Pożywki hodowlane, podłoża mikrobiologiczne - mieszaniny odpowiednio dobranych składników stosowane do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych, jako hodowle in vitro. Stosuje się je do izolacji, różnicowania, namnażania i identyfikacji mikroorganizmów, poznawania ich cech morfologicznych, fizjologii czy budowy chemicznej komórek. Najpopularniejsze są obecnie podłoża stałe (zwłaszcza te zestalone agar-agarem), znane są także podłoża płynne (buliony) i półpłynne. Ogólny podział:
W zależności od składu i funkcji podłoża dzielimy na:
proste
wzbogacone
specjalne
wybiórcze (selektywne)
różnicujące
transportowe
transportowo-wzrostowe
Ze względu na konsystencję pożywki:
stałe (dodatek agaru; żelatyny; żelu krzemionkowego. Agar -dodany w stężeniu - 0,5 - 1% = podłoże półpłynne; 1,5-3% = podłoże stałe)
płynne
Najprostszym podłożem płynnym jest:
bulion mięsny - wyciąg mięsny + 1% peptony + 0,5% NaCl
bulion drożdżowy - wyciąg drożdżowy + pepton + NaCl
Podłoża wzbogacone: są to podłoża z dodatkiem krwi, surowicy lub innych składników, zawierających dodatkowe czynniki wzrostowe, które umożliwiają hodowlę i rozwój najbardziej wybrednych pod względem odżywczym bakterii
Podłoża specjalne: są to podłoża z dodatkiem węglowodanów lub innych specyficznych substratów. Służą m.in. do określania cech hodowanych drobnoustrojów np. właściwości fermentacyjnych danego drobnoustroju, lub do wytwarzania specyficznych produktów metabolizmu takich jak: toksyny, antybiotyki itd. Przykładem podłoży specjalnych są pożywki wchodzące w skład tzw. szeregów biochemicznych używanych do identyfikacji bakterii - podłoże Kliglera, podłoże Stuarta (wykrywanie urezay)
Podłoża różnicujące: są to podłoża gdzie może rosnąć kilka lub kilkanaście gatunków drobnoustrojów, ale każdy z nich wytwarza charakterystyczne, łatwe do zróżnicowania kolonie, co pozwala na ich szybką i dalszą, już ukierunkowaną, szczegółowa identyfikację.
Stałe podłoża różnicujące często są jednocześnie wybiórczymi dla określonej grupy, rodzaju drobnoustrojów i są nazywane wybiórczo-różnicującymi.
Podłoża wybiórczo-różnicujące: np.
podłoża do hodowli bakterii z rodziny Enterobacteriaceae: MacConkey, Endo, SS, Levina; podłoża do hodowli maczugowców: podłoże Clauberga z tulerynem potasu
podłoże do hodowli gronkowców: podłoże Champamana
podłoże do hodowli grzybów i pleśni: podłoże Saburoda
Podłoża wybiórcze: są to podłoża z dodatkiem takim substancji, które umożliwiają wzrost tylko pewnych określonych gatunków bakteryjnych czy grzybiczych a jednocześnie hamują wzrost innych gatunków. Podłoża te pozwalają na wyizolowanie jednego lub kilku gatunków bakteryjnych czy grzybiczych z materiału, w którym znajduje się cała masa drobnoustrojów.
Np. podłoże z dodatkiem fioletu krystalicznego, które umożliwia wzrost tylko bakterii Gram-ujemnych, podłoże do hodowli prądków - Löwenssteina-Jensena, różne podłoża selektywne do hodowli bakterii z rodzaju Campylobacter, Yersinia, Vibrio, gatunków Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, itd.; wiele z nich zawiera antybiotyki jako składnik selekcjonujący drobnoustroje.
Do podłoży dodawane są barwniki (wskaźniki), które zmieniają swoje zabarwienie w zależności od pH podłoża (często jest to błękit bromotymolowy, czerwień fenolowa, purpura bromkokrezolowa i inne).
Przy podłożach wybiórczo-różnicujących zmiana zabarwienia w czasie wzrostu określonego drobnoustroju informuje o określonej właściwości w zależności od danego substratu (np. rozkład laktozy, manitolu itd.)
Hodowla drobnoustrojów może być prowadzona:
w warunkach tlenowych - cieplarki 35°- 37° C lub 22°-30°C, 42°C
w warunkach mikroaerofilnych (eksykatory i generatory wytwarzające gaz i/lub jego mieszaniny o określonym stosunku ilościowym i/lub procentowym np. CO2; H2+CO2
w warunkach beztlenowych - generatory z gotową
Czas inkubacji hodowli: 24h do 7 doby/ dla grzybów niedoskonałych - 14 dni
Metody hodowli drobnoustrojów, połączone z wyosobnieniem i identyfikacją, nazywane metodami konwencjonalnymi (klasycznymi) pozostają do chwili obecnej referencyjne w diagnostyce mikrobiologicznej.
Do hodowli bakterii i grzybów najczęściej wykorzystywane są podłoża stałe, rzadziej płynne.
Posiew materiałów oraz posiewy bakterii lub grzybów na podłoża stałe dokonywany jest przy użyciu ezy: platynowe, z drutu Kanthalowego, plastikowe =jednorazowe
Najczęściej stosowana technika = technika posiewu redukcyjnego (technika posiewu z izolacją).
Kolonia jest to zbiór komórek wyrastających na podłożu stałym, widoczny gołym okiem.
Przyjmuje się (w posiewach półilościowych i ilościowych), że jedna kolonia odpowiada jednej komórce bakteryjnej lub grzybiczej.
Zamiast liczby komórek przypadających na g (gram) lub ml (mililitr), wprowadzono do badań ilościowych określenie cfu (ang. colony forming units), czyli jednostki tworzące kolonie.
Przy opisie kolonii (osobnik I rzędu) = MORFOLOGIA KOLONII najczęściej bierze się pod uwagę:
kształt - okrągły, owalny, nieregularny, postrzępiony, gwiazdkowaty, promienisty, soczewkowaty, głowa meduzy i inne,
wielkość - średnica kolonii w mm,
brzeg - równy, falisty, zatokowaty, postrzępiony, poszarpany, ząbkowany i inny;
powierzchnia - gładka, szorstka, drobno- lub gruboziarnista, pomarszczona matowa, błyszcząca, brodawkowata itp.;
struktura - bezkształtna, szorstka, nitkowata, ziarnista i inne;
wyniosłość ponad powierzchnię - brak, wypukła, płaska, stożkowata, o wyniosłym brzegu i zapadłym środku, kopulasta ze środkiem wzniesionym w postaci guziczka, itp.;
kolor - barwa w świetle odbitym i przepuszczalnym, zabarwienie samej kolonii, zabarwienie podłoża (barwniki rozpuszczalne). Najczęstsze barwy - biała, żółta, pomarańczowa, czerwona, czarna, zielona, niebieska, brązowa, i inne;
przejrzystość - przejrzysta, mętna, przeświecająca, opalizująca, nieprzejrzysta
konsystencja - masłowata, sucha, lepka, błoniasta, skórzasta, ciągła, śluzowata,
zapach - mdławy (np. Pseudomonas aeruginosa = kredki świecowe, jaśmin), kwaśne = gronkowce, piwa, miodu, gliny itp.,
zawieszalność - zdolność do tworzenia jednolitej zawiesiny w roztworze soli fizjologicznej - łatwa; niezawieszalna - grudkowa,
inne cechy, takie jak: typ hemolizy na podłożu z dodatkiem krwi:
typ β - całkowita liza wokół kolonii
typ α - częściowa liza, zazielenienie wokół kolonii
typ γ - brak hemolizy
Typy wzrostu na podłożach płynnych, jako ocena morfologii niektórych drobnoustrojów, wiążą się ściśle ze sposobem oddychania.
Drobnoustroje tlenowe rosną na powierzchni podłoża płynnego; względne beztlenowce powodują zmętnienie całej pożywki, a beztlenowce tworzą osad na dnie próbówki - np. wzrost drobnoustrojów na podłożu półpłynnym Schedlera.
Podłoża opis:
Agar MacConkey - podłoże wybiórczo-różnicujące; służy do izolacji pałeczek Gram-ujemnych z materiałów klinicznych. Jest to podłoże diagnostyczne o słabej wybiórczości. Zawartość soli żółci i fioletu krystalicznego hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, które mają duże wymagania odżywcze. Zawartość laktozy jako jedynego cukru pozwala na odróżnienie pałeczek laktozo-dodatnich od laktozo-ujemnych. W obecności zawartego w podłożu wskaźnika - czerwieni obojętnej, wskutek zależnego od rozkładu laktozy zakwaszenia środowiska, kolonie bakterii rozkładających laktozę zabarwiają się na kolor różowy. Kolonie, które aktywnie rozkładają laktozę (np. Escherichia coli), są ponadto otoczone różową strefa wytrąconych soli kwasów żółciowych. Kolonie szczepów rozkładających laktozę słabo lub z opóźnieniem (np. Citrobacter sp.) mogą pozostać bezbarwne lub stają się lekko różowe dopiero po 48 godzinach hodowli. Pałeczki laktozo-ujemne (np. Shigella sp.; Salmonella sp.; Pseudomonas sp.;) mają bezbarwne kolonie. Podłoże hamuje mgławicowy (rozpełzliwy) wzrost bakterii z rodzaju Proteus np. Proteus mirabilis.
Podłoże Kliglera: jest to stałe podłoże diagnostyczne dla pałeczek Gram-ujemnych o małych wymaganiach odżywczych, szczególnie używane w diagnostyce Enterobacteriaceae. Pozwala ono zbadać zdolność rozkładu glukozy, laktozy i wytwarzanie siarkowodoru. Przygotowane jest w probówkach w postaci małych półskosów (rysunki 1, 2, 3,). Podłoże wymaga starannego posiewu zarówno w części słupkowej (wkłucie), jak i skośnej. Proporcja masy podłoża do posianego inokulum w obu częściach jest odwrotna - w części słupkowej przy małym inokulum jest dużo podłoża, a w skośnej odwrotnie. Podłoże zawiera między innymi glukozę i laktozę (w
Brak rozkładu cukrów wiąże się z alkalizacją pożywki, która pogłębia swoją wyjściową barwę - przyjmując kolor czerwony - schemat III -1.
Wytwarzanie w czasie fermentacji cukrów dużych ilości CO2 lub H2 uwidacznia się przez rozerwanie lub unoszenie podłoża.
Tworzenie się H2S z tiosiarczanu zachodzi powoli w kwaśnym środowisku słupka i powoduje powstawanie nierozpuszczalnego czarnego strątu siarczku żelaza. Ocena podłoża powinna być dokonana po 24 godzinach.
Posiew - podstawowa metoda diagnostyki mikrobiologicznej polegająca na przeniesieniu pobranego materiału biologicznego (ze środowiska, od pacjenta itd.) na odpowiednie podłoża mikrobiologiczne umożliwiające wzrost drobnoustrojów w taki sposób, aby ostatecznie uzyskać pojedyncze, odizolowane kolonie bakterii, czy grzybów. Posiew jest podstawą do identyfikacji drobnoustrojów, określenia (wykorzystując niektóre metody) ilości mikrobów w wyjściowej zawiesinie oraz określenia lekooporności.
Posiew redukcyjny - laboratoryjna metoda hodowania bakterii stosowana w mikrobiologii. Służy między innymi do izolacji czystych kultur bakteryjnych. Metoda ta polega na zanurzeniu ezy w probówce z drobnoustrojami, naniesieniu pobranego materiału na podłoże agarowe umieszczone zwykle na szalce Petriego. Sposób naniesienia nie jest obojętny. Posiew należy zacząć wykonywać od górnego brzegu szalki i ruchem esowatym nanosić drobnoustroje kierując się do środka szalki, pozostawiając jednak połowę jej powierzchni wolną. Po wykonaniu tego zabiegu należy ezę wyżarzyć w płomieniu palnika, obrócić szalkę o 45° w lewo i wykonać podobną operację na drugiej połowie szalki. Następnie znowu wyżarzyć ezę, obrócić szalkę o 45° i ruchem esowatym wykonać ostatnią część posiewu redukcyjnego. Po inkubacji, w miejscach z ostatnich etapów posiewu redukcyjnego powstaną osobne kolonie bakterii.
Ze względu na wykorzystywane źródło energii wyróżnia się m.in. bakterie:
siarkowe (uzyskujące energię, potrzebną do asymilacji dwutlenku węgla, podczas utleniania siarki i jej związków),
metanowe (rozkładające związki organiczne z wytworzeniem metanu),
wodorowe (utleniające wodór cząsteczkowy),
żelazowe (utleniające związki żelazawe do żelazowych),
purpurowe siarkowe (samożywne, zawierające bakteriochlorofil, które w czasie fotosyntezy redukują dwutlenek węgla, utleniając siarkowodór),
purpurowe bezsiarkowe (samożywne, w czasie fotosyntezy redukujące dwutlenek węgla przez utlenianie znajdujących się w środowisku alkoholi lub wodoru).
Wśród bakterii są zarówno tlenowce (aeroby), jak i beztlenowce (anaeroby):
bezwzględne tlenowce - rosną tylko w obecności tlenu atmosferycznego i czerpią energię drogą oddychania tlenowego;
bezwzględne beztlenowce - rosną tylko w nieobecności tlenu (tlen jest dla nich zabójczy), czerpią energię drogą beztlenową;
względne beztlenowce - rosną w niskich stężeniach tlenu atmosferycznego, czerpią energię także drogą oddychania beztlenowego. W tej grupie jest najwięcej bakterii chorobotwórczych.
Ze względu na temperaturę, w której bakterie utrzymują żywotność, dzielimy je na:
bakterie psychrofilne - giną poniżej temperatury 0°C i powyżej 30°C, najlepiej rozwijają się w temperaturze: 15°C
bakterie mezofilne - giną poniżej temperatury 10°C i powyżej 45°C, najlepiej rozwijają się w temperaturze: 30-37°C. W tej grupie znajdują się bakterie chorobotwórcze, dla których optymalna jest temperatura ciała ludzkiego
bakterie termofilne - giną poniżej temperatury 40°C i powyżej 70°C, najlepiej rozwijają się w temperaturze 52°C. Bakterie te żyją w gorących źródłach siarkowych, żelazowych oraz w gorących ściekach.
Identyfikacja bakterii z rodzaju Streptococcus w oparciu o ich właściwości biochemiczne (test API 20 Strep)
Test API 20 Strep jest wystandaryzowanym zestawem zawierającym 20 testów biochemicznych, który daje szerokie możliwości. Umożliwia on identyfikację grup lub gatunków większości paciorkowców i enterokoków oraz najbardziej powszechnych spokrewnionych drobnoustrojów. Niewątpliwie metoda ta przy użyciu odpowiednich kodów stanowi jak dotąd najdoskonalszą i najbardziej uniwersalną metodę identyfikacji bakterii.
Charakterystyka testu APITest API składa się z 20 miniprobówek z tworzywa wtopionych w pasek również wykonany z tworzywa. W każdej miniprobówce znajduje się odwodniony substrat i wskaźnik umożliwiający odczytanie reakcji.Oznaczenie polega na dodaniu zawiesiny paciorkowców do wszystkich probówek i po inkubacji dodaniu do niektórych probówek odpowiednich odczynników. Zmiany barwy zawartości probówek umożliwiają określenie, jakie substraty są rozkładane, czy też jaki rodzaj aktywności enzymatycznej występuje. Określenie grupy lub gatunku dokonuje się na podstawie załączonego przez producenta klucza diagnostycznego.
Morfologia bakterii ma znaczenie w identyfikacji gatunków i wspólnie z barwieniem metodą Gramma jest jednym z pierwszych kroków w określaniu przynależności systematycznej.
Wyróżniamy trzy podstawowe kształty bakterii:
1 kuliste
2 cylindryczne
3 spiralne
ad.1) Formy kuliste łac.cocci ( ziarniaki) mogą występować pojedyńczo lub w układach,
gdy po podziale komórki nie zupełnie rozłączają się od siebie:
dwoinka - diplococci,
paciorkowce- streptococci,
czwórniaki - tetracocci, komórka dzieli się w 2 płaszczyznach,
sześcianka - pakietowiec - sarcinae,
gronkowiec - staphylococci.
ad.2). Formy cylindryczne - występują pojedyńczo lub tworzą układ, dając łańcuszek.
Różnią się długością i kształtem komórki:
pałeczka - krótsza o końcu zaokrąglonym,
laseczka - dłuższa, tępo zakończona.
ad.3).Formy spiralne - podział zależnie od tego jaką część spirali stanowią:
przecinkowce - Vibrio,
śrubowce - Spirillium,
krętki - Spirochaeta.
Rodzaje barwienia bakterii - aby zaobserwować bakterie w mikroskopie świetlnym, ocenić właściwie ich wielkość, kształt, niektóre cechy morfologiczne, musimy je zabarwić. Bakterie bowiem słabo załamują promienie świetlne. Ze względu na to, co barwimy, wyróżniamy barwienie negatywne bakterii, które polega na barwieniu tła, a bakterie pozostają niezabarwione, oraz barwienie pozytywne, które polega na barwieniu bakterii, z których przygotowaliśmy preparat. Do barwienia bakterii służą nam liczne barwniki, m.in. błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fuksyna zasadowa, fuksyna kwaśna, safranina, zieleń malachitowa. Ze względu na to ile barwników zastosujemy przy barwieniu, wyróżniamy barwienie proste (stosujemy jeden barwnik) oraz barwienie złożone (stosujemy kolejno kilka barwników). Barwienie złożone ma większe znaczenie, gdyż umożliwia określenie nie tylko kształtu bakterii, ale także pozwala ocenić jej niektóre cechy morfologiczne. Przykładem barwienia złożonego jest barwienie wg metody Grama, metody Ziehl-Neelsena, metody Schaeffera-Fultona. Technika każdego barwienia polega na pokrywaniu szkiełka podstawowego z naniesionym i utrwalonym preparatem-barwnikiem na określony czas, a następnie spłukiwaniu poszczególnych barwników wodą przed nalaniem następnych. Czasami w zależności od przepisu stosujemy także takie substancje jak alkohol, czy płyn Lugola, a także podgrzewanie preparatu nad palnikiem. Preparat po wysuszeniu oglądamy pod imersją. Wyróżnić możemy także barwienie bakterii przyżyciowe (rzadkie) i pośmiertne (częściej stosowane).
WIELKOSĆ BAKTERII: Bakterie, podobnie jak pozostałe komórki prokariotyczne, wykazują zwykle niewielkie rozmiary. "Standardowa" komórka bakteryjna, o ile w ogóle można coś takiego sobie wyobrazić, ma zwykle średnicę ok. 1 μm (tj. 10-6m), przy długości nie przekraczającej 5 μm. Spotyka się jednak również bakterie o mniejszych wymiarach, np. wiele ziarniaków ma średnicę 0,5 μm, a z drugiej strony znane są również prawdziwe giganty. Największym znanym obecnie gatunkiem bakterii jest Thiomargarita namibiensis ("siarkowa perła Namibii"), której komórka może mieć długość nawet 2 mm. Mniejsze od bakterii są już tylko wirusy, natomiast nieco większe - komórki grzybów.
Budowa bakterii
Budowa komórki bakteryjnej: Wszystkie bakterie mają stosunkowo prostą budowę komórkową. Nie posiadają takich organelli jak jądro komórkowe, mitochondria czy chloroplasty. Ważnym składnikiem komórki bakteryjnej jest ściana komórkowa. Opierając się na różnicach w strukturze ścian (zob. barwienie metodą Grama), bakterie można podzielić na dwie grupy: Gram-dodatnie i Gram-ujemne. Gram-dodatnie mają ścianę komórkową składającą się z grubej warstwy mureiny. Gram-ujemne ścianę mają cieńszą, ale występuje u nich podwójna błona komórkowa. Dodatkowymi elementami, w które mogą być zaopatrzone powłoki komórek bakteryjnych, są rzęski i fimbrie, które umożliwiają ruch, przyleganie do innych komórek bakteryjnych i koniugację. Bakterie posiadają stosunkowo mało organelli komórkowych w porównaniu do eukariotów. Posiadają nagą, kolistą i nieupakowaną cząsteczkę DNA, czyli genofor, rybosomy, mezosomy, a także plazmidy. Niektóre bakterie potrafią tworzyć struktury przetrwalnikowe zwane endosporami, które pozwalają przetrwać niekorzystne warunki. Komórki są zbudowane z:cytoplazmy, która jest substancją koloidalną, wypełniającą wnętrze komórki,nukleoidu, który jest obszarem cytoplazmy, w którym znajduje się nić DNA,otoczki, która jest ścianą o funkcji szkieletowej, na niej są zawieszone rzęski,ściany komórkowej, która jest ścianą o funkcji ochronnej,błony komórkowej, która jest strukturą oddzielającą wnętrze komórki od świata zewnętrznego,rybosomu, który jest organellum służącym do produkcji białek,rzęsek, które są wypustkami pełniącymi funkcję ruchową,wici, która jest organellum ruchu;
Przetrwalniki. Niektóre gatunki bakterii mają zdolność wytwarzania wewnątrz komórki przetrwalników, czyli form zabezpieczających komórkę przed niekorzystnymi warunkami środowiska, a tym samym przed zginięciem. W każdych korzystnych warunkach przetrwalnik pozostaje wewnątrz komórki nie spełniając swojej roli. Z chwila gdy nadchodzą złe warunki zawartość komórki przechodzi do przetrwalnika który otacza się grubą błoną, reszta komórki zanika. W takiej postaci przetrwalnik może przebywać nawet klika lat. Z chwilą nastania warunków korzystnych przetrwalnik przekształca się w komórkę.
Cytoplazma jest wielofazowym układem koloidalnym o bardzo skomplikowanej budowie strukturalnej, chemicznej i złożonych funkcjach biochemicznych. Cytoplazma ze swoim pH zbliżonym zwykle do obojętnego tworzy środowisko dla zdecydowanej większości reakcji biochemicznych, dostarcza do nich substratów i co ważne, zawiera enzymy dla tych reakcji. Najbardziej zdumiewającą cechą cytoplazmy jest zdolność do odwracalnej zmiany stanów skupienia. Otóż, raz zachowuje się jak płyn (zol - półpłynny), kiedy indziej jest sztywna i elastyczna (żel - półstały). Możliwość ta wynika z koloidalnego charakteru cytoplazmy i ma ogromne znaczenie czynnościowe.
Nukleoid, prokarion, część komórki bakterii, stanowiąca odpowiednik jądra komórkowego eukariontów. Nukleoid nie posiada błony jądrowej, zawiera genofor, zwany również chromosomem bakteryjnym, zbudowany z cząsteczki DNA, podczas podziału komórki następuje replikacja cząsteczki DNA, w wyniku, której powstają dwie kopie materiału genetycznego.
Wici i rzęski są organellami służącymi do poruszania się komórki. Wici są na ogół długie w porównaniu z wielkością komórki i występują zazwyczaj pojedynczo. Rzęski są krótkie i liczne. Struktury te występują powszechnie u organizmów jednokomórkowych oraz u małych wielokomórkowców. Niezależnie od rodzaju komórek wici i rzęski mają podobną budowę, składają się z cienkiego, cylindrycznego trzonka pokrytego wypustką błony komórkowej.
Rybosomy zostały odkryte w 1953 r. przez Robinsona w komórkach fasoli, a wkrótce potem także w komórkach zwierzęcych. Ze względu na niewielkie rozmiary można je obserwować jedynie przy użyciu mikroskopu elektronowego i to najlepiej po utrwaleniu w osmie. Ultrastruktur tych nie oddziela od cytoplazmy żadna błona biologiczna. Każdy kompletny rybosom składa się zawsze z dwóch podjednostek - większej i mniejszej. W rybosomach odbywa się translacja, ostatni etap ekspresji białka.
Ściana komórkowa bakterii, zewnętrzna błona otaczająca komórkę bakterii, decydująca o jej kształcie, chroniąca przez wahaniami ciśnienia osmotycznego środowiska zewnętrznego. Zbudowana głównie z mureiny (polimeru glukopeptydowego). U bakterii gramujemnych ma grubość 10 nm, składa się z pojedynczej warstwy mureiny, zawiera substancje białkowe i lipopolisacharydowe. U bakterii gramdodatnich jest dwukrotnie grubsza, zawiera wiele warstw mureiny, kwasy tejcholowe, mniej białek i polisacharydów.
ROZPOZNANIE LABORATORYJNE BAKTERII
Bakterie Gram-dodatnie, G+ - bakterie barwiące się na niebiesko w barwieniu metodą Grama. W budowie komórki bakterii G+, w przeciwieństwie do Gram-ujemnych, nie wyróżnia się zewnętrznej błony komórkowej. Ściana komórkowa bakterii G- jest cieńsza od bakterii G+.
Bakterie Gram-ujemne, G- — bakterie barwiące się na czerwono w barwieniu metodą Grama. W budowie komórki bakterii G-, w przeciwieństwie do Gram-dodatnich, wyróżnia się zewnętrzną błonę komórkową. Ściana komórkowa bakterii G- jest cieńsza, zawiera mniej warstw peptydoglikanu (mureiny). Bakterie G+ zatrzymują fiolet krystaliczny i nawet po odbarwianiu acetonem lub etanolem pozostają ciemno zabarwione. Tymczasem G- wiążą niewiele fioletu i łatwo się odbarwiają. Później dobarwiane są zwykle na czerwono. Rozróżnianie bakterii G+ i G- sprowadza się więc do rozróżnienia czy po barwieniu, odbarwianiu i dobarwianiu są różowe lub czerwone (Gram-ujemne), czy też fioletowe do brązowych (Gram-dodatnie).
GRAM- dodatnie:
1. ziarenkowce: Staphylococus (gronkowce), Streptococus (katalazo ujemne), Enterococus- BEZWZGLĘDNE BEZTLENOWCE
2. pałeczki: Corynebakterium, Listeria, Mycobakterium- WZGLĘDNE BEZTLENOWCE
3. laseczki: Bacillus- TLENOWCE, Clostridium- BEZTLENOWCE
ZIARENKOWCE
GRONKOWCE- staphylococcus
Identyfikacja: test na wytwarzanie koagulaty, test z nowobiocyną, podłoże Chapmana, wrażliwość na furazolidon
Staphylococcus aureus: Gronkowiec złocisty to Gram-dodatnia bakteria występująca w jamie nosowo-gardłowej oraz na skórze ludzi i zwierząt. Nosicielstwo występuje szczególnie często pośród personelu szpitalnego, co ma szczególne znaczenie dla szerzenia się zakażeń wewnątrzszpitalnych. Gronkowce wytwarzają termoodporną enterotoksynę tylko w zakażonym produkcie spożywczym. Toksyna Gronkowca jest bardzo odporna na działanie wysokiej temperatury, nie niszczy jej nawet gotowanie przez 30 minut. Optymalna temperatura do rozwoju Gronkowca wynosi 37ºC. Zatrucia gronkowcowem mają krótki okres inkubacji - średnio 2h. Charakterystycznymi objawami zatrucia gronkowcem są: wymioty, biegunka, spadek ciśnienia krwi, zapaść. Śmiertelność jest niewielka. Gronkowce nie wytwarzające przetrwalników, łatwo giną przy ogrzewaniu. Natomiast enterotoksyna Staphylococcus aureus odporna na ogrzewanie może nie zostać rozłożona nie tylko w czasie gotowania, ale nawet pieczenia produktów uprzednio zakażonych. Przyczyną zatruć gronkowcowych mogą być różne produkty spożywcze takie jak: wędliny, potrawy mięsne, sałatki, ciastka, mleko i przetwory mleczne, kremy, chałwy, lody. Te ostatnie są dość częstą przyczyną zatruć wtedy, gdy mieszanka przeznaczona do zamrożenia, nie została natychmiast schłodzona po pasteryzacji lub gdy rozmrożone lody zostały powtórnie zamrożone. Enterotoksyna obecna w produkcie spożywczym nie zmienia zwykle smaku ani zapachu tego produktu. Nie powoduje także bombażu konserw ponieważ gronkowce nie wytwarzają gazu.
Staphylococcus epidermidis (koagulazo ujemny): gronkowiec naskórkowy, tzw. biały, bytując na powierzchni naszej skóry razem z takimi bakteriami jak maczugowce (Corynebacterium sp.), dba wespół z nimi o utrzymanie właściwego pH skóry.
Staphylococcus saprophyticus
PACIORKOWCE- streptococcus
Identyfikacja: testy lateksowe (aglutynacyjne), testy z bacytracyną i z optochiną, test CAMP
Streptococcus pyogenes (paciorkowiec ropny): Bakterie mają kształt kulisty lub owalny o przekroju od 0,8 do 1,2 ?m. Układają się w długie lub krótkie łańcuchy. Rosną w temperaturze od 20 do 42 C, temperatura optymalna wynosi 37 C. Na agarze z krwią rosną pod postacią szarobiałych kolonii o średnicy 1 - 2 mm, dookoła których tworzy się pierścień zupełnego przejaśnienia podłoża, tzw. hemoliza beta (ß). Na podłożach zwykłych rosną słabo, dopiero dodatek do podłoża krwi, surowicy lub glukozy wzmaga ich wzrost. Rozszczepiają z wytworzeniem kwasu lub gazu glukozę, laktozę, sacharozę, salicynę, trehalozę i niekiedy mannitol. Utleniają alkohol i kwasy tłuszczowe. Wytwarzają kilka różnych substancji toksycznych i enzymatycznych - streptolizynę O i S, streptokinazę, streptodornazę, hialuronidazę i toksynę erytrogenną. Giną w temperaturze 60 C w ciągu 30 minut. W stanie wysuszenia zachowują żywotność przez długi czas, w hodowlach sztucznych giną szybko w następstwie zakwaszenia podłoża. Paciorkowce ropne wywołują wiele różnych schorzeń: płonicę, zapalenie gardła (angina), zapalenie ucha środkowego (otitis media), zapalenie zatok (sinusitis), zapalenie opon mózgowo - rdzeniowych (meningitis), zapalenie oskrzeli (bronchitis), zapalenie płuc (pneumonia), zapalenie opłucnej (pleuritis), zakażenie ran, chorobę reumatyczną, zakażenie skóry - róża (erysipelas), liszajec paciorkowcowy, ropnie, zakażenia przyranne i bakteriemie. Przebycie płonicy zapewnia długotrwałą odporność, zachorowania ponowne zdarzają się rzadko.
Streptococcus agalactiae: wywołuje przeważnie hemolizę ß. Występuje w składzie mikroflory człowieka w gardle, pochwie i kale. Wywołuje m.in. zapalenie wymion u krów, u ludzi wywołuje posocznice połogowe, endocarditis, pneumonitis, zakażenia miejscowe ropne.
Streptococcus pneumoniae: Paciorkowce zapalenia płuc (pneumokoki) mają kształt lancetowatych ziarenek, występujących zawsze parami (dwoinki) i otoczonych w warunkach in vivo wspólną otoczką. Charakterystyczny dla tych drobnoustrojów jest układ dwóch ziarenek zwróconych do siebie szerszymi podstawami. Na agarze z krwią rosną zwykle pod postacią małych płaskich z zagłębieniami w środku, przezroczystych kolonii o przekroju 1 - 2 mm, dających hemolizę . Niekiedy kolonie mają wygląd śluzowaty. Rosną w temperaturze od 25 do 41 C, optymalna 37,5 C (szczególnie obficie przy obecności 10 % CO 2) Dobrze rosną na agarze półpłynnym. Rozszczepiają węglowodany z wytworzeniem kwasu bez gazu. Fermentują inulinę, nie fermentują arabinozy, rafinozy i dulcytolu. Szczepy pozbawione otoczki nie są chorobotwórcze. W odróżnieniu od paciorkowca zieleniejącego pneumokoki są zwykle chorobotwórcze dla myszy. Paciorkowce zapalenia płuc są naturalnymi mieszkańcami błon śluzowych, górnych dróg oddechowych, spojówek, pochwy. Wywołuje: zapalenie płuc, ropnie, ropnie płuc, zapalenie ucha środkowego, zapalenie wyrostka sutkowego, zapalenie opon, zapalenie zatok, zakażenie krwi, zapalenie spojówek, owrzodzenie rogówki.
Streptococcus viridans (paciorkowiec zieleniejący): Rośnie ona na agarze z krwią pod postacią małych, przezroczystych, błyszczących i wypukłych kolonii, dających hemolizę ? (zielonkawa strefa wokół kolonii) lub hemolizę ? (brak hemolizy). W warunkach naturalnych występuje na błonach śluzowych górnych dróg oddechowych oraz w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt. Niektóre szczepy mają właściwości chorobotwórcze - mogą być przyczyną powolnego zapalenia wsierdzia, zapalenia dróg moczowych lub gruczołu mlekowego.
Bakterie Enterococcus faecalis czyli paciorkowce kałowe należą do ziarniaków. Rosną w temperaturze 10-45˚C. Stanowią naturalną florę przewodu pokarmowego człowieka i zwierząt. Niektóre mogą być przyczyną zatruć pokarmowych i chorób dróg moczowych oraz zakażeń szpitalnych. Do ważniejszych należą: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, które stanowią 95% rodzajów Enterococcus. Charakteryzuje się naturalną opornością na antybiotyki. Chorobotwórczość: zakażenia dróg moczowych, zapalenie gruczołu krokowego, zapalenie wsierdzia, bakteriemia (cewnikowanie lub inwazyjne zabiegi na drogach moczowych), zapalenie opon mózgowo - rdzeniowych (układy zastawkowe stos. w leczeniu wodogłowia), zakażenia w obrębie miednicy małej, zakażenia w obrębie jamy brzusznej: zapalenie dróg żółciowych, otrzewnej (dializa otrzewnowa), zakażenia skóry i tkanek miękkich: zakażenia ran chirurgicznych, oparzeniowych, stopy cukrzycowej. Identyfikacja: testy lateksowe, na podłożu Columbia agar
Niemniej jednak wszystkie gronkowce mają potencjalne mechanizmy zjadliwości, enzymy proteolityczne i toksyny (jak np. enterotoksyna gronkowcowa wywołująca ciężkie zatrucia pokarmowe, toksyna epidermolityczna dająca pęcherzycę noworodków lub toksyna wstrząsu toksycznego często prowadzącego do śmierci). Zjadliwość ta zwana jest wirulencją.
PAŁECZKI
Corynebacterium (maczugowiec błonicy) Pałeczka cienka, prosta, lub lekko zagięta, kształtu cylindrycznego o biegunach zaokrąglonych, często maczugowato zgrubiałych. Na biegunach występują ziarnistości. Są nieruchome, zarodników i otoczki nie wytwarzają. Rosną dobrze na podłożach z dodatkiem surowicy lub węglowodanu. Optymalna temperatura wzrostu wynosi 34 - 37 C. Rozkładają węglowodany bez wytwarzania gazu. Wytwarzają katalazę. Właściwości biochemiczne pozwalają na wyodrębnienie trzech typów maczugowców błonicy: gravis, mitis i intermedius, oraz na przeprowadzenie różnicowania z maczugowcami niechorobotwórczymi. Chorobotwórcze działanie polega na wytwarzaniu bardzo silnej egzotoksyny. Błonica jest ostrą chorobą zakaźną, zlokalizowaną najczęściej w gardle, krtani, nosie, rzadziej na skórze. Test Lofflera i test Elecka na wykrycie.
Listeria monocytogenes (bakteria lodówkowa). Ta bakteria jest trudna do wykrycia i eliminacji z otoczenia człowieka, gdyż stale bytuje w jelitach wielu ludzi i zwierząt i na ogół nie przysparza kłopotów. Listeria monocytogenes może być postrachem osób dbających o higienę kuchni, gdyż rozwija się również w temperaturze panującej w lodówce. Jak też dlatego, żę upodobała sobie mleko, sery, lody, surowe warzywa, kiełbasę, drób, mięso, ryby - a więc większość wrażliwych na temperaturę pokarmów, które przechowujemy w lodówce. Objawy zakażania pokarmowego bakterią imitują objawy grypy: wysoka gorączka, bóle stawówi mięśni, kaszel, itp. Objawy pojawiają się od 4 godzin do kilku dni po spożyciu zakażonego pokarmu. Niebezpieczne powikłania. Powikłaniem zakażenia bakterią Listeria monocytogenes może być uszkodzenie płodu u kobiet ciężarnych. Bateria zagraża także swymi objawami zdrowiu niemowląt, osób starszych i chorych.. Na szczęście zakażenia tym drobnoustrojem są rzadkie. Ruch tylko w temp 22' C. Na wykrycie test Graya.
Mycobacterium tuberculosis (prątek gruźlicy)- czynnik etiologiczny gruźlicy i trądu. Należy do drobnoustrojów Gram-dodatnich. Prątki to drobnoustroje oporne na czynniki środowiskowe takie jak wysuszenie, podwyższona i niska temperatura, wysokie i niskie pH. W ścianie komórkowej zawierają liczne substancje woskowe (kwasy mikolinowe, lipoarabinomannan) warunkujące kwasooporność. Wśród prątków wyróżnia się prątki gruźlicze, prątki atypowe oraz prątki środowiskowe. Specyficzną właściwością prątków kwasoopornych powodujących gruźlicę jest zdolność do przeżywania w komórkach, które służą do zabijania patogenów w ustroju. Na wykrycie- metoda Zehl Nielsen . Barwią się na czerwono- żółto. Czas wzrostu to 6-10 tyg; wytwarza barwnik.
LASECZKI
Bacillus antracis i cereus komórki są stosunkowo duże i mają kwadratowe końce. Jest to bakteria Gram-dodatnia (barwienie metodą Grama). W preparatach mikroskopowych uzyskanych z tkanek lub krwi bakterie zwykle występują pojedynczo lub w parach, natomiast bakterie hodowane w pożywce obserwuje się zwykle w postaci długich łańcuszków komórek. Bacillus anthracis barwiony metodą Grama. Jak wszystkie bakterie należące do rodzaju Bacillus, Bacillus anthracis wytwarza przetrwalniki (endospory, proces tworzenia przetrwalników określa się terminem sporulacja). Są one niezwykle oporne na niesprzyjające warunki środowiska i mogą przetrwać w glebie nawet kilkadziesiąt lat. Są jednak niszczone podczas standardowej sterylizacji w autoklawie. Bakterie B. anthracis wytwarzają przetrwalniki wtedy, gdy znajdą poza organizmem gospodarza się np. w glebie lub w hodowli in vitro, pod koniec wykładniczej fazy wzrostu (zwykle po około 48 h hodowli). Sporulacja może zachodzić także w martwych tkankach, ale nigdy w żywym organizmie. Endospory zlokalizowane są po środku komórki (porównaj przetrwalniki wytwarzane przez laseczki Clostridium, zauważ, że komórki nie są rozdęte). Spory mają od 2 do 6 mikrometrów średnicy (Przetrwalniki możecie obserwować pod mikroskopem na naszych ćwiczeniach z mikrobiologii (metoda Dornera), oczywiście nie są to przetrwalniki Bacillus anthracis !!!)
Bacillus cereus- ruchliwa, laseczka tlenowa, Gram(+), przetrwalnikująca (przetrwalniki ciepłooporne). Występuje w ziemi, na roślinach, w zbiornikach wodnych, wodzie wodociągowej, kurzu a stąd do żywności; źródłem zakażenia są: potrawy mączne (skrobia sprzyja rozwojowi B.cereus),budynie, zupy, warzywa, przyprawy, wyroby garmażeryjne, kiełbasy, mięsa. 107- żywych komórek/g produktu powoduje zatrucie; u dzieci wystarcza 105; zapobieganie - higiena obróbki, właściwe parametry technol. , świeże surowce.
Clostridium perfringens to grupa szczególnie niebezpiecznych bakterii, mogą one wywołać zatrucia pokarmowe, zakażenia ran oraz zakażenia szpitalne. Bakterie Cl. Perfringens należą, wraz z laseczką tężca i jadu kiełbasianego, do dużego rodzaj Clostridium: bezwzględnie beztlenowych Gram - dodatnich laseczek, wytwarzających zarodniki. Istnieje kilka typów Cl. perfringens, oznaczonych jako typy serologiczne A - F. Dla człowieka szczególnie niebezpieczne są typy A i F, produkujące kilkanaście toksyn, wywołujących szybką śmierć u zwierząt laboratoryjnych. Oznaczone są one według jednych źródeł literami alfabet greckiego (alfa - ni) a według innych literami od A do E. Do pokarmowego zatrucia Gram - dodatnią laseczką zgorzeli gazowej (Clostridium perfringens typu A) dochodzi najczęściej w wyniku spożycia skażonych potraw: konserw mięsnych i warzywnych, miodów, sosów, zup, szynek pasteryzowanych, drobiu, przetworów z roślin strączkowych. Innym - występującym ostatnio coraz częściej - źródłem Cl. Perfringens jest woda, głównie ścieki. Często dotyczy to jednak wody, która zanieczyszczona ściekami, może zostać pobrana w wodociągach lub studniach! Istnieje kilka typów laseczek C. Perfringens, jeden z nich jest nawet naturalnym składnikiem flory jelitowej i żeńskich dróg rodnych. Czynnikiem determinującym toksyczność Cl. Perfringens typu A jest wytwarzana przez bakterie w jelicie enterotoksyna. Powoduje ona m.in. zahamowanie transportu glukozy, utratę białek, uszkodzenie nabłonka jelitowego. Jak wcześniej wspominano, do zatrucia dochodzi w wyniku spożycia żywności skażonej sporami, które są niestety bardzo oporne na temperaturę. Nawet długie gotowanie niewiele pomaga.
Clostridium tetani Laseczka tężca (łac. Clostridum tetani) - jest to bakteria Gram-dodatnia tworząca przetrwalniki (spory) umieszczone na końcu komórki, w obrazie mikroskopowym przypominające "pałeczki dobosza". Należy do bezwzględnych beztlenowców (żyją i rozwijają się jedynie w środowisku pozbawionym tlenu atmosferycznego). W miejscu zakażenia C. tetani wydziela tetanospazminę - silną neurotoksynę która powoduje nagromadzenie się acetylocholiny w płytkach nerwowo-mięśniowych powodując porażenie spastyczne. Zakażenie następuje podczas urazów penetrujących skażonych glebą, warunkujących rozwój beztlenowy - drobnoustrój zaczyna wydzielać toksynę, która drogą aksonalną dociera do rdzenia kręgowego, w którym zaburza działanie hamujące neuronów wstawkowych. Okres inkubacji trwa od kilku dni (w przypadku ciężkiego przebiegu choroby) do miesiąca (w przypadku mniej groźnego zakażenia). aseczka ta występuje głównie w przewodzie pokarmowym zwierzšt trawożernych zwłaszcza koni. Dostaje się w raz z odchodami do gleby. Zakażenie laseczkš tężca następuje przez zranienie przedmiotem zanieczyszczonym ziemiš. Zakażenie organizmu nie powoduje sama laseczka lecz toxyna którš wydziela. Do pierwszych objawów zakażenia należą: skurcze mięśni gładkich w okolicy zranienia, skurcze te obejmują mięśnie szczękowe w dalszym stadium dochodzi do skurczy tułowia, karku i brzucha. W ciężkich przypadkach dochodzi do zaatakowania mięśni oddechowych co prowadzi do śmierci.
Clostridium botulinum- laseczka, ścisły beztlenowiec, zarodnikująca, Gram (+) ,w starych hodowlach - Gram (-) wytwarza b. silną toksynę - botulotoksynę, która w dawce mniej niż 1?g jest letalna dla człowieka. Jest to typowa neurotoksyna ,jej działanie polega na zablokowaniu funkcji nerwów motorycznych na skutek zaburzeń w syntezie lub uwalnianiu acetylocholiny na zakończeniach neuronów. Ziemia jest głównym rezerwuarem tych drobnoustrojów. Środki spożywcze zanieczyszczone ziemią i nieodpowiednio przechowywane są pożywką, w której laseczki mogą się obficie namnażać.
źródła zatrucia : najczęściej - konserwy jarzynowe (szpinak, groch, szparagi) , konserwy mięsne i rybne, mięso wędzone i peklowane. Pokarm zawierający jad kiełbasiany ma często zapach zjełczałego tłuszczu i zawiera duże ilości gazu, który powoduje wydymanie puszek (bombaż).Czasem jednak pokarm z pozoru nie budzi zastrzeżeń, dlatego dla pewności wskazane jest gotowanie konserw przez przynajmniej 10 minut, co powoduje zniszczenie toksyny.
Objawy kliniczne występują zwykle po18-96 godz. od spożycia pokarmu. Pierwszymi objawami zatrucia są zaburzenia wzroku (podwójne widzenie, wzmożone odruchy na światło), następnie opadanie powiek, trudności w przełykaniu i wymowie, ślinotok. Objawy ze strony przewodu pokarmowego często są niewielkie; może wys. porażenie perystaltyki jelit, bóle brzucha, zaparcie stolca, wymioty. Gorączka zazwyczaj nie występuje, chory jest przytomny. Śmierć następuje na skutek uduszenia lub zatrzymania akcji serca .
Profilaktyka - odpowiednia sterylizacja i kontrola konserw, właściwe przygotowywanie posiłków i przechowywanie produktów.
Clostridium defficile Charakterystyka: Gram(+) laseczka beztlenowa wytwarzająca zarodniki Chorobotwórczość: rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego i biegunka poantybiotykowa (zak. endogenne)biegunka (szpitalne zakażenia egzogenne) Aktywne antybiotyki: metronidazol i wankomycyna doustnie tylko gdy metronidazol nieskuteczny!!!
Skróty w Mikrobiologii:
MRSA- szczepy aureus
MRCNS- szczepy epidermidis
VISA- aureus oporne ?
GISA- szczepy aureus o obniżonej wrażliwości na glikopeptydy
PNSP- pneumoniae oporne na penicylinę
HLAR- enterokoki o wysokim poziomie odporności na glikopeptydy
URE- enterokoki oporne na wankomycynę
URSA- aureus oporne na wankomycynę