostrości prążków. Następnie klisza jest wywoływana. Nowszą metodą jest ekspozycja filtru w innych kasetach. Jest tu niezbędne specjalne urządzenie tzw. phosphoimager sprzężony z komputerem , który umożliwia zeskanowanie powierzchni kasety i obróbkę uzyskanych w ten sposób danych. Przy pomocy programu komputerowego Image Quant jesteśmy w stanie oszacować nawet intensywność zaczernienia.
ELEKTROFOREZA - WĘDRÓWKA W ŻELU.
Elektroforeza - technika stosowana przy rozdziale , analizie i oczyszczaniu kwasów nukleinowych i białek.
DNA i RNA mają ładunek ujemny i zgodnie z tym ładunkiem , nadawanym przez grupy fosforanowe , migrują w polu elektrycznym w kierunku anody. Szybkość migracji zależy od wielkości i kształtu cząsteczki.
Schemat postępowania jest następujący : żel ulega zestaleniu w formie cienkiej płytki na podstawce tzw. saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem , który następnie wyciąga się.
W zastygłym żelu znajduje się szereg dołków , do których wprowadzane są próbki DNA oraz z reguły tzw. standard czyli mieszanina cząsteczek o znanych masach dzięki czemu możliwa będzie później kalibracja żelu. Przed naniesieniem na żel próbki muszą być odpowiednio przygotowane : dodawany jest barwnik , który informuje nas później jak daleko zaszły najszybsze cząsteczki (co jest niezbędne ponieważ DNA w żelu nie widać) oraz związek interkalujący - bromek etydyny , który fluoryzuje w świetle UV co pozwoli nam na zlokalizowanie prążków.
Minimalna ilość DNA , którą widać na żelu w postaci prążka to 20 ng. Ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 200 ng ponieważ obserwuje się przeładowanie kieszonki. Żel umieszczony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodzącym prąd. Podłączony zostaje do zasilacza generującego prąd o stałym i określonym napięciu i natężeniu. Jakość rozdziału fragmentów DNA zmniejsza się w miarę zwiększania napięcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jakości stosuje się napięcie nie większe niż 5V na 1cm długości żelu.
Kalibracja wielkości fragmentów cząsteczek w żelu opiera się na zasadzie , że liniowe cząsteczki DNA migrują w żelu agarozowym z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu dziesiętnego ich masy cząsteczkowej wyrażonej w Daltonach lub w tysiącach par zasad czyli kb. Kalibracja żelu polega na wykreśleniu krzywej zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy przez poszczególne fragmenty od logarytmu masy cząsteczkowej.
Elektroforezę można przeprowadzać w żelach natywnych lub denaturujących.
1. Żele agarozowe.
Metoda szybka , prosta , powszechnie stosowana. Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów w żelu , których rozmiary są zdeterminowane przez stężenie agarozy. Żeli bardziej stężonych tj. 1,4-2,0 % używa się do rozdziału cząsteczek mniejszych (0,5-2,0 kb). Żele mniej stężone 0,5-0,7 % stosuje się do rozdziału cząsteczek większych (10-20 kb i więcej).
Zaletą może być niekiedy fakt , że podczas elektroforezy możliwe jest rozdzielenie cząsteczek o tej samej wielkości ale zróżnicowanych pod względem kształtu. Doskonałym przykładem jest rozdział trzech różnych form plazmidu : CCC (ang. covalently closed circle) , liniowej i OC (ang. open circle). Pierwsza najszybciej wędruje w żelu , druga nieco wolniej , trzecia najwolniej.
2. Żele akrylamidowe.
Powstają przez polimeryzacje monomerów akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań poprzecznych przez bisakrylamid. Można regulować sieciowanie poprzez manipulację proporcjami stężeń akrylamidu do bisakrylamidu. Do zajścia reakcji niezbędna jest obecność odpowiedniego katalizatora (PERS - nadsiarczan potasowy) i związku inicjującego reakcję (TEMED). Żele te stosuje się przy rozdziale fragmentów o wielkości od kilku par zasad (20% poliakrylamid) do tysiąca par zasad (3% poliakrylamid) a także przy rozdziale jednoniciowych cząsteczek DNA np. do sekwencjonowania.
3. Żele denaturujące.
Ponieważ szybkość migracji w żelu jednoniciowych cząsteczek , zależy nie tylko od ich wielkości i ładunku ale także w dużym stopniu od ich struktury przestrzennej (w przypadku dwuniciowych cząsteczek DNA nie ma to większego znaczenia) aby dokładnie określić ich wielkość należy weliminować różnice w szybkości migracji wywołane różną konformacją cząsteczki. Jest to szczególnie ważne w przypadku jednoniciowego RNA , które tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. W tym właśnie celu stosuje się żele denaturujące agarozowe lub poliakrylamidowe. Najczęściej używanymi czynnikami denaturującymi są : formaldehyd i glioksal w żelach agarozowych (przy analizie preparatów RNA) lub mocznik w żelach poliakrylamidowych (przy analizie jednoniciowych fragmentów DNA).
4. Elektroforeza w polu pulsacyjnym.
Stosowana do rozdzielenia dużych cząsteczek DNA - od 2.104 do 107 bp czyli od 20 kb do 10 Mb. Można w ten sposób rozdzielić całe chromosomy np. drożdżowe. Pole elektryczne jest włączane i wyłączane w krótkich odstępach czasu. Kiedy pole elektryczne jest włączone cząsteczki migrują zgodnie ze swoją wielkością a gdy zostaje wyłączone mają tendencję do relaksacji i zwijania w przypadkowe pętle. Czas wymagany do relaksacji jest wprost proporcjonalny do długości cząsteczki. Następnie kierunek pola elektrycznego jest zmieniany o 90 lub 180 stopni w stosunku do poprzedniego. Dłuższe cząsteczki zaczynają poruszać się wolniej niż krótsze. Powtarzające się zmiany kierunku pola stopniowo powodują rozdzielenie.
IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA.
Izolacja z żelu jest niezbędnym etapem w szeregu doświadczeń. Jest konieczna gdy po rozdziale pragniemy wykorzystać do dalszej pracy pewną określoną frakcję materiału lokującego się w odpowiednim prążku.
Istnieje wiele metod odzyskiwania DNA z żeli jednak żadna z nich nie jest pozbawiona wad.
Istotne problemy przy izolacji to :
- obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych np. obecne w agarozie zanieczyszczenia w postaci polisacharydów , które hamują aktywność enzymów używanych przy dalszej obróbce klonowanego DNA
- niezbyt duża skuteczność odzyskiwania dużych fragmentów DNA ponieważ wydajność izolowania jest funkcją ciężaru cząsteczkowego tych fragmentów , za wielkość graniczną dla dobrej izolacji przyjmuje się długość 5 kb
- im mniejsza ilość DNA na żelu tym mniejsza wydajność jego odzyskiwania , izolacja staje się nieskuteczna przy ilościach mniejszych niż 500 ng
- nie ma możliwości izolacji jednocześnie kilku fragmentów o różnej długości.
Metody :
1. Izolacja DNA z użyciem DEAE-celulozy.
Polega na przyczepieniu się migrującego DNA do umieszczonej w żelu membrany z DEAE-celulozą , którą następnie odpłukuje się z zanieczyszczeń buforem o niskiej sile jonowej a potem eluuje z niej DNA buforem o wysokiej sile jonowej. Należy pamiętać , że z membran nie podlega elucji jednoniciowe DNA oraz fragmenty powyżej 15 kb.
2. Elektroelucja do woreczków dializacyjnych.
Najefektywniejsza do izolacji dużych fragmentów DNA - powyżej 5 kb. Po odpowiednim rozdzieleniu wycina się konkretny prążek DNA , umieszcza w woreczku dializacyjnym , który wkłada się do aparatu do elektroforezy i prowadzi ją przez jakiś czas po czym na krótko odwraca się bieguny i prowadzi elektroforezę przez minutę co pozwala na uwolnienie DNA ze ścian woreczka. Woreczek dializacyjny zostaje przepłukany odpowiednim buforem i po dodaniu kilku specjalnych odczynników i wirowaniu otrzymujemy preparat DNA.
3. Metoda "freeze-sqeeze".
Jest to bardzo szybka metoda izolacji. Tak jak poprzednio po elektroforezie zostaje z żelu wycięty konkretny prążek. Fragment żelu umieszczony w probówce , na dnie której znajduje się niewielka ilość silikonowej szklanej waty , zamraża się w ciekłym azocie (freeze) a następnie wkłada się jedną probówkę w drugą po zrobieniu w tej pierwszej niewielkiego otworku na dnie. Kolejnym etapem jest wirowanie (sqeeze). Uzyskany w ten sposób bufor poddaje się jeszcze kilku zabiegom wytrącania i wirowania , po których otrzymujemy wyizolowane DNA.
SEKWENCJONOWANIE - SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY.
Sekwencjonowanie - metoda , dzięki której możliwe jest ustalenie sekwencji czyli określenie kolejności nukleotydów. Jeden z etapów analizy genu. Na podstawie sekwencji istnieje możliwość przewidzenia kolejności aminokwasów w białku , które jest kodowane przez dany gen.
Są dwie metody sekwencjonowania :
- Enzymatyczna - metoda Sangera
Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się in vitro DNA. Syteza przebiega od radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` końca matrycy. Reakcję wykonuje się równolegle w czterech probówkach , w których oprócz kompletu deoksytrifosforanów nukleotydów (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilość jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemożliwia kontynuowanie reakcji w momencie włączenia takiego nukleotydu w syntetyzowany łańcuch , ponieważ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` końcu.
Synteza zostaje zahamowana losowo - powstaje mieszanina fragmentów o różnej długości.
|
Produkty reakcji poddawane są elektroforezie w czterech równoległych ścieżkach na żelu poliakrylamidowym. Pozwala to na ustalenie sekwencji nici komplementarnej do badanej. |
- Chemiczna - metoda Maxama-Gilberta
Jest to metoda praktycznie już nie stosowana.
Polega na degradacji wyznakowanych na 5` końcu cząsteczek DNA związkami chemicznymi przecinającymi specyficznie wiązania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym określonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbiór fragmentów DNA o różnej długości co spowodowane jest takim doborem warunków , że w poszczególnych cząsteczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wiązania. Fragmenty z czterech niezależnych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela się elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Prążki na autoradiogramie odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na końcu 5` znakowany fosfor a na końcu 3` określoną zasadę.
Obydwie metody pozwalają na odczytanie sekwencji około 400 do 700 nukleotydów w jednym doświadczeniu. Jeśli sekwencjonujemy dłuższy odcinek należy go pociąć enzymem restrykcyjnym i ustalać sekwencję każdego fragmentu osobno.
PCR - Z MAŁEJ ILOŚCI DUŻA ILOŚĆ W KRÓTKIM CZASIE.
PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction) polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankujących określony odcinek DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów. Jest to metoda alternatywna do klonowania i może być używana w celu amplifikacji nawet bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie ale warunkiem jest znajomość sekwencji otaczającej powielany fragment. W praktyce wystarczy tylko jedna cząsteczka matrycy.
Typowa reakcja PCR polega na powtarzających się cyklach :
1. DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze około 90°C. Syntetyczne oligonukleotydy długości mniej więcej 20 nukleotydów komplementarne do 3` końców kawałka DNA , którego powieleniem jesteśmy zainteresowani , dodane są w dużym nadmiarze molowym do zdenaturowanego DNA.
2. Temperatura zostaje obniżona do 40-60°C. DNA pozostaje zdenaturowany ponieważ komplementarne łańcuchy są w zbyt niskiej koncentracji , w porównaniu z ilością starterów , aby zrenaturować. Specyficzne oligonukleotydy hybrydyzują z komplementarnymi sekwencjami w DNA (tzw. annealing) i służą jako startery do syntezy DNA , którą prowadzi termostabilna DNA polimeraza tzw. Taq polimeraza izolowana z bakterii Thermus aqaticus.
3. Synteza odbywa się w temperaturze 72°C.
Następnie cała mieszanina jest podgrzewana znowu do 95°C aby rozdysocjować nowo powstałe dupleksy DNA. Później temperatura jest obniżana i zachodzi następna runda syntezy. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane są odcinki DNA o różnej długości. Stopniowo zaczynają przeważać fragmenty ograniczone straterami a końcowy produkt jest praktycznie jednorodny. W każdym cyklu liczba kopii sekwencji pomiędzy primerami rośnie wykładniczo jak 2n gdzie n jest liczbą cykli.
Amplifikacja fragmentu DNA metodą PCR. |
|
Numer |
Liczba dwuniciowych , zamplifikowanych cząsteczek DNA |
1 |
0 |
2 |
0 |
3 |
2 |
4 |
4 |
5 |
8 |
6 |
16 |
7 |
32 |
8 |
64 |
9 |
128 |
10 |
256 |
11 |
512 |
12 |
1024 |
13 |
2048 |
14 |
4096 |
15 |
8192 |
16 |
16 384 |
17 |
32 768 |
18 |
65 536 |
19 |
131 072 |
20 |
262 144 |
21 |
524 288 |
22 |
1 048 576 |
23 |
2 097 152 |
24 |
4 194 304 |
25 |
8 388 608 |
26 |
16 777 216 |
27 |
33 544 432 |
28 |
67 108 864 |
29 |
134 217 728 |
30 |
268 435 456 |
31 |
536 870 912 |
32 |
1 073 741 824 |
Po powieleniu DNA może być poddany analizie restrykcyjnej , hybrydyzacyjnej czy sekwencjonowaniu.
ZASTOSOWANIE :
PCR może być używany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy :
- analizowaniu mutacji związanych z szeregiem chorób genetycznych
- diagnostyce chorób dziedzicznych
- ustalaniu ojcostwa w sądownictwie
- ustalaniu pochodzenia śladów krwi , włosów itp. w kryminalistyce
- namnażaniu DNA z mumii egipskich czy szczątków wymarłych organizmów
- wykrywania we krwi obecności wirusów takich jak np. HIV.
RODZAJE PCR :
RAPD-PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragmentów genomu dzięki zastosowaniu krótkich starterów (około 10 nukleotydów) o losowo dobranej sekwencji.
Na pewno zwiążą się one z DNA w jakimś miejscu a ponieważ jednorazowo do każdej reakcji dodawany jest jeden rodzaj startera zakłada się występowanie sekwencji typu odwróconych powtórzeń w takiej odległości od siebie w genomie , która pozwoli na wydajną amplifikację czyli 300 do 1500 par zasad. Elektroforetyczny obraz prążków jest charakterystyczny dla osobnika. Ten rodzaj PCR znalazł zastosowanie w określaniu stopnia pokrewieństwa między organizmami a także m.in. w kryminalistyce w celach identyfikacji.
RT-PCR - PCR połączona z odwrotną transkrypcją czyli materiałem wyjściowym do namnażania jest mRNA a nie jak zazwyczaj DNA.
ZAZĘBIONA PCR - umożliwia zamplifikowanie odcinka DNA zawartego w większym uprzednio namnożonym fragmencie.
PCR in situ - nowa technika pozwalająca na przeprowadzenie reakcji w tkance bez naruszania jej struktury np. na preparacie mikroskopowym.
PCR ILOŚCIOWA - za pomocą pomiaru intensywności reakcji barwnych jesteśmy w stanie zmierzyć po określonej liczbie cykli ilość powstałego produktu. Jest to szczególnie istotne dla substancji występujących w bardzo niewielkich ilościach. Można w ten sposób szacować poziom ekspresji genu kodującego konkretne białko mierząc ilość mRNA.
WSZYSTKO CO BIOTECHNOLOG MUSI MIEĆ W LABORATORIUM I NIE TYLKO.
Odczynniki z jakimi pracuje biolog molekularny są nieraz bardzo niebezpieczne dla zdrowia jak chociażby izotopy radioaktywne czy substancje rakotwórcze. Dlatego też niezbędne są minimalne zabezpieczenia w postaci jednorazowych rękawiczek , fartuchów , okularów i ekranów ochronnych itp.
Substancje z jakimi się pracuje to poczynając od najprostszych związków chemicznych jak np. chlorek sodu przez enzymy , bufory , kończąc na całych zestawach przygotowywanych przez firmy i sprzedawanych w pakietach służących konkretnemu celowi np. znakowaniu.
Aparatura.
Podstawowe urządzenia laboratoryjne to :
- wirówki i ultrawirówki , które umożliwiają rozdział badanych próbek w probówkach na frakcje w wyniku wirowania z ogromną prędkością - od kilku tysięcy do kilkuset tysięcy obrotów na minutę
|
Otwarta wirówka |
- urządzenia do mieszania i wytrząsania zawartości probówek tzw. worteksy
- lampa ultrafioletowa i aparat do robienia zdjęć żeli
- najróżniejsze w kształcie , rozmiarze i kwestii przeznaczenia probówki i statywy do nich
- pipety , standardowo odmierzające z dokładnością od dziesiętnych części mikrolitra do mililitra oraz jednorazowe końcówki do pipet tzw. tipsy
- aparaty do elektroforezy
|
- łaźnie wodne
- cieplarki
- chłodziarki , zamrażarki - niezbędna jest dość szeroka gama temperatur od minus kilkudziesięciu °C do plus kilku
- bloki grzejne
- bloki chłodzące
- wyciągi
- komora laminarna , w której jest ciągły przepływ sterylnego powietrza
- autoklaw do sterylizacji sprzętu w 120 °C
- suszarka
- masa szkła laboratoryjnego : szalki petriego , pipety szklane , kolby miarowe , cylindry , zlewki , lejki itd.
Bardziej wyrafinowane urządzenia to :
- termocykler do metody PCR
|
Aparat do przeprowadzania reakcji PCR |
- armatka genowa
|
Armatka genowa |
- spektrofotometr
- mikroskop fluorescencyjny
- urządzenia do automatycznego sekwencjonowania
|
Urządzenie do automatycznego sekwencjonowania |
- phosphoimager.
W tej chwili także bez komputera obyć się nie sposób.
Reszta jest już mieszanką cierpliwości , talentu , szczęscia i rzetelnej wiedzy...