15. Mechanizmy cytotoksyczności limfocytów

- mechanizmy cytotoksyczności limfocytów odgrywają główną rolę w odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym (wirusom, mikoplazmom oraz niektórym bakteriom i pierwotniakom), mogą również uczestniczyć w niszczeniu komórek nowotworowych oraz komórek allogenicznego przeszczepu

- w trakcie niektórych chorób autoimmunizacyjnych celem ich ataku mogą stać się również niektóre niezmienione komórki organizmu

- limfocytami zdolnymi do wywierania efektu cytotoksycznego są przede wszystkim limfocyty T CD8+, komórki NK. komórki NKT oraz limfocyty Tγδ

- limfocyty T CD8+ z TCRαβ określane są jako cytotoksyczne limfocyty T (CTL), mają one dużą liczbę ziaren w cytoplazmie i pochodzą z wcześniej aktywowanych form prekursorowych - pCTL

- podobnie zdolne do szybkiego i bezpośredniego efektu cytotoksycznego są komórki NK wyposażone w ziarna

- niszczenie komórek docelowych polega na wyzwoleniu w nich apoptozy

- dwa mechanizmy cytotoksyczności komórkowej:

• mechanizm związany z uwolnieniem zawartości cytoplazmatycznych ziaren (cytolitycznych)

• mechanizm związany z aktywacją receptorów dla cząsteczek nadrodziny TNF obecnych na komórkach docelowych (receptory Fas, receptory dla TNF i receptory dla TRAIL)

- do efektu cytotoksycznego w który zaangażowane są ziarna dochodzi stosunkowo szybko, natomiast w mechanizmie zależnym od receptorów dla cząsteczek nadrodziny TNF czas zabicia komórki docelowej wynosi kilka godzin

- oddziaływanie limfocytów na komórki może mieć również charakter pośredni, wynikający z wydzielania innych cytokin niż TNF i TRAIL, przede wszystkim INF-gamma który działa cytostatycznie i silnie aktywuje makrofagi

mechanizm cytotoksyczności	czynnik	mechanizm działania
związany z cytoplazmatycznymi ziarnami cytolitycznymi	perforyna granzymy granulizyna enzymy lizosomalne TIA-1 NKLAM	- tworzenie porów w błonie komórkowej, współudział w apoptozie - proteoliza białek cytoplazmy i białek jądrowych, indukcja apoptozy - uszkadzanie błon komórkowych, indukcja apoptozy - proteoliza białek cytoplazmy i białek jądrowych, uczynnianie granzymów, indukcja apoptozy - stymulacja degradacji DNA - ubikwitynacja białka URKL-1
związany z receptorami dla cząsteczek nadrodziny TNF	FasL TNF Lt-α TRAIL	- indukcja apoptozy przez Fas - indukcja apoptozy przez TNF-RI - indukcja apoptozy przez TNF-RI - indukcja apoptozy przez receptory DR4 i DR5

Wstępne etapy reakcji cytotoksycznej

- podstawowym warunkiem wystąpienia reakcji cytotoksycznej jest rozpoznanie komórki docelowej przez odpowiedni limfocyty

- charakter swoisty dla CTL

- charakter nieswoisty dla komórek NK, komórki NK mogą też brać udział w reakcjach swoistych z udziałem przeciwciał - ADCC

- powstałe złącze pomiędzy komórką efektorową i docelową określane jest jako synapsa immunologiczna lityczna (dla odróżnienia od synapsy immunologicznej powstającej między APC a limfocytem)

- synapsa lityczna ma część obwodową o kształcie pierścienia, w obrębie którego zachodzi interakcja adhezyjnych cząsteczek błonowych komórki docelowej i limfocytu (LFA-1 - ICAM) i część centralną

- w części centralnej można wyróżnić domeną wydzielniczą, w której dochodzi do uwolnienia zawartości ziaren cytolitycznych oraz domenę sygnalizacyjną warunkującą rozpoznanie

- ponieważ proces zabicia komórki docelowej musi się odbyć w miarę szybko, niekiedy wystarczy rozpoznanie tylko kilku antygenów prezentowanych przez cz.MHC I, synapsa lityczna nie przyjmuje wówczas typowej formy i proces wydzielania ziaren nie jest zorganizowany

Reakcja cytotoksyczna zależna od ziaren cytolitycznych

- większe znaczenie

- głównie do nich odnoszą się zjawiska biorące udział w powstawaniu synapsy litycznej

- po związaniu komórki docelowej przez limfocyty dochodzi do istotnych zmian w jego strukturze

- polegają one na jednoczesnym przemieszczeniu się centrum organizacji mikrotubul (MTOC), aparatu Golgiego i ziaren cytoplazmatycznych do bieguna którym CTL styka się z komórką docelową - polaryzacja, biorą w niej udział mikrotubule i inne elementy cytoszkieletu

- polaryzacja jest zjawiskiem niezbędnym do wystąpienia efektu cytotoksycznego

- efekt ten zależy od wydzielania przez limfocyty do przestrzeni miedzykomórkowej zawartości zgromadzonych w nim ziaren cytolitycznych i innych czynników cytotoksycznych

- decydującą rolę w polaryzacji odgrywają jony wapnia Ca2+, wzrost ich stężenia w cytoplazmie jest typowym efektem będącym konsekwencją aktywacji CTL za pośrednictwem TCR/CD3

- w ziarnach czynniki zdolne do bezpośredniego zabicia komórki, uwolnienie ich i innych czynników cytotoksycznych określane jako „śmiertelny cios”

- po zadaniu śmiertelnego ciosu limfocyt oddziela się i wyrusza na poszukiwanie następnej ofiary, zjawisko to nazywa się recyrkulacją (im więcej składników macierzy pozakomórkowej tym szybsze poruszanie się)

- zdolność do zabicia następnej komórki docelowej wymaga pewnego okresu refrakcji, niezbędnego do syntezy zużytych czynników cytotoksycznych i odtworzenia ziaren cytoplazmatycznych

- ziarna CTL są wytworem aparatu Golgiego, mają one zarówno cechy typowych pęcherzyków wydzielniczych jak i lizosomów

- w ziarnach zawarte są czynniki cytotoksyczne, z których najlepiej scharakteryzowano: perforynę, kilka białek z rodziny proteaz serynowych (granzymów) oraz granulizynę, obiektem zainteresowania jest również wewnątrzkomórkowe białko limfocytów T (TIA-1), ziarna cytolityczne zawierają także kalretikulinę oraz związane z błoną cząsteczki FasL

• perforyna

• nazwa pochodzi od jej zdolności do wbudowywania się w błonę komórkową i tworzenia w niej kanałów

• jest glikoproteiną

• posiada domenę o właściwościach hydrofobowych - wbudowywanie w błonę

• podobnie jak składnik C9 dopełniacza perforyna po wbudowaniu w błonę polimeryzuje tworząc kanały

• proces ten uzależniony jest od obecności Ca2+

• funkcjonalny kanał mogą tworzyć 3-4 cząsteczki perforyny

• średnica porów jest wystarczająco duża aby umożliwić swobodny wypływ i dopływ do cytoplazmy różnych jonów a nawet polipeptydów, powoduje to zniesienie integralności komórki, zaburzenia gospodarki mineralnej i szok toniczny

• końcowym wynikiem działania perforyny jest indukcja apoptozy w komórce docelowej i w konsekwencji degradacja DNA (wniknięcie Ca2+ i aktywacja endonukleaz oraz granzymów i białka TIA-1)

• granzymy

• proteazy serynowe od A do M

• w ziarnach cytolitycznych są związane z proteoglikanem serglicyną i podobnie jak perforyna stanowią niezbędny element reakcji cytotoksycznej

• po uwolnieniu z ziaren są pochłaniane przez komórkę docelową i dostają się do cytoplazmy

• w sposób bierny mogą się one dostawać do atakowanej komórki na drodze endocytozy uszkadzanych przez perforynę fragmentów błony

• cząsteczki perforyny mogą się wiązać na powierzchni komórki z receptorem dla mannozo-6-fosforanu lub być przekazywane siarczanowi heparanu obecnemu na powierzchni komórki

• nie jest jasne w jaki sposób granzymy przedostają się z endosomów do cytoplazmy komórek

• w cytoplazmie komórek docelowych granzymy wykazują aktywność proteolityczną

• granzym A działa na poziomie jądra komórkowego prowadząc do uszkadzania DNA, nie ma właściwości aktywowania kaspaz:

• wiąże się z nukleoliną i ją rozkłada

• degraduje histon H1, uwrażliwiając DNA na działanie endonukleaz

• bezpośrednio rozszczepia laminę

• unieczynnia w jądrze kompleks SET zawierający enzymy naprawcze DNA

• granzym B występuje w postaci monomeru, jego rola w indukcji apoptozy wynika z:

• aktywacji kaspaz w tym efektorowej kaspazy 3

• uczynniania DNazy CAD

• rozszczepiania białka Bid, w wyniku czego powstała forma tBid może reagować z mitochondrialnymi białkami Bax i Bak, co powoduje uwolnienie cytochromu c

• oddziałuje na tubulinę α zaburzając funkcję cytoszkieletu

• białko TIA-1

• ma ono trzy domeny zdolne do wiązania RNA i jak się wydaje uczestniczy w degradacji kwasów nukleinowych w komórce docelowej

• działa wtórnie w stosunku do perforyny, umożliwiającej mu dostanie się do cytoplazmy komórki docelowej

• granulizyna

• należy do rodziny sapozyn, białek wiążących lipidy

• pod względem działania przypomina defensyny - uszkadza błonę wielu różnych drobnoustrojów

• niszczy również błony mitochondrialne oraz aktywuje kaspazę 9 indukując tym samym szlak apoptozy

• odgrywa istotną rolę w niszczeniu bakterii z rodzaju Mycobacterium oraz drożdży Cryptococcus - ważny element obrony w gruźlicy, trądzie i niektórych drożdżycach

• wywiera także działanie przeciwnowotworowe indukując w komórkach nowotowru apoptozę

- funkcje ochronne przed nieswoistymi czynnikami zawartymi w ziarnach (neutralizacja i transport cząsteczek perforyny i granzymów) sprawują zawarte w ziarnach glikozaminoglikany (siarczan chondroityny A)

- zakłada się również istnienie cząstek ochronnych na powierzchni limfocytów, taką rolę może pełnić związana z powierzchnią limfocytu katepsyna B, neutralizująca działanie perforyny

- szczególną rolę pełnią białka hamujące proteazy serynowe (w tym granzymy) zwane serpinami

- obecne są w dużych stężeniach w cytoplazmie komórek NK i CTL a także komórek dendrytycznych, chronią je przed własnym granzymem B

Przebieg reakcji cytotoksycznej zależnej od receptorów dla cząsteczek nadrodziny TNF

- cytotoksyczność oparta na interakcji wytwarzanych przez komórki efektorowe ligandów ze swoistymi receptorami obecnymi na komórkach docelowych

- konsekwencją tej interakcji jest przekazanie sygnału do komórki docelowej, indukującego w niej proces apoptozy

- głównymi czynnikami (ligandami) odpowiedzialnymi za omawiany rodzaj cytotoksyczności są cząsteczki nadrodziny TNF, których receptory w komórkach docelowych zawierają e części cytoplazmatycznej domenę śmierci DD

- do cząsteczek tych należą FasL, TRAIL, TNF oraz LT-α

- z wyjątkiem LT-α która występuje tylko w formie rozpuszczalnej, wymienione cząstki mają również formę związaną z błoną i mogą uczestniczyć w reakcjach komórkowych związanych z bezpośrednim kontaktem między komórkami

- związanie się tych czynników ze swoistymi receptorami indukuje zależne od DD mechanizmy komórkowe prowadzące do aktywacji kaspaz i apoptozy

- w wypadku limfocytów główną rolę w cytotoksyczności zależnej od cząsteczek nadrodziny TNF odgrywa FasL, reagujący z receptorem Fas

- choć Fas jest szeroko rozpowszechniony w różnych typach komórek, cytotoksyczność ta odgrywa mniejszą rolę niż ziarna

- oprócz komórek NK i CTL za pomocą FasL mogą zabijać również LimT CD4+

- ekspresja FasL na limfocytach CTL jest indukowana za pośrednictwem TCR

- zjawisko to mogą wspomagać cytokiny Il-2, Il-12 i INF-γ

- z kolei ekspresja Fas wzrasta po pobudzeniu komórek przez INF-γ i TNF, lokalne wytwarzanie tych cytokin może wpływać na wzrost wrażliwości komórek docelowych na efekt cytotoksyczny

Apoptoza jako mechanizm efektorowy cytotoksyczności komórkowej

- najczęściej apoptoza przez kaskadę aktywacji kaspaz

- kaskada ta uruchamiana zarówno przez mechanizmy zależne od ziaren jak i receptorów dla cząsteczek rodziny TNF

- kaspazy efektorowe degradują różne biała komórkowe, w tym niektóre białka jądrowe - nieodwracalne zmiany DNA

- w przypadku receptorów dla cząsteczek nadrodziny TNF dochodzi do aktywacji kaspaz inicjatorowych, które przekształcane są w aktywne kaspazy w wyniku interakcji z domenami CARD i DED białek adaptorowych reagujących z domenami śmierci

- zarówno szlak zależny od ziaren jak i receptorów dla nadrodziny TNF prowadzą w efekcie do tego samego - apoptozy komórki docelowej