Immunologiczne zróżnicowanie limfocytów. Technika rozet spontanicznych E

Ponad 50% limfocytów krwi obwodowej człowieka tworzy rozetki spontaniczne E z erytrocytami barana dzięki obecności receptorów dla tych erytrocytów w błonie limfocytów T. Ilość komórek tworzących rozetki spontaniczne (ilość limfocytów T) ulega obniżeniu w przebiegu nowotworów, niektórych chorób wirusowych oraz po leczeniu środkami immunosupresyjnymi. Limfocyty T prawdopodobnie mają więcej niż jeden typ receptora E. Badania wykazały, że ludzkie limfocyty T mają dwa oddzielne, chociaż strukturalnie podobne receptory: dla krwinek czerwonych barana i małpy Rhesus. Około 70% ludzkich limfocytów krwi obwodowej tworzy rozety E z krwinkami czerwonymi barana i nieco mniej (60-70%) z erytrocytami małpy. Limfocyty B w odróżnieniu od T tworzą rozetki pośrednie EA, i EAC. Rozetki EA powstają przez łączenie się fragmentów Fc immunoglobuliny opłaszczonej erytrocytami z receptorami Fc występującymi napowierzchni limfocytów B. Nie jest to test rozpoznający jedynie limfocyty B, gdyż receptory Fc posiadają też makrofagi, monocyty i neutrofile. Rozetki EA tworzy około 30% leukocytów krwi. Rozetki EAC powstają poprzez połączenie kompleksu erytrocyt-przeciwciało-dopełniacz z obecnym na limfocycie B receptorem dla składnika C3 dopełniacza. Receptor dla składnika C3 dopełniacza posiadają także monocyty, makrofagi i neutrofile. Rozetki EAC tworzy od 10% do 20% leukocytów. Rozetki spontaniczne E często stosowana technika oceny fenotypu limfocytów krwi obwodowej pozwala na określenie ilości populacji limfocytów T. Limfocyty T posiadają receptor dla krwinek czerwonych barana antygen CD2, które wiążą erytrocyty barana i tworzą z nimi formy rozetkowe. Zmieszanie limfocytów ludzkich z co najmniej 50-krotnie większą liczba ercs (erytrocytów) barana. Jest to często stosowana technika oceny fenotypu limfocytów krwi obwodowej, chociaż już przestarzała. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie populacji limfocytów T. Limfocyty T posiadające receptor dla krwinek czerwonych barana (antygen CD2), wiążą erytrocyty barana i tworzą z nimi formy rozetkowe (rozety E).

Limfocyty

Posiadają one wąski pasek jasnoniebieskiej cytoplazmy, duże kuliste jądro, gęstą chromatynę, są czerwone, zwykle nie posiadają ziarnistości, jednak czasami występują ziarnistości azurochłonne (u dużych limfocytów). B i T są nie do odróżnienia pod mikroskopem. Wielkość ich to 5-12/15μm, można je podzielić na małe 5-8μm, 8-10μm średnie, duże 10-12μm. Małych jest we krwi najwięcej i są one komórkami pamięci, długo żyjącymi. Należy podkreślić, że limfocyty mogą spełniać różne funkcje, a także różnicować się w komórki innego typu - stąd też określenie „limfocyt" ma jedynie znaczenie morfologiczne, a nie funkcjonalne. Niektóre limfocyty mają krótki okres życia rzędu kilku dni, morfologicznie należą do wszystkich trzech kategorii limfocytów. Część limfocytów jest długo żyjąca (u człowieka kilka lat i dłużej) i te morfologicznie należą do klasy małych limfocytów. Dużą ich część stanowią komórki pamięci immunologicznej. Limfocyty są komórkami pełniącymi główną rolę zarówno w odpowiedzi humoralnej jak i komórkowej. Występujące w krwi obwodowej limfocyty są na ogół (około 90%) komórkami długo żyjącymi, gdyż są to przede wszystkim limfocyty pamięci, a krótko żyjące limfocyty, stanowiące około 10% ogólnej liczby limfocytów są komórkami dziewiczymi, które jeszcze nie zetknęły się z antygenem. Limfocyty recyrkulują między krwią i chłonką przebywając przez różny okres czasu w narządach limfatycznych. Limfocyty stanowią 20-25% ogólnej liczby leukocytów krwi obwodowej. Większość (70 - 80%) krążących limfocytów stanowią limfocyty T, 20 - 30% to limfocyty B. Nie można ich odróżnić w mikroskopie świetlnym, konieczne jest zastosowanie do tego celu różnych testów, np. testów rozetkowych. Poza krwią występują w limfie, tkance (grasica, śledziona, węzły chłonne). Są komórkami okrągłymi o zasadochłonnej cytoplazmie, zwierają 1-3 jąderek oraz niewielką liczbę mitochondriów. Komórki zaangażowane w odpowiedź immunologiczną np. limfocyty i plazmocyty wytwarzające przeciwciała, czy uczulone limfocyty biorąc udział w reakcji typu komórkowego (np. w odrzuceniu przeszczepów) określamy jako „komórki efektorowe”, nie używa się natomiast w stosunku do nich nazwy „komórki kompetentne". Nazwa „klon limfocytów" odnosi się do grupy komórek powstałych przez proliferację i różnicowanie pod wpływem antygenu z jednej komórki macie­rzystej, immunologicznie kompetentnej. W skład klonu mogą wchodzić zarówno komórki immunologicznie kompetentne, jak i komórki efektorowe. Limfocyty są głównymi komórkami układu odpornościowego zdolnymi do swoistego rozpoznawania poprzez swoiste receptory różnych determinant anty­genowych. Limfocyty określamy jako „kompetentne immunologicznie” jeśli mają zdolność swoistego rozpoznania antygenu lub też swoistej odpowiedzi na niego. Bez zastosowania specjalnych metod cytochemicznych limfocyty T i B są morfologicznie nie do odróżnienia. Do cech różniących je można zaliczyć a) powstanie w odrębnych, pierwotnych narządach limfatycznych, b) zasiedlanie odrębnych obszarów w obwodowych narządach limfatycznych, c) charakterystyczne markery powierzchniowe, d) wywoływanie typów reakcji immunologicznych. Limfocyty T, są pochodzenia grasiczego, oraz limfocyty B, pochodzenia szpikowego. Każda z tych linii (populacji) limfocytów ma odmienne antygeny różnicowania na powierzchni komórki. Limfocyty są komórkami wyso­ce wyspecjalizowanymi, których różnicowanie związane jest z dwoma cechami -swoistością dla antygenu i określoną funkcją w układzie immunologicznym. Każ­da subpopulacja posiada swoiste antygeny różnicowania (differentiation antigens) na powierzchni, warunkujące jej fenotyp i jest równocześnie genetycznie zaprogramowana do pełnienia określonej funkcji.

Kaletka Fabrycjusza- narząd limfopoetyczny, workowaty uchyłek kloaki u ptaków, dochodzi tam do różnicowania limfocytów

Immunologiczne zróżnicowanie limfocytów

W życiu płodowym ssaków komórki stanowiące punkt wyjścia limfopoezy, zwane komórkami pnia (stem cells), wędrują z worka żółtkowego do wątroby płodowej i szpiku kostnego. W życiu pozapłodowym komórki pnia występują jedynie w szpiku kostnym. Prekursory limfocytów T po opuszczeniu szpiku przedostają się do krwioobiegu, a stamtąd do grasicy. W grasicy ulegają zróżnicowaniu, tj. procesowi, który obok proliferacji obejmuje także ekspresję na powierzchni limfocytów T antygenów zróżnicowania oraz wytworzenie tolerancji immunologicznej w stosunku do własnych antygenów. Różnicowanie dotyczy także wytworzenia klonów komórkowych mających receptory powierzchniowe dla różnych antygenów. W eliminacji "klonów zakazanych", reagujących z własnymi antygenami prezentowanymi przez antygeny zgodności tkankowej, ważny jest kontakt limfocytów z komórkami nabłonka grasicy posiadającymi na swej powierzchni dużą ilość antygenów MHC. W procesie różnicowania limfocytów T biorą udział hormony grasicy - tymozyna (m.cz. 12 000 Da), tymopoetyna (m.cz. 7 000 Da), humoralny czynnik grasicy oraz inne hormony i interleukiny (IL-1, IL-2). Otrzymanie przeciwciał monoklonalnych przeciw antygenom ludzkich limfocytów T umożliwiło identyfikację i charakterystykę antygenów różnicowania. Wyróżniono trzy etapy różnicowania. W I etapie pro-tymocyty wykazują ekspresję antygenów CD2 i CD7. Antygen CD2 (dawna nazwa T 11) związany jest ze zdolnością limfocytów T człowieka do tworzenia rozetek z erytrocytami barana (rozetki E). Znaczniki CD2 i CD7 występują na wszystkich formach rozwojowych limfocytów T. W korze grasicy tymocyty nabywają antygeny CD5, CD9 i CD10, przy czym CD9 jest obecny na tymocytach tylko w I stadium różnicowania, gdy przebywają one w korze, grasicy. W miarę dojrzewania (II stadium różnicowania) komórki T nabywają antygeny CD1 i CD3 oraz antygeny CD4 i CD8. Wykazują więc równoczesną ekspresję antygenów CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 i CD10. W III etapie różnicowania tymocyty wędrują do rdzenia, tracą antygen CD1, przy czym następuje segregacja na dwie subpopulacje CD4 lub CD8. Antygen CD3 (T3) uczestniczący w tworzeniu kompleksu receptora po związaniu ze specyficznym dla danego klonu antygenem występuje we wszystkich dojrzałych limfocytach T. Komórki noszące marker CD4 wykazują funkcje pomocnicze (jest ich ok. 55 - 657. w krwi obwodowej), natomiast limfocyty posiadające marker CD8 spełniają funkcje cytotoksyczne i supresorowe (stanowią 20 - 307. limfocytów krwi). Limfocyty T po opuszczeniu grasicy tracą marker CD10, przechodzą do krwioobiegu, skąd przenikają do stref grasiczozależnych układu limfatycznego. Po kontakcie z antygenem limfocyty T proliferują i przekształcają się w krótko żyjące komórki efektorowe oraz limfocyty pamięci o długim okresie życia. Limfocyty B człowieka różnicują się i dojrzewają w szpiku kostnym. W czasie tego procesu nabywają immunoglobuliny powierzchniowe klasy IgM, które spełniają rolę receptora dla antygenu. W tym stadium dojrzewania eliminacji ulegają klony "zakazane", rozpoznające własne antygeny. Następnie limfocyty B opuszczają szpik i osiedlają się w strefach grasiczoniezależnych układu limfatycznego, gdzie podlegają dalszym etapom różnicowania: zwiększa się gęstość powierzchniowych IgM, pojawiają się powierzchniowe IgD, występują też inne receptory, np. receptor dla składnika C3 dopełniacza oraz receptor dla fragmentu Fc immunoglobulin. Ponieważ receptor Fc oraz receptor dla składnika C3 dopełniacza obecny jest także na innych komórkach, najważniejszym markerem limfocytów B są powierzchniowe immunoglobuliny. Po kontakcie z antygenem limfocyty B ulegają transformacji blastycznej, przekształcają się w komórki plazmatyczne wytwarzające przeciwciała, oraz w długo żyjące limfocyty B pamięci.

Identyfikacja i określanie liczebności różnych subpopulacji limfocytów na podstawie ekspresji antygenów różnicowania dostarcza cennych informacji dotyczących stanu układu immunologicznego, np. u pacjentów z niedoborami immunologicznymi i białaczkami. Największe znaczenie diagnostyczne mają: antygeny różnicowania - CD3, którego obecność na powierzchni błony komórkowej jest charakterystyczna dla dojrzałych limfocytów T, antygen CD4 występujący na limfocytach T pomocniczych oraz CD8 występujący na limfocytach T cytotoksycznych i supresorowych. W celu dokładnego określenia liczby komórek posiadających poszczególne markery stosuje się techniki umożliwiające ich wykrywanie w pełnej krwi, gdyż każda ze znanych metod rozdziału komórek krwi powoduje utratę niektórych subpopulacji limfocytów. Szerokie zastosowanie znalazły techniki immunofluorescencyjne oraz immunoenzymatyczne. Metody immunofluorescencyjne, w których przeciwciała swoiste w stosunku do poszczególnych receptorów lub antygenów znakowane są barwnikami fluorescencyjnymi (np. izotiocyjanianem fluoresceiny) wymagają użycia mikroskopu fluorescencyjnego. Zastąpienie barwnika fluorescencyjnego enzymem (np. alkaliczną fosfatazą) umożliwia otrzymanie w wyniku jego działania cząstek barwnych widocznych w zwykłym mikroskopie świetlnym. Metoda ta polega na tym, że elementy morfotyczne heparynowanej krwi żylnej po odwirowaniu i przepłukaniu w celu usunięcia białek plazmy inkubuje się z poliklonalnymi lub monoklonalnymi przeciwciałami zdolnymi do rozpoznania i markerów lub receptorów powierzchniowych. Przeciwciała te mogą być sprzęgnięte z fosfatazą alkaliczną lub mogą być wykrywane przez przeciwciała antyglobulinowe sprzęgnięte z fosfatazą. Nie związane z komórkami przeciwciała usuwa się przez przemywanie komórek, a komórki zawiesza się w autologicznej plazmie i wykonuje rozmazy na szkiełkach podstawowych. Rozmazy utrwala się, a utworzone kompleksy wykrywane są przez dodanie substratu dla alkalicznej fosfatazy. W metodzie tej otrzymane rozmazy zawierają taką samą liczbę i ten sam skład procentowy komórek jak pełna krew.

Antygeny różnicowania (markery CD)

Wprowadzenie przeciwciał monoklonalnych swoistych dla jednej determinan­ty antygenowej pozwoliło ustalić, że pewne grupy tych przeciwciał (cluster) roz­poznają ten sam antygen (nazywany również „markerem") różnicowania. Ostate­cznie dla określenia antygenu przyjęto określenie CD (cluster of differentiation, antygen różnicowania) i jest on definiowany poprzez grupę przeciwciał monoklo­nalnych w połączeniu z arbitralnie, według kolejności odkrycia, przyznanym nu­merem. Ta zunifikowana nomenklatura została zastosowana najpierw do limfocytów ludzkich, obecnie stosuje sieją do homologicznych markerów u innych zwierząt, a także rozszerzono ją na markery występujące na innych komórkach i antyge­nach rozpuszczalnych. Tak np. poprzednie antygeny Ly2 u myszy i T8 u ludzi noszą obecnie u obu gatunków nazwę CD8. Znanych jest obecnie ponad 170 anty­genów CD. Ogólnym markerem limfocytów T jest antygen CD2 (LFA-2), który jest receptorem dla krwinek barana (SRBC). Dotąd w wielu pracowniach ozna­cza się odsetek limfocytów T we krwi, określając, ile komórek przyłącza w sposób nieswoisty SRBC, tworząc wokół siebie rozetki.

Rozwój limfocytów B w szpiku kostnym

Limfocyty B dzielą się na subpopulacje zgodnie z klasą immunoglobuliny, którą syntezują. Limfocyty B wywodzą się z hematopoetycznych komórek macierzystych. W życiu płodowym limfocyty B powstają w wątrobie płodowej, a po urodzeniu w szpiku kostnym. Ośrodki rozmnażania w obwodowych narządach limfatycznych również są miejscami, w których dojrzewają limfocyty B. Rola szpiku kostnego jako centralnego narządu limfatycznego polega na wytwarzaniu limfocytów B z różnymi receptorami dla antygenu (z różnymi przeciwciałami powierzchniowymi) oraz na eliminowaniu limfocytów B, których receptory reagują z antygenami własnymi. Wczesne stadia rozwoju limfocytów B (podobnie jak limfocytów T) są niezależne od stymulacji egzogennymi antygenami. Przeciwciała kodowane są przez skupiska genów, które ulegają rearanżacji we wczesnym etapie rozwoju limfocytów B, co umożliwia syntezę specyficznych receptorów dla antygenu odmiennych na każdym limfocycie B. Receptory dla antygenu ulegają ekspresji na powierzchni limfocytów B i takie limfocyty B, które wiążą za pośrednictwem tych receptorów własne antygeny, zostają wyeliminowane. Immunoglobuliny M to pierwsze przeciwciała, które ulegają ekspresji na limfocytach B, a po nich dochodzi do ekspresji immunoglobulin D. Obie klasy immunoglobulin występują łącznie na tych samych limfocytach B (koekspresja IgM i IgD). Takie dojrzałe limfocyty B mające na swojej powierzchni zarówno IgM, jak i IgD mogą wykazywać ekspresję innych klas immunoglobulin, wszystkich o takiej samej specyficzności, jednakże wymaga to już aktywacji przez antygen i pomocy limfocytów T. Pierwszymi przeciwciałami występującymi w krwiobiegu płodu oraz tuż po urodzeniu są immunoglobuliny M, a następnie IgG i IgA. Podczas różnicowania limfocytów B pojawiają się na ich powierzchni cząsteczki niezbędne do pełnienia przez te komórki właściwych funkcji. Są to między innymi cząsteczki MHC klasy II i CD19. Limfocyty B, które występują w obwodowych tkankach limfatycznych, proliferują pod wpływem aktywacji antygenem dojrzewają, stając się komórkami plazmatycznymi lub limfocytami pamięci. Ośrodki rozmnażania stanowią miejsca, w których powstają limfocyty pamięci oraz odbywa się dojrzewanie powinowactwa przeciwciał dzięki hipermutacjom zachodzącym, w genach dla regionu zmiennego. W wyniku takich mutacji dochodzi do ekspresji na limfocytach B zmodyfikowanych receptorów, które wykazują większe powinowactwo do antygenu niż receptor oryginalny i przeżywają jako limfocyty B pamięci. Limfo­cyty B wytwarzają zarówno przeciwciała powierzchniowe, jak i wydzielnicze, przy czym te pierwsze pełnią funkcję receptorów dla antygenu. Przeciwciała pojawiają się najpierw w cytoplazmie limfocytów pre-B, we wczesnym etapie dojrzewania limfocytów B, a następnie ulegają ekspresji na powierzchni komórki, gdzie pełnią funkcję receptorów dla antygenu.

Ptaki mają wyspecjalizowany narząd, w którym rozwijają się limfocyty B, torebkę Fabrycjusza (bursa Fabricii), od którego pochodzi nazwa komórek: B (bursa). Ssaki nie mają specjalnego narządu do rozwoju wyłącznie limfo­cytów B, a komórki te rozwijają się z hematopoetycznych komórek macie­rzystych, które występują w odpowiednim mikrośrodowisku wątroby płodowej, po urodzeniu zaś w mikrośrodowisku szpiku kostnego.

Rola szpiku kostnego jako centralnego narządu limfatycznego polega na: a) wytwarzaniu dużej liczby limfocytów B ze specyficznymi receptorami dla antygenu, tak aby zapewnić wystarczającą różnorodność limfocytów B, by mogły one rozpoznawać miliony antygenów mikroorganizmów występujących w środowisku, które nas otacza (generowanie różnorod­ności); b) eliminowaniu limfocytów B, które mają receptory o zbyt dużym powinowactwie do własnych cząsteczek (negatywna selekcja: tolerancja pierwotna). Wczesne stadia rozwoju limfocytów B (podobnie jak limfocy­tów T) są niezależne od egzogennych antygenów. Dojrzałe limfocyty B opuszczają szpik kostny i migrują naczyniami krwionośnymi do obwodo­wych narządów i tkanek limfatycznych, gdzie pod wpływem stymulacji antygenowej przekształcają się w komórki plazmatyczne lub limfocyty pamięci. Miejscem dojrzewania limfocytów B są również ośrodki rozmna­żania narządów i tkanek limfatycznych.

Różnorodność receptorów dla antygenu

Przeciwciała podobnie jak receptory limfocytów T, kodowane są przez różne warianty genów występujących w skupiskach które ulegają rearanżacji w stadium limfocytów pro-B. Rearanżacja jest procesem złożonym który umożliwia rozwój wielu limfocytów B o rożnej specyficzności. Generowanie różnorodności receptorów dla antygenów przebiega przy braku obcych białek, powstaje zatem duża liczba dojrzałych limfocytów B, z których tylko część ma receptory dla substan­cji obcych lub mikroorganizmów występujących w otoczeniu. Pierwsze ulegają rearanżacji geny dla części zmiennej łańcucha H (łańcucha cięż­kiego) cząsteczki przeciwciała, które łącznie z genami dla części stałej cząsteczki w szczególności geny kodujące łańcuch ciężki ulegają transkrypcji jako pierwsze w procesie różnicowania i pojawiają w cytoplazmie. Na tym etapie ulegają rearanżacji geny już limfocytów pre-B, odpowiedzialne za kodowanie części zmiennej łańcucha L (łańcu­cha lekkiego). Transkrypty łańcuchów H i L ulegają rekombinacji i powstaje funkcjonalny transkrypt umożliwiający syntezę receptora dla antygenu klasy IgM, który ulega ekspresji na powierzchni niedojrzałego limfocytu B. W tym stadium limfocyty B o dużym powinowactwie do własnych antygenów giną w drodze apoptozy (selekcja negatywna). Podobnie jak w grasicy, większość limfocytów B w szpiku kostnym ginie z powodu syntezy receptorów dla antygenu, które nie zostały prawidłowo skonstruowane lub są skierowane przeciwko własnym antygenom. IgM jest pierwszym przeciwciałem, które ulega ekspresji na powierzchni limfocytu B i jednocześnie pełni funkcję receptora dla antygenu. Następ­nie, na tym samym limfocycie B, dochodzi do ekspresji IgD o takiej samej swoistości antygenowej. Części zmienne przeciwciał IgM i IgD na tej samej komórce są identyczne. Prawdopodobna rola powierzchniowych przeciwciał IgD dotyczy regulacji funkcji limfocytu B podczas zetknięcia z antygenem. Niektóre limfocyty B mogą wykazywać ekspre­sję innych, oprócz IgM i IgD, klas przeciwciał, w tym IgA, IgG lub IgE, lecz wszystkie przeciwciała wytwarzane przez ten sam limfocyt B wyka­zują tę samą swoistość antygenową niezależnie od klasy immunoglobuliny. Ekspresja receptorów dla antygenu innych klas odbywa się pod wpływem aktywacji antygenowej oraz z udziałem limfocytów T i cytokin. Powstawanie różnych klas immunoglobulin zachodzi w wyniku translokacji genów części stałych różnych łańcuchów ciężkich. Pierwszymi przeciwciałami, które są syntetyzowane przez limfocyty B płodu i pojawiają się w jego krążeniu oraz są nadal syntetyzowane po urodzeniu, są przeciwciała IgM. Dopiero w jakiś czas po urodzeniu rozpoczyna się wytwarzanie przeciwciał IgG i IgA. We wczesnych stadiach rozwoju limfocytów B dochodzi do ekspresji powierzchniowych cząsteczek wchodzących w skład kompleksu recep­tora dla antygenu limfocytów B. Równie wcześnie dochodzi do ekspresji cząsteczek MHC klasy II, umożliwiających limfocytom B prezentację antygenów. Ośrodki rozmnażania są szczególnymi strukturami w obrębie obwodowych tkanek limfatycznych. Odbywają się w nich tak ważne procesy, jak powstawanie limfocytów pamięci oraz dojrzewanie powinowactwa przeciwciał . Grudki pierwotne limfocytów B w obwodowych narządach limfatycznych, np. węzłach chłonnych, śledzionie, zbudowane są ze skupień limfocytów B. Limfocyty B w grudkach pierwotnych, pod wpływem stymulacji antygenowej oraz sygnałów od limfocytów T zaczynają proliferować, przylegają do komórek dendrytycz­nych grudek (FDC) i zapoczątkowują tworzenie ośrodków rozmnażania. Aktywowane limfocyty B tracą powierzchniowe IgM oraz IgD i prze­łączają się na syntezę IgG lub IgA (zwykle w tkance limfatycznej błon śluzowych). W tym czasie dochodzi do hipermutacji genów części zmiennej , po czym syntetyzowane są receptory powierzchniowe o nieznacznie zmienionej sekwencji aminokwasów. Wiele takich zmodyfiko­wanych receptorów nie potrafi rozpoznać tego samego antygenu, który zapoczątkował ich syntezę, nie mogą zatem ponownie podlegać stymulacji przez ten antygen. Inne z kolei potrafią silniej wiązać ten sam antygen, który zwykle odnajdują na powierzchni komórek dendrytycznych gru­dek w postaci kompleksów antygen/przeciwciało. Tak więc limfocyty B z receptorami o większym powinowactwie do antygenu przeżywają, proliferują i niektóre z nich dojrzewają w limfocyty pamięci, które pozo­stają w ośrodkach rozmnażania, bądź dołączają do puli recyrkulujących limfocytów. Inne z kolei, dojrzewają i stają się komórkami plazmatycznymi, które syntetyzują i wydzielają przeciwciała określonej klasy.

Komórki B dojrzewają w szpiku kostnym i opuszczają go z receptorem wiążącym antygen na powierzchni błony.

1. Rozwój komórek B

a. U ssaków komórki B pochodzą ze szpikowych komórek macierzystych. W czasie dojrzewania komórki B przechodzą wiele rearanżacji genów. Proces ten ustala swoistość antygenową komórek B przed wędrówką do obwodowych narządów limfatycznych. Późniejsze somatyczne wszystkie komórki z wyjątkiem gamet rozrodczych, rekombinacje genów umożliwiają linii komórkowej przełączenie klasy immunoglobuliny na inną bez zmiany w swoistości antygenowej.

b.Komórka B dojrzewa do jednego z dwóch typów komórek pod wpływem obecności antygenu i interleukin wydzielanych przez komórki środowiska.

1. Komórka plazmatyczna ma rozbudowane, szorstkie retikulum endoplazmatyczne i aktywnie wydziela duże ilości przeciwciał, które były zakotwiczone w błonie
   macierzystej komórki B.

2. Komórka pamięci B jest komórką długo żyjącą, która jest progenitorem odpowiedzialnym za szybką proliferację komórki plazmatycznej w odpowiedzi anamnestycznej.

c.Gdy komórka B przemieszcza się do krwi i obwodowych tkanek limfatycznych, niesie na swojej powierzchni immunoglobuliny i jest zdolna do interakcji z antygenem.

1. Kontakt między epitopem antygenowym a immunoglobuliną w błonie komór­ki B wyzwala podział komórki.

2. Proces ten jest znacznie wzmacniany przez interleukiny wydzielane przez komórki Th.

2. Markery powierzchniowe komórek B

a. Immunoglobulina (głównie monomeryczny IgM) jest obecna na błonie komórki B jako podstawowy marker.

(1) Powierzchniowe IgM (sIgM) działa jako miejsce rozpoznające antygen i swoiście wiąże epitopy.

(2) Ta interakcja zapoczątkowuje różnicowanie komórki B do komórki plazmatycznej.

b. Inne markery, obecne na powierzchni komórki poza immunoglobulinami, obejmują;

1. Receptory dla części Fc cząsteczek immunoglobulin (np. FcyRII).

2. Antygeny CD

1. CD10 występuje głównie na niedojrzałych komórkach B. Antygen ten występuje również na komórkach nowotworowych w małym procencie
   pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (commoti acute lymfocytic leukemia) i stąd nazywany jest antygenem CALLA.

2. CD 19, 20, 21, 22 i 23 są również znajdowane na błonie komórki B. Ich funkcja jest nieznana, lecz najprawdopodobniej biorą udział w aktywacji
   komórki.

3. Składniki dopełniacza C3b i C3d.

4. Cząsteczki klasy I i II MHC.

Rozwój limfocytów T w grasicy

Limfocyty T powstają w grasicy z komórek prekursorowych wywodzących się z komórek macierzystych szpiku kostnego. Prekursorowe limfocyty T ulegają w obrębie grasicy różnicowaniu w dojrzałe limfocyty T, wykazujące ekspresję cząsteczek powierzchniowych ważnych dla ich funkcjonowania, receptorów dla antygenu, cząsteczek CD4 lub CD8. W grasicy powstają limfocyty T antygenowo swoiste, które migrują do obwodowych narządów limfatycznych i zapewniają ochronę przeciwko patogennym mikroorganizmom. W grasicy powstaje bardzo duża liczba różnych limfocytów T o odmiennej swoistości antygenowej. Komórki te mają receptory specyficzne dla różnych antygenów. Receptory limfocytów T dla antygenu wytwarzane są przez każdą komórkę na skutek rearanżacji genów dziedziczonych w konfiguracji zarodkowej. Grasica powstaje podczas życia płodowego z trzeciej i czwartej kieszonki gardłowej i przyciąga z udziałem odpowiednich cząsteczek chemotaktycznych prekursorowe komórki T wywodzące się z komórek macierzystych szpiku kostnego. Komórki prekursorowe różnicują się w funkcjonalne limfocyty T pod wpływem grasiczych komórek stromalnych i cytokin. W grasicy komórki prekursorowe, nazywane odtąd tymocytami, tworzą skupienia z korowymi komórkami nabłonkowymi pełniącymi rolę; komórek opiekuńczych, które są bardzo ważne w rozwoju limfocytów T. Kora grasicy jest miejscem, w którym zachodzi intensywna proliferacja tymocytów w 72-godzinnym cyklu. Stąd tymocyty przemieszczają się do rdzenia, przechodzą tu różnicowanie i selekcję, a ostatecznie migrują przez układ krążenia do obwodowych narządów i tkanek limfatycznych gdzie mogą odpowiadać na antygeny mikroorganizmów.Tymocyty podlegają selekcji, w której biorą udział wytworzone receptory. Tymocyty, których receptory słabo wiążą się z cząsteczkami MHC, przeżywają, natomiast te z receptorami silnie wiążącymi cząsteczki MHC i własne antygeny giną w drodze apoptozy (tolerancja pierwotna na antygeny własne) i są usuwane przez makrofagi w drodze fagocytozy. Większość tymocytów powstałych każdego dnia w grasicy ginie w drodze apoptozy, a przeżywa mniej niż 5%. Cząsteczki pełniące ważną rolę w funkcjonowaniu limfocytów T, takie jak CD4, CD8, receptor dla antygenu powstają w różnych stadiach procesu różnicowania. Główną rolą grasicy jako centralnego narządu limfatycznego jest: a) wytworzenie wystarczająco dużej liczby (milionów) limfocytów T z różnymi receptorami dla antygenu, aby w tej liczbie znalazło się przy­najmniej trochę limfocytów specyficznych dla ogromnej liczby antyge­nów mikroorganizmów występujących w środowisku, w którym żyjemy (różnorodność); b) wyselekcjonowanie i umożliwienie przeżycia takich tymocytów, które słabo wiążą własne cząsteczki MHC (selekcja pozyty­wna), oraz wyeliminowanie takich, które zbyt silnie mogą wiązać te same cząsteczki MHC (selekcja negatywna). Rozwój tymocytów zależy od antygenów własnych (cząsteczek MHC), lecz jest niezależny od egzogennych, obcych antygenów. Tymocyty, które przeżyją proces selekcji, migrują do obwodowych tkanek limfatycznych, w których podlegają końcowym etapom dojrzewania i pełnią swoją funkcję, chroniąc organizm przed atakującymi mikroorganizmami. Możliwy jest również pozagrasiczy rozwój limfocytów T, zachodzący najprawdopodobniej wskutek różnicowania komórek prekursorowych pochodzących ze szpiku kostnego w tkankach limfatycznych związanych z błonami śluzowymi. Każdy z limfocytów T wytworzonych w grasicy wykazuje jedną, określoną swoistość antygenową zdeterminowaną przez receptor dla antygenu. Miliony limfocytów T, każdy z receptorami specyficznymi dla innego antygenu, powstają na skutek rearanżacji genów dziedziczonych w konfiguracji zarodkowej. Receptor dla antygenu limfocytów T zbudowany jest z dwóch łańcuchów polipeptydowych, α i β lub γ i δ. Każdy z łańcuchów należy do nadrodziny immunoglobulin, a zatem ma ujednoliconą strukturę domen utworzonych przez wewnątrzłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe. W przeciwieństwie do większości białek orga­nizmu, każdy łańcuch polipeptydowy receptora limfocytów T kodowany jest przez wiele różnych genów.

Subpopulacje limfocytów T:

T_h1- funkcje związane z cytotoksycznymi reakcjami zapalnymi,

T_h2- skierowują odpowiedź na wytwarzanie IgE, IgA, IgG1.

cytotoksyczne T_c CD8 MHC klasy I- zabijają obce komórki_,

pomocnicze T_h (T_h1, T_h2) CD4 MHC klasy II- wydzielanie interleukin (mediatorów krwinek białych),

induktorowe T_i CD4 MHC klasy II- wydzielanie interleukin (są to cytokiny procesu zapalnegocytokiny wpływają na wzrost, proliferację i pobudzanie komórek układu odpornościowego),

supresorowetłumiące, powstrzymujące, blokujące T_s CD8 MHC klasy I- hamowanie wzrostu komórek,

Nadwrażliwość typu T_dth CD4 MHC klasa II - uwalnianie MAF- aktywują makrofagi, oraz MIF- hamują migrację makrofagów (M),

pamięciowe T_m CD8 MHC I, CD4 MHC klasy II pamięć immunologiczna.

Tcs- kontrasupresorowe; odpowiadają za przebieg odpowiedzi immunologicznej przy nadmiarze Ts

Główny układ zgodności tkankowej MHC:

Układ genów MHC odznacza się niezwykłym polimorfizmem. Liczba kombinacji na 1 chromosomie przypuszczalnie przewyższa 3x10⁶. Każdy osobnik może zatem mieć dowolną z 10¹³ konmbinacji cząsteczek MHC, kodowanych przez oba chromosomy. Geny kodujące cząsteczki MHC występują w licznych wariantach allelicznych.

Limfocyty T rozwijają się z komórek macierzystych przybywających do grasicy, która jest miejscem ich proliferacji.

1. Rozwój komórek T. Niedojrzałe komórki T, zwane tymocytami, przechodzą w grasicy wiele stadiów rozwojowych, poprzedzających ich migrację na obwód już jako dojrzałych komórek T.

a. Pewne typy procesów selekcyjnych faworyzują proliferację tymocytów wykazujących restrykcję dla własnych cząsteczek MHC; tzn. że tymocyty są selek­cjonowane według ich zdolności do rozpoznawania antygenów zasocjowanych z cząsteczkami tego samego typu MHC.

1. Selekcjonowane są zarówno komórki pomocnicze T (helper. Th) (restrykcja MHC klasy II), jak i komórki cytotoksyczne T (cystotoxic, Te) (restrykcja MHC klasy I).

2. Ostatnie dowody wskazują, że w tym przypadku selekcji ważne są komórki nabłonkowe grasicy, które wykazują ekspresję glikoprotein MHC zarówno klasy I, jak i klasy II. Mechanizm tego procesu pozostaje nieznany.

b. Dojrzałe komórki T uzyskują swoistość antygenową przez zachodzące rearanżacje genów.

c. Zmieniają się również pewne markery antygenowe uwidocznione na powierzchni komórki T. Te identyfikujące markery powierzchniowe umożliwiają rozróżnienie subpopulacji funkcjonalnych komórek T.

d. Komórki T, jeśli są potencjalnie reaktywne wobec własnych antygenów, pod­legają supresji. Dzieje się to w późnym okresie ich różnicowania się wewnątrz grasicy.

2. Ogólna charakterystyka komórek T

a. Markery powierzchniowe komórek T

(1) Za pomocą przeciwciał monoklonalnych zidentyfikowano na błonie komórek T cząsteczki, które służą głównie jako receptory. Te cząsteczki powierzchniowe obejmują:

1. Cząsteczki MHC klasy I i II.

2. U ludzi antygeny CD (cluster of differentation) (np.CD3, CD4 i CD8).

3. U myszy Thy1, Ly1, Ly2,3 i Ly3T4.

(2) Gdy tymocyt różnicuje się w kierunku danego podtypu komórek T, wówczas na błonie komórkowej przybywa pewnych antygenów CD, inne natomiast są tracone. Tak więc podtypy komórek T można rozróżnić według ich markerów CD.

(a) CD2, CD3 i CD5 są obecne na większości komórek krwi obwodowej.

(i) CD3 jest heteropolimerem o pięciu łańcuchach polipeptydowych; pojawia się późno w różnicowaniu, gdy komórki stają się immunokompetentne. CD3 związany jest z receptorem komórki T dla antygenu. Jest ważny w wewnątrzkomórkowym przekazywaniu syg­nału do inicjacji odpowiedzi immunologicznej w chwili, gdy komórka reaguje z homologicznym epitopem CD3 nie jest bezpośrednio, związany z rozpoznaniem antygenowym, lecz przeciwciała przeciw CD3 blokują swoistą antygenowo aktywację komórek T.

(ii) CD2 jest odpowiedzialny za tworzenie rozet z krwinkami barana (SRBC) w czasie testu E-rozetowego, służącego do oznaczania liczby komórek T.

(iii) CD5 jest obecne na wszystkich komórkach T i na subpopulacji lim­focytów B, które są predysponowane do wytwarzania autoprzeciwciał.

(b) CD4 i CD8 są obecne na różnych efektorowych komórkach T. Receptory te wiążą się z cząsteczkami MHC w czasie prezentacji antygenu komórce T.

3. Surowica przeciwko pewnym markerom powierzchniowym (np. przeciwko CD3) jest immunosupresyjna i jest używana do zapobiegania odrzucaniu przeszczepio­nych tkanek.

b. Receptory komórek T (TCR). Komórki T mają receptory swoiste dla antygenu, które działają jako miejsca rozpoznania antygenu. TCR wykazuje znaczną homologię strukturalną z fragmentem Fab cząsteczki przeciwciała.

(1) Struktura i funkcja

(a) TCR są heterodimerami składającymi się z dwóch nieidentycznych łań­cuchów polipeptydowych, które są połączone wiązaniami dwusiarczkowymi. Zidentyfikowano dwa rodzaje heterodimerów TCR.
Ponumerowano je TCR1 i TCR2, ażeby oddać kolejność ich występowania ontogenetycznego rozwój osobnika od jego narodzin do śmierci.

(i) Ponad 95% komórek T zawiera heterodimer αβ (TCR2); sekwencja aminokwasowa łańcuchów α i β plasuje ten heterodimer w super-rodzinie cząsteczek immunoglobulin. Heterodimer αβ reaguje z anty­genem w początkowych stadiach odpowiedzi komórek T.

(ii) TCR1 składa się z łańcuchów γ i δ i pojawia się jako pierwszy w czasie rozwoju płodowego (u myszy około 14. dnia od zapłodnienia; TCR2 pojawia się 3 dni później).

(iii) Oba łańcuchy heterodimeru są zmienne, przy czym większa zmienność może występować w mniejszym łańcuchu β.

(b) TCR zawiera determinanty idiotypowe, podobnie jak cząsteczki immuno­globulin. Hiperzmienność występuje w szczególnych miejscach każdego łańcucha polipeptydowego w sposób analogiczny do regionów deter­minujących komplementarność (CDR) w cząsteczkach immunoglobulin.

(c) Heterodimer TCR jest niekowalencyjnie związany w błonie komórki T z łańcuchami γ, δ i ε i cząsteczki CD3. Kompleks TCR-CD3 reaguje zarówno z antygenem, jak i z częścią cząsteczki MHC. Różne części regionów hiperzmiennych łańcuchów α i β reagują z:

(i) helikalnymi stronami szczeliny cząsteczki MHC, (ii) epitopem peptydu leżącego na dnie szczeliny.

4. Łańcuch niezmienny γ, stwierdzany jedynie w wewnątrzkomórkowych formach cząsteczki, jest cechą cząsteczek klasy II MHC. Zapobiega on wiązaniu endogennych peptydów, nie dopuszczając w ten sposób do wystąpienia odpowiedzi autoimmunologicznej.

5. Cząsteczki CD4 i CD8 (zależnie od subpopulacji komórek T) również kontaktują się z częścią cząsteczki MHC.

(2) Budowa genetyczna. Genetycznie TCR jest skonstruowany w sposób bardzo podobny do genów immunoglobulin.

1. Trzy segmenty genów biorą udział w syntezie łańcucha α: zmienna (variable, V), łączący (joing, J) i stały (constant, C).

2. Ponadto łańcuch β zawiera segment genów rozmaitości (diversity, D), który ulega ekspresji w polipeptydzie.

3. Podobnie jak w przypadku immunoglobulin, rearanżacja segmentów genów V, J i D odpowiedzialna jest w największej mierze za generowanie różnorodności antygenowej TCR. Dwa hiperzmienne regiony kodowane są w segmencie genowym V, a jeden region kodowany jest w_segmencie, VJ (łańcuch α), lub VDJ (łańcuch β).

c. Limfokiny. Antygeny pobudzają komórki T do uwalniania rozpuszczalnych media­torów białkowych, znanych jako limfokiny (cytokiny wytwarzane przez limfocyty), mające różną aktywność biologiczną.

3. Klasy komórek T i ich funkcje. Subpopulacje limfocytów T zdefiniowano według posiadanych przez nie markerów powierzchniowych (antygeny CD) i funkcji wykony­wanych przez poszczególne subpopulacje.

a. Cytotoksyczne limfocyty T (Tc), zwane również grasiczozależnymi limfocytami cytolitycznymi (cytolytic thymus-dependent lymphocytes — CTL), powodują lizę
komórek docelowych obarczonych antygenem. Te są CD8+ (tj. mają na swojej powierzchni marker CD8).

1. Komórki Tc uwalniają organizm od komórek mających obcy lub nie swój antygen. Komórki Tc są indukowane i są aktywne przeciwko nowotworom, komórkom zakażonym wirusem i sztucznie wprowadzonym tkankom alogenicznym (np. tkan­ka przeszczepiona od innego genetycznie przedstawiciela tego samego gatunku).

2. Komórki Te zwykle podlegają restrykcji MHC.

1. Podczas reagowania z antygenami wirusowymi lub nowotworowymi komór­ki Tc rozpoznają epitop obcego peptydu w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy I. Zarówno epitop, jak i cząsteczki klasy I muszą być homologiczne z tymi, które oryginalnie indukowały funkcję Tc.

2. Restrykcja MHC nie bierze udziału w odrzucaniu przeszczepu przez komórki Tc.

b. Limfocyty pomocnicze T (helper, Th) mają struktury CD4+ i rozpoznają swoisty antygen w połączeniu z homologicznymi cząsteczkami MHC klasy II.

1. Niektóre Th współpracują z komórkami B i makrofagami w indukcji humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Podobne komórki współpracują z innymi komórkami T
   w ułatwianiu wytwarzania komórek Tc głównie przez wydzielanie interleukin 2 i 6.

2. Subpopulacje komórek Th występują u myszy, u ludzi i prawdopodobnie również u innych gatunków zwierząt. Odgrywają one ważną regulacyjną rolę w odpowiedzi zarówno humoralnej, jak i komórkowej.

(a) Komórki Th1 odpowiedzialne są za funkcje związane z cytotoksycznością i lokalnymi reakcjami zapalnymi łącznie z:

(i) Promocją rozwoju limfocytów Tc, ujawnianiem się nadwrażliwości typu późnego (przez aktywację makrofagów) i produkcją IgG2. Komórka Th1 jest prawdopodobnie „induktorem" komórek zaan­gażowanych w nadwrażliwości typu późnego.

(ii) Dominacją w wydzielaniu interferonu gamma (IFN-y); ponadto inter­leukin 2 i 3, TNF-α i limfotoksyny (TNF-β). INF-γ stymuluje ekspresję receptorów Fc na makrofagach, co wzmaga cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał. INF-γ reguluje również funkcję komórki Th2.

(b) Komórki Th2 skierowują odpowiedź immunologiczną na wytwarzanie IgE (i stąd w kierunku chorób atopowych), IgA i IgGl.

(i) Th2 wydzielają interleukiny 3, 4, 5, 6 i 10. Interleukiny 4, 5 i 6 stymulują

wytwarzanie przeciwciał. IL-4 wzmaga też przełączenie klasy na IgE

(ii) Komórki Th2 promują proliferację eozynofili (przez IL-5) i komórek

tucznych (przez IL-3 i IL-4 działające synergistycznie).

(c) Subpopulacje Th wzajemnie się hamują.

(i) INF-y wydzielany przez komórki Th1 hamuje dojrzewanie komórek Th2 i zmniejsza skutki działania wspomagającego IL-4 (produkowanej przez komórki Th2) na syntezę IgE i IgG1.

(ii) IL-10, wytwarzana przez komórki Th2, hamuje wytwarzanie komórek
Thl. IL-10 ma jeszcze inną rolę w krzyżowej regulacji: hamuje syntezę
cytokin przez komórki Th1. Dlatego komórki Th2 są jednym z typów komórek supresprowych.

c. Induktorowe limfocyty T posiadające na swojej powierzchni struktury CD4+ rozpoznają antygeny związane z cząsteczkami MHC klasy II. Aktywują komórki Th, komórki supresorowe (Ts), komórki Tc i makrofagi, w przeciwieństwie do komórek Th CD4+, które działają głównie na komórki B.

d. Limfocyty supresorowe (Ts) są CD8+

(1) Komórki te są indukowane z prekursorów przez kontakt z antygenem, zwykle niezależnie od asocjacji z MHC.

1. Natywne (własne) antygeny mogą stymulować rozwój autoregulacyjnych komórek Ts.

2. Antygeny obce, obecne w postaci nieimmunologicznej lub w bardzo wysokich stężeniach, również indukują swoistą aktywność komórek Ts.

2. Rozpoznając antygen, dojrzałe komórki Ts wpływają na rozwój odpowiedzi immunologicznej albo przez działanie bezpośrednie na komórki, albo przez uwalnianie czynników supresorowych. Niektóre czynniki supresorowe mają swoistość epitopu, co sugeruje, że mogą być TCR-ami uwolnionymi z błony komórek Ts.

3. Komórki Ts mogą być zaangażowane w zapobieganie odpowiedzi na własne antygeny.

4. Funkcję supresorową mają też inne populacje limfocytów.

Dwa przykłady:

1. Komórki Tc mogą zabijać komórki prezentujące antygen, mające na swej błonie homologiczny antygen.

2. Dwie populacje komórek Th mają również aktywność supresorową.

e. Komórki efektorowe nadwrażliwości typu późnego (komórki Tdth lub TD) są limfocytami CD4+ i podlegają restrykcji klasy II MHC. Odpowiedzialne są one za reakcję Gella i Coombsa typu IV odczyn wykrywający przeciwciała.

f. Limfocyty pamięci (Tm) są indukowane w czasie pierwotnej odpowiedzi im­munologicznej; rozpoznają one swoisty antygen i biorą udział w odpowiedzi anamnestycznej (wtórnej). Większość komórek Tm ma funkcje Th, stąd są CD4+, podlegające, jak komórki Tdth, restrykcji klasy II MHC. Czas ich życia może być długi, nawet do 40 lat, lecz efektywna pamięć prawdopodobnie utrzymuje się przez 10-15 lat; immunizacja przypominająca wydłuża ten okres.

Rearanżacje genów (przegrupowanie genów)

Proces występujący tylko w limfocytach T i B w wyniku którego dochodzi do powstania ogromnej różnorodności receptorów dla antygenu. Dzieje się to w wyniku połączenia 1 genu V₂ z 1 genem J i 1 genem D. Spośród zestawów zawierających od 2 do ponad 100 różnych wariantów tych genów. Tak utworzony DNA podlega cięciu i składaniu, co prowadzi do powstania mRNA na bazie którego, w wyniku dalszych cięć, syntezowany jest łańcuch polipeptydowy o 1 tylko kombinacji z tysięcy możliwych (10¹⁰).

Immunologiczne zróżnicowanie limfocytów:

Selekcja. Proces selekcji limfocytów T w grasicy przed uwolnieniem ich do krwiobiegu.

1. Komórki CD4^-, CD8^- (podwójnie ujemne) proliferują w zewnętrzną część kory grasicy i stają się CD4⁺, CD8⁺ (podwójnie dodatnie) oraz dokonują rearanżacji swoich genów dla TCR.

2. Pod wpływem komórek nabłonkowych grasicy (posiadają bardzo wiele antygenów własnych MHC kl I i II) limfocyty, których TCR rozpoznają jedną z dostępnych własnych cząstek MHC przeżywają, a pozostałe giną; komórki które rozpoznają MHC kl I tracą CD4 i zatrzymują CD8 (T_c); te które rozpoznają cząsteczki MHC kl II, traą CD8 i zatrzymują CD4 (T_h)- są one zatem teraz pojedynczo dodatnie.

3. Pod wpływem komórek dendrytycznych prezentujących własne antygeny w formie krótkich peptydów, limfocyty T autoreaktywne są eliminowane, pozostałe (około 2%) początkowej populacji opuszczają grasicę.

9

---