Immunologia rozrodu

10. Dojrzewanie limfocytów

- prekursory LimT napływają do grasicy już w 7-8 tygodniu ciąży

- powstają one początkowo w płodowym pęcherzyku żółtkowym oraz w wątrobie płodowej

- w późniejszym okresie płodowym oraz po urodzeniu prekursory LimT docierają do grasicy ze szpiku

- w szpiku obecne są komórki macierzyste krwiotowrzenia

- powstają z nich erytrocyty, megakariocyty, granulocyty i monocyty oraz poprzez aktywację czynnika transkrypcyjnego Icaros również wspólne komórki progenitorowe limfopoezy (CLP)

- z komórek CLP powstają komórki dendrytyczne, komórki NK i LimB, a po pobudzeniu receptorów Notch-1 również limfocyty pre-T

- CLP oraz pre-T dostają się ze szpiku do krwi, stamtąd wędrują do grasicy

- w grasicy z pre-T powstają pro-T, pre-T (znowu) i LimT

- w grasicy z CLP powstają komórki dendrytyczne, komórki NK, LimB i po pobudzeniu receptora Notch-1 limfocyty pro-T przechodzące w pre-T i LimT

Etapy dojrzewania limfocytów T

- w trakcie dojrzewania tymocytów kilka procesów selekcji

- są to tzw wąskie gardła limfopoezy, w ich następstwie dochodzi do eliminacji 95% dojrzewających komórek

- proces dojrzewania LimT można podzielić na fazę wczesną, w trakcie której dojrzewające LimT nie mają receptora TCR i fazę późną w której tymocyty mają pełną ekspresję receptorów rozpoznających antygen

- faza wczesna zaczyna się od powstania komórek progenitorowych w szpiku i obejmuje zasiedlenie w grasicy, ekspansję komórek zasiedlających, ukierunkowanie rozwoju w stronę wczesnych tymocytów, rearanżację genów dla łańcucha β TCR, selekcję β oraz wyłączenie alleliczne

- w fazie późnej limfocyty poddawane są selekcji pozytywnej i negatywnej

Wczesna faza dojrzewania tymocytów

- najmniej dojrzałe tymocyty nie mają ani kompleksu TCR/CD3, ani cząsteczek CD4 i CD8 - komórki potrójnie ujemne

- można wśród nich wyróżnić dodatkowe subpopulacje odpowiadające kolejnym stadiom dojrzewania

- w wyniku bezpośredniego kontaktu z komórkami zrębu i pod wpływem wydzielanych lokalnie cytokin komórki zasiedlające grasicę zaczynają intensywnie się dzielić

- musi powstać dużo komórek w których zostanie rozpoczęty proces rearanżacji genów TCR, im więcej komórek przystąpi do procesu, tym bardziej różnorodne będą TCR

- w każdej komórce rearanżacja odbywa się niezależnie i doprowadza do wytworzenia przypadkowych kombinacji segmentów genów VDJ (łańcuch β) i VJ (łańcuch α) kodujących różne TCR

- głównym celem procesów zachodzących w grasicy jest wytworzenie takich LimT które:

- komórki docierające do grasicy mają geny kodujące łańcuchy α i β TCR w układzie zarodkowym, jak wszystkie inne komórki organizmu (wyłączając dojrzałe LimT)

- w grasicy rozpoczyna się proces rearanżacji segmentów genów TCR, bardzo podobny do rearanżacji genów immunoglobulinowych i doprowadza do wytworzenia receptora TCR złożonego z dwóch różnych łańcuchów α i β

- rearanżacja genów dla tych łańcuchów odbywa się niezależnie i w różnym czasie (najpierw rearanżacja w obrębie locus dla łańcucha β)

- pod wpływem białek RAG1 i RAG2 dochodzi do rearanżacji losowo wybranych segmentów genów V, D, J z których powstanie część zmienna (V) łańcucha β TCR

- w wyniku tej rearanżacji oraz z powodu zmienności na złączach może powstać bardzo wiele różnych łańcuchów β

- rearanżacja w każdym tymocycie odbywa się niezależnie i w każdej komórce może powstać inny gen dla łańcucha β

- w trakcie rearanżacja a szczególnie w konsekwencji zmienności na złączach w powstającym genie mogą się pojawić pomyłki, zanim dojdzie do rearanżacji genów dla łańcucha α TCR musi dojść do sprawdzenia poprawności łańcucha β

- proces sprawdzenia poprawności rearanżacji genów dla łańcucha β nazywany jest selekcją β

- uczestniczy w nim świeżo wytworzony łańcuch β receptora TCR, który tworzy parę z tak zwany zastępczym łańcuchem α określanym jako pre-TCRα (kodowany przez gen nie ulegający rearanżacjom i identyczny we wszystkich tymocytach)

- jeżeli łańcuch β ma prawidłową budowę (prawidłowa rearanżacja genów) to powstający heterodimer aktywuje mechanizm warunkujący przeżycie limfocytów (jeśli nie to apoptoza - ponad 70% komórek)

- jednocześnie w limfocytach które z powodzeniem przeszły selekcję β dochodzi do zablokowania rearanżacji genów TCRβ w chromosomie homologicznym - wyłączenie alleliczne (w wypadku łańcuchów α nie ma wyłączenia!)

- tuż po selekcji β komórki zaczynają wytwarzać CD4 i CD8, intensywnie proliferują (skutek aktywacji pre-TCR)

- do następnych etapów dojrzewania dochodzi wiele komórek które prawidłowo zrearanżowały TCRβ (późne limfocyty pre-T)

- wraz z pojawieniem się CD4 i CD8 dochodzi do zainicjowania rearanżacji genów kodujących TCRα, jednocześnie wygasa ekspresja pre-Tα

Późna faza dojrzewania tymocytów

- w wyniku selekcji β powstaje duża pula limfocytów podwójnie dodatnich CD4+CD8+, których łańcuchy TCRβ mogą tworzyć pary z nowo powstającymi łańcuchami TCRα

- komórki te czeka teraz edukacja grasicza, prowadząca do wyłonienia tylko limfocytów przydatnych w odporności

- procesy selekcji zapewniają przechodzenie do kolejnych etapów tych komórek które prawidłowo rearanżują geny kodujące łańcuch β (selekcja β) lub po rearanżacji genów dla łańcucha α - cały receptor TCR (selekcja pozytywna)

- ponadto w wyniku selekcji pozytywnej dochodzi do restrykcji MHC (w kompleksie z którym MHC będziesz rozpoznawał antygeny, takie CD zostawiasz)

- selekcja negatywna natomiast prowadzi do usunięcia tych tymocytów które z dużym powinowactwem rozpoznają własne antygeny

- selekcji pozytywnej poddawane są limfocyty podwójnie dodatnie, mające zarówno CD4 jak i CD8, w których doszło do rearanżacji genów V i J łańcucha α TCR

- celem selekcji pozytywnej jest wyłonienie takich komórek, które:

- jeśli dojrzewający tymocyt nie rozpozna żadnego antygenu wówczas po pewnym czasie ulega apoptozie (śmierć z zaniedbania)

- tymocyty starając się za wszelką cenę przeżyć mogą podjąć próbę wytworzenia prawidłowego łańcucha α (wymiana segmentu genu V na nowy)

- mimo tych starań w wyniku śmierci z zaniedbania ginie ponad 90% tymocytów

- w przebiegu selekcji pozytywnej dochodzi jednocześnie do restrykcji MHC

- te limfocyty które będą rozpoznawać antygeny prezentowane im przez MHC klasy I zachowują ekspresję CD8, a te, które mają wiązać antygen w kontekście MHC klasy II, pozostają CD4+

- spośród tymocytów, które z powodzeniem przeszły selekcję pozytywną niemal 80% ginie w wyniku selekcji negatywnej określanej często jako delecja klonalna

Komórki uczestniczące w selekcji tymocytów

- w selekcji pozytywnej uczestniczą tylko korowe komórki nabłonkowe (opiekuńcze)

- limfocyty podwójnie dodatnie mają niewiele czasu na rozpoznanie peptydów prezentowanych przez komórki nabłonkowe gdyż żyją tylko 3-4 dni (po tym okresie apoptoza)

- nie rozstrzygnięto w którym miejscu i kiedy dochodzi do selekcji negatywnej, wydaje się, że selekcja negatywna może występować zarówno przed jak i po pozytywnej, zwiększając szansę wyeliminowania komórek autoreaktywnych

- w selekcji negatywnej uczestniczą zarówno komórki korowe jak i rdzeniowe komórki nabłonkowe oraz komórki dendrytyczne rdzenia grasicy

- każda z tych populacji może prezentować limfocytom odrębną pulę peptydów (nie wiadomo czy peptydy tylko z wnętrza grasicy, czy mogą też docierać drogą krwi)

- komórki dendrytyczne mogą prowadzić prezentację krzyżową (zarówno przez cz.MHC I jak i II)

Mechanizmy selekcji w grasicy

- tymocyty do przeżycia wymagają sygnału hamującego apotpozę

- sygnał ten przez prawidłowy receptor TCR

- głównymi cząsteczkami umożliwiającymi uniknięcie programowanej śmierci są białka Bcl-2 i Bcl-xL

- ekspresja genów kodujących te białka indukowana jest przez wiele sygnałów z których najważniejsze pochodzą od Il-7R i TCR (poprzez CD3)

- we wczesnych etapach dojrzewania główną rolę w utrzymaniu limfocytów przy życiu pełni Il-7

- w trakcie selekcji β główna rola hamowania apoptozy przypada receptorowi pre-TCR

- w przebiegu selekcji pozytywnej rolę tę przyjmuje TCR, jeśli syganały zbyt słabe lub zbyt silne - endocytoza receptorów, to apoptoza (selekcja negatywna)

- największy wpływ na selekcję tymocytu ma awidność TCR do peptydów

- podobną awidność mają peptydy słabi agoniści obecne w dużej ilości w grasicy, jak i peptydy silni agoniści obecne w ilości małej

Powstawanie limfocytów T regulatorowych

- rozpoznanie własnych antygenów z dużym powinowactwem niekoniecznie oznacza selekcję negatywną

- pewien odsetek limfocytów T CD4+ rozpoznających własne antygeny (po prezentacji przez cz.MHC II)

rozpoczyna wytwarzanie CD25 oraz czynnika transkrypcyjnego Foxp3 różnicując się w limfocyt regulatorowy

- również niektóre limfocyty T CD8+ po poznaniu własnych antygenów (prezentacja przez cz.MHC I) przekształcają się w limfocyty regulatorowe mające cząsteczkę CD8αα (klasyczne LimTc mają cząsteczkę CDαβ)

Powstawanie limfocytów Tγδ

- pierwsze etapy dojrzewania tych komórek są wspólne dla limfocytów Tαβ i Tγδ

- wczesne limfocyty pre-T zaczynają rearanżować segmenty genów kodujących podjednostki β,γ lub δ TCR

- podjęcie decyzji o różnicowaniu w kierunku limfocytów Tγδ lub Tαβ odbywa się na etapie limfocytów podwójnie ujemnych

- powstanie jednej linii limfocytów całkowicie wyklucza wytworzenie z nich linii innej (delecja genów w czasie rearanżacji)

- jako pierwsze powstają w grasicy limfocyty Tγδ, są one początkowo monomorficzne (geny w których brak zmienności na złączach)

- opuszczają grasicę i zasiedlają tkanki obwodowe falami

- kolejne fale limfocytów Tγδ mają już zróżnicowane receptory TCR, zbudowane z różnych genów ze śladami zmienności na złączach

Migracja tymocytów w grasicy

- pierwsze prekursory tymocytów docierają do zawiązka grasicy gdy jeszcze nie ma w nim naczyń krwionośnych

- powstające naczynia wnikają do grasicy od strony torebki i wraz z przegrodami łącznotkankowymi penetrują w głąb narządu

- w okolicy podtorebkowej oraz w korze grasicy istnieje bariera krew-grasica

- na granicy kory i rdzenia połączenia między komórkami nabłonka luźniejsze, bariera krew-grasica się rozszczelnia

- to właśnie tędy napływają do grasicy prekursory tymopoezy

- następnie kierują się one do kory w okolicę podtorebkową, mijając przemieszczające się w przeciwnym kierunku (w stronę rdzenia) bardziej dojrzałe tymocyty

- w regionie korowym tymocyty przechodzą kolejne etapy dojrzewania aż do momentu selekcji pozytywnej

- następnie po przejściu selekcji negatywnej wnikają do naczyń i zasiedlają obwodowe narządy limfatyczne

- najważniejszą rolę w nadawaniu kierunku tej migracji odgrywają chemokiny

Powstawanie komórek NK i limfocytów NKT

- ponad 99% komórek NK dojrzewa w szpiku pod wpływem działania Il-15

- zaledwie 1% powstaje w grasicy ze wspólnego prekursora z LimT

- fenotypowo i funkcjonalnie komórki NK są bardziej podobne do LimT niż LimB

- limfocyty NKT mające markery typowe dla komórek NK oraz receptory TCR rozpoznają antygeny prezentowane przez nieklasyczne cz.MHC I oraz CD1d

- wydaje się że głównym miejscem ich powstawania jest grasica

Dojrzewanie limfocytów B

- Lim T i B powstają ze wspólnej komórki progenitorowej limfopoezy

- dojrzewanie tych komórek odbywa się jednak w innych narządach, LimB powstają głównie w szpiku

- najważniejszymi czynnikami transkrypcyjnymi determinującymi różnicowanie w kierynku LimB są Pax5 i EBF

Limfocyty pre-pro-B

- określane są tak komórki, w których pojawia się Pax5

- są to pierwsze komórki nieodwołalnie skazane na bycie LimB

- mają one fenotyp CD34+CD10+B220+

- w komórkach tych rozpoczyna się ekspresja genów dla RAG1, RAG2 i transferazy nukleotydów końcowych (TdT) których produkty uczestniczą w rearanżacji genów dla składowych receptora immunoglobulinowego

Limfocyty pro-B

- dochodzi w nich do rearanżacji genów immunoglobulinowych

- na ich powierzchni pojawia się cząsteczka CD19 (marker wszystkich LimB)

- w błonie komórkowej zaczynają się również pojawiać cz.MHC II oraz receptor zbudowany z łańcuchów Igα (CD79a), Igβ (CD79b) oraz kalneksyny

- łańcuchy są odpowiednikami CD3 w LimT, uczestniczą w przekazywaniu sygnałów przez BCR

- receptor immunoglobulinowy przekazuje komórkom sygnały hamujące apoptozę (jeśli po prawidłowej rearanżacji)

- po wpływem Il-7 oraz Pax5 dochodzi do rearanżacji genów V_HDJ_H , które po połączeniu z segmentem genu μ kodują łańcuch ciężki przeciwciała μHC

Limfocyty pre-BI duże, proliferujące

- pojawia się w nich pre-BCR

- zbudowany jest z łańcucha ciężkiego, który łączy się z dwoma peptydami: V-pre-B oraz 14.1

- te dwa peptydy odpowiadają funkcjonalnie części zmiennej (V) i stałej (C) łańcuchów lekkich i z tego powodu określane jako łańcuch pseudo-L (ϕL) lub też zastępczy łańcuch lekki

- pojawienie się BCR w błonie jest sygnałem wstrzymującym dalsze rearanżacje genów immunoglobulinowych (wyłączenie alleliczne - zahamowanie ekspresji genów RAG, sprawdzenie funkcjonalności łańcucha ciężkiego - selekcja pozytywna oraz ekspansja klonalna prekursorów LimB)

Limfocyty pre-BII małe, nieproliferujące

- rozpoczyna się rearanżacja segmentów genów dla łańcucha lekkiego κ

- jest to moment w którym dochodzi do wznowienia ekspresji genów RAG1/2

- w wypadku niewytworzenia sprawnego łańcucha κ może dojść do rearanżacji genów odpowiedzialnych za powstanie łańcucha λ

- wytworzenie funkcjonalnego łańcucha lekkiego jest sygnałem do powolnego zaniku ekspresji TdT

- w wypadku łańcucha lekkiego nie obserwuje się wyłączenia allelicznego we wszystkich limfocytach

Niedojrzałe limfocyty B

- zakończenie rearanżacji genów dla łańcucha lekkiego i pojawienie się na powierzchni komórki dojrzałego receptora immunoglobulinowego klasy IgM (BCR)

- przez pewien czas znajdują się na nim też pre-BCR

- powstałe w ten sposób limfocyty mogą opuszczać szpik, przedostawać się do krwioobiegu i wędrować do obwodowych narządów limfatycznych

Dojrzałe limfocyty B

- wytworzenie przez limfocyt łańcucha ciężkiego δ i pojawienie się na powierzchni oprócz BCR IgM, także receptora immunoglobulinowego IgD

- w komórkach tych zachowana jest ekspresja mRNA dla RAG1 i RAG2 ale nie ulegają one translacji

- pojawieniu się powierzchniowych IgD towarzyszy indukcja ekspresji cz.CD21 i CD23 (będą uczestniczyć w kostymulacji!)

Selekcja pozytywna

- sprawdzenie czy doszło do prawidłowej rearanżacji genów kodujących łańcuch ciężki μ oraz pre-BCR należałoby raczej porównać do selekcji β wśród LimT niż do selekcji pozytywnej, w procesie tej selekcji nie dochodzi do rozpoznawania konkretnego antygenu

- sama obecność prawidłowego łańcucha w kompleksie z Igα i Igβ wystarcza do przekazania sygnałów hamujących apoptozę dojrzewającej komórce

- selekcja pozytywna łańcucha ciężkiego μ służy zatem sprawdzeniu czy geny kodujące łańcuch ciężki uległy rearanżacji w prawidłowej ramce odczytu

- podobnie do przeżycia Lim pre-B niezbędne jest przekazanie sygnału przez pre-BCR

- również w tym procesie wiązanie antygenu nie jest niezbędne (celem jest sprawdzenie czy odpowiedni zrearanżowany łańcuch ciężki może się łączyć z łańcuchem lekkim-zastępczym)

- jeśli łańcuch ciężki nie uległ połączeniu z λ5 i V-pre-B jest wówczas wiązany przez białko BiP i ulega uwięzieniu w siateczce śródplazmatycznej

- jeśli natomiast po dotarciu do błony komórkowej rozpozna jakiś antygen, sygnał z BCR powoduje apoptozę (selekcja negatywna) - potencjalnie autoreaktywny!

- trzecim etapem selekcji jest ekspansja klonów oraz dojrzewanie powinowactwa receptora immunoglobulinowego w grudkach chłonnych

Selekcja negatywna

- jej celem jest usunięcie LimB autoreaktywnych

- ważna jest awidność autoantygenu do receptora immunoglobulinowego

- duża siła wiązania powoduje, że komórka zostaje skierowana na drogę apoptozy

- mniejsze powinowactwo do antygenu nie wystarcza aby komórka uległa apoptozie, jest jednak wystarczające aby doprowadzić do anergii limfocytu

- podobnie jak w przypadku dojrzewania tymocytów w grasicy, optymalne jest rozpoznanie antygenu z umiarkowanym powinowactwem

- na proliferację, dojrzewanie i przeżycie poszczególnych prekursorów LimB mają wpływ dwa czynniki:

- odpowiednie środowisko do dojrzewania LimB zapewniają w szpiku komórki zrębowe

- ważna jest nie tylko ich bezpośrednia interakcja z LimB, ale i czynniki wydzielane przez te komórki

- bardzo ważną rolę odgrywają Il-7 (receptor dla niej na wszystkich formach rozwojowych), PPBSF, TSLP oraz chemokina CXCL12 (ze swoim receptorem CXCR4! limfocyty dojrzałe tracą jego ekspresję, dzięki czemu mogą opuścić szpik i dotrzeć do krążenia)