MIKROBIOLOGIA - NOTATKI

1. PODŁOŻA MIKROBIOLOGICZNE.

Podłoże mikrobiologiczne to sztucznie stworzone środowisko wzrostu do hodowli drobnoustrojów.

Są stosowane w stosunku do drobnoustrojów do:

• izolacji

• różnicowania

• identyfikacji

• namnażania

• określania właściwości fizjologicznych, biochemicznych i hodowlanych

• otrzymywania produktów metabolizmu

Cechy podłoży do hodowli drobnoustrojów:

• zawierają łatwo dostępne źródła pierwiastków biogennych (C, O, H, N, P, S), energii i soli mineralnych

• odpowiednie pH i potencjał redox

• przejrzystość (z wyjątkiem podłoży zawierających związki nierozpuszczalne np. tłuszcze czy CaCO₃)

• odpowiednie ciśnienie osmotyczne

• jałowość

Podziały podłoży:

Zasadniczo można podzielić podłoża na zwykłe (podstawowe), jak bulion, woda peptonowa czy brzeczka, służące do hodowli drobnoustrojów i do przygotowywania podłoży drugiego typu - podłoży specjalnych, które służą do izolacji i identyfikacji drobnoustrojów.

Podłoża można też dzielić:

1. ze względu na zawartość składników odżywczych

• minimalne - zawierają tylko składniki pokarmowe służące do podtrzymania wzrostu drobnoustrojów (np. podłoże M9)

• pełne - zawierają wszystkie niezbędne substancje odżywcze umożliwiające dobry wzrost drobnoustrojów (źródło węgla, azotu, sole mineralne i czynniki wzrostowe). Jest to np. bulion do hodowli bakterii lub brzeczka do hodowli drożdży

• wzbogacone - są sporządzane dla drobnoustrojów słabo rosnących in vitro, które w tych warunkach wymagają do wzrostu dodatkowych substancji odżywczych

ze względu na skład chemiczny

• naturalne - podłoża o nie w pełni znanym składzie chemicznym, jak np. bulion, brzeczka, mleko. Są to podłoża pełne.

• półsyntetyczne - podłoża o częściowo znanym składzie, np. podłoże M9 wg Adamsa wzbogacone glukozą i autolizatem drożdży służące do hodowli bakterii Proteus i Escherichia. Mogą to być podłoża minimalne, pełne lub wzbogacone.

• syntetyczne - podłoża o w pełni określonym składzie, np. podłoże z mannitolem do hodowli Azotobacter. Mogą to być podłoża minimalne, pełne lub wzbogacone.

• ze względu na konsystencję

• stałe - zawierają 1,5-2% agaru; służą do namnażania i (głównie) do różnicowania bakterii

• półpłynne - zawierają 0,1-0,7% agaru; służą np. do badania ruchu bakterii

• płynne - bez agaru; służą do namnażania drobnoustrojów

• ze względu na przeznaczenie i zastosowanie

• namnażające - służą do otrzymywania dużej biomasy określonych szczepów. Zwykle płynne

• wybiórcze - z dodatkiem związku(ów) hamującego wzrost konkretnej grupy drobnoustrojów

• namnażająco-wybiórcze - pozwalają na namnożenie się tylko jednego gatunku lub jednej grupy mikroorganizmów, znajdujących się w posiewanym materiale. Zawierają związki hamujące wzrost jednej grupy mikroorganizmów, a ułatwiające wzrost innej. Przykłady:

• podłoże bezazotowe z mannitolem do hodowli bakterii wiążących N₂ z atmosfery

• podłoże z kwaśnym selenianem sodu do hodowli E. coli i do namnażania Salmonella sp. z kału lub próbek żywności

• podłoże Kauffmana z czterotionianem sodu i żółcią - hamuje wzrost bakterii kałowych, oprócz Salmonella sp.

• izolacyjne - podłoża stałe zawierające związek (identyfikator) pozwalający odróżnić od siebie kolonie bakterii. Przykłady:

• płytka Endo z laktozą do diagnozy Enterobacteriaceae

• podłoże Chapmana z mannitolem do hodowli gronkowców

• podłoże Clauberga z tellurynem potasu do hodowli Corynebacterium sp.

• identyfikacyjne - podłoża do badania właściwości biochemicznych bakterii

• transportowe - podłoża do zabezpieczania materiału na czas przenoszenia od pacjenta do laboratorium, będące zwykle zbuforowanymi podłożami minimalnymi, bez składników odżywczych - tylko z solami mineralnymi.

2. STERYLIZACJA

Sterylizacja (wyjaławianie) to proces zabijania drobnoustrojów zarówno w formie wegetatywnej i przetrwalnej.

Zastosowanie sterylizacji:

• w placówkach medycznych

• przy produkcji leków,

• przy produkcji płynów infuzyjnych, preparatów krwiopodobnych i protez

• przy produkcji materiałów opatrunkowych

Metody sterylizacji

1. fizyczna

• wysoką temperaturą (sterylizacja cieplna)

• sucha

• wyjaławianie przez wyżarzanie - spalanie drobnoustrojów w płomieniu palnika; do wyjaławianie ezy i igieł preparacyjnych przed i po szczepieniu pożywki. Trzeba rozgrzać do czerwoności

• wyjaławianie przez opalanie - opalanie w płomieniu palnika brzegów kolb i probówek oraz bagietek, głaszczek szklanych, szkiełek podstawowych do preparatów mikroskopowych. Ponadto skalpele, łopatki metalowe, pensety, grube igły sterylizuje się przez zanurzenie w etanolu i opalenie w płomieniu palnika.

• wyjaławianie gorącym suchym powietrzem - przeprowadza się w suszarkach:

• w 140°C przez 2,5 h

• w 160°C przez 2 h

• w 180°C przez 1 h

Służy do wyjaławiania szkła laboratoryjnego, materiałów trwałych, przedmiotów stalowych, materiałów sypkich itp.

Przygotowanie szkła do steryzlizacji tą metodą:

• probówki zakrywa się korkami z waty, ligniny lub metalowymi

• kolby zakrywa się korkami z ligniny lub „kołderkami” i kawałkami folii aluminiowej

• płytki Petrieo i pipety zawija się w papier lub umieszca się w metalowych tubusach (ustniki pipet zabezpiecza się dodatkowo wacikami)

• mokra (parą wodną)

• dekoktacja (wyjaławianie przez gotowanie) - niegdyś używana na większą skalę do sterylizacji instrumentów chirurgicznych i zabiegowych, dziś powinna być ograniczona jedynie do wyjątkowych sytuacji i przy użyciu wody destylowanej. Nie eliminuje wirusów zapalenia wątroby i przetrwalników bakterii.

• pasteryzacja - działanie wysokiej temperatury poniżej 100°C. Niszczy formy wegetatywne drobnoustrojów obecnych w środowisku płynnym (np. mleko, piwo, soki itp). Ma na celu zniszczenie drobnoustrojów chorobotwórczych i przedłużenie ważności produktów spożywczych. Wyróżnia się:

• pasteryzację niską (długotrwałą) - ogrzewanie w temperaturze 63-65°C przez 0,5 h

• pasteryzację wysoką (szybką) - ogrzewanie w temperaturze 72°C przez 15 s (płyn przepływa cienką warstwą przez specjalny aparat) lub 90°C (wtedy bez zatrzymywania w aparacie)

• obróbkę termiczną UHT (Ultra High Temperature) stosującą dwie metody:

• pasteryzację szybką HTST (High Temperature Short Time)

• pasteryzację ultraszybką - ogrzewanie mleka (przepływającego cienką warstwą w aparacie) w temperaturze 130-150°C

Otrzymywanie mleka zupełnie jałowego z inaktywowanymi wirusami pryszczycy. Mleko poddawane metodzie UHT musi być czyste mikrobiologicznie i pozbawione enzymów bakteryjnych. Jej wadami są gorzknienie mleka, koagulacja jego białek i częściowy rozkład.

Każda metoda pasteryzacji kończy się gwałtownych schłodzeniem produktu, tak aby nie stracił wartości odżywczych

• tyndalizacja - proces trzykrotnej sterylizacji w odstępach 24-godzinnych. Przeprowadza się ją w aparacie Kocha i polega na działaniu gorącej pary wodnej. Przebieg sterylizacji:

1. ogrzewanie w temperaturze 100°C przez 0,5 h

2. inkubacja podłoża w cieplarce w temperaturze 32°C na 24 h (wykiełkowanie przetrwalników)

3. drugie ogrzewanie w temperaturze 100°C przez 0,5 h (zabicie wykiełkowanych form)

4. inkubacja podłoża w cieplarce w temperaturze 32°C na 24 h (wykiełkowanie potencjalnych przetrwalników, które przeżyły)

5. trzecie ogrzewanie w temperaturze 100°C przez 0,5 h

Pojedyncza sterylizacja w temperaturze 100°C przez 0,5 h nie niszczy przetrwalników.

• wyjaławianie za pomocą pary wodnej pod zwiększonym ciśnieniem - sterylizacja wysoką temperaturą uzyskaną po sprężeniu nasyconej pary wodnej w odpowietrzonym autoklawie. Metoda używana w stosunku do produktów, które nie ulegają rozkładowi w temperaturze powyżej 100°C. Polega na uwalnianiu ciepła kondensacji podczas skraplania pary wodnej na chłodniejszych przedmiotach (dlatego potrzebne jest odpowietrzenie - w jego obecności skropleniu towarzyszy obniżanie temperatury). Używa się nadciśnienia 0,8-1,6 atm, co odpowiada 177-127°C.

Do sterylizacji drobnych narzędzi (np. w aptekach, laboratoriach itp.) używa się szybkowarów.

Procesowi wyjaławiania podlegają produkty zawierające całe populacje drobnoustrojów (a nie pojedyncze komórki).

Czas śmierci cieplnej - czas potrzebny do zabicia wszystkich drobnoustrojów tego samego gatunku przy określonej temperaturze i składzie pożywki.
Punkt śmierci cieplnej - temperatura, która zabija hodowlę bakteryjną w ciągu 10 minut.

• promieniowanie

• za pomocą promieni UV - promieniowanie UV o zakresie fal 230-270 nm wykazuje silne działanie bakteriobójcze lub mutagenne. Szczególnie promieniowanie o długości fali 260 nm jest pochłaniane przez zasady azotowe DNA i aminokwasy aromatyczne białek, z tym, że najbardziej wrażliwe są formy wegetatywne (szczególnie w fazie logarytmicznego wzrostu). Promieniowanie powoduje powstawanie dimerów T, C oraz T z C tej samej nici DNA, co prowadzi do zaburzeń replikacji. Bakterie mogą się chronić przed mutagennym działaniem promieni UV przez:

• fotoreaktywację - rozszczepianie dimerów T przez fotolizazy

• reperację ciemną - wycięcie uszkodzonego DNA i zastąpienie go prawidłowym

Promieniowanie UV jest stosowane także do sterylizacji pomieszczeń. Działa powierzchniowo.

• sterylizacja radiacyjna - niszczenie drobnoustrojów za pomocą promieniowania jonizującego, głównie promieni X i γ w dawce 1-3 megaradów. Niszczy ono bakterie prawdopodobnie przez destrukcję struktury DNA i radiolizę wody. Jako źródło promieniowania wykorzystuje się izotopy (głównie kobalt 60) i akceleratory elektronów. Tą metodą można sterylizować:

• sprzęt medyczny

• protezy biologiczne

• katgut

• materiały opatrunkowe

• leki i farmaceutyki

• produkty spożywcze (suche)

• kosmetyki

• korki do butelek od wina

• osady z oczyszczalni ścieków i inne

• chemiczna

• sterylizacja gazowa - wykorzystanie gazów do zabicia bakterii. Metoda wykorzystywana do sterylizacji:

• produktów jednorazowego użytku

• sprzętu medycznego

• pościeli szpitalnej i tkanin

• książek

• suszy warzywnych i owocowych

Tlenek etylenu jest trucizną protoplazmatyczną - alkiluje grypy funkcyjne i reszty aminokwasów.

Chlor i ozon służą do dezynfekcji wody.

Wadą tej metody jest jej toksyczność - wymaga zatem szczególnej kontroli i reżimu technologicznego

3. mechaniczna

• sączenie - sączenie płynów, pożywek i buforów przez filtry z porami o średnicy mniejszej niż średnica komórek bakterii (0,2 lub 0,45 μm). Skuteczność tej metody zależy od wielkości bakterii, ich ładunku elektrycznego, budowy powierzchni i powierzchni porów filtra. Stosuje się filtry membranowe z sączkami z nitrocelulozy lub octanu celulozy. Filtry membranowe są także stosowane do:

• oznaczania liczby drobnoustrojów w materiale

• wyjaławiania leków

• pozyskiwania produktów metabolizmu drobnoustrojów (w połączeniu z innymi odpowiednimi metodami)

Zestaw do sączenia składa się np. z kolby ssawkowej i oprawy, w której montuje się filtr membranowy.

3. DEZYNFEKCJA - selektywna eliminacja drobnoustrojów, zapobiegająca przenoszeniu niektórych niepożądanych mikroorganizmów przez działanie na ich strukturę lub metabolizm, niezależnie od funkcjonalnej postaci komórki.

Do dezynfekcji wykorzystuje się także metody sterylizacji (np. dekoktacja, promieniowanie UV).

Sanityzacja - proces dążący do eliminacji możliwie dużej liczby mikroorganizmów na przedmiotach codziennego użytku, powierzchniach płaskich itp., nie dający gwarancji jałowości czyszczonego obiektu. Po prostu mycie przy użyciu detergentów.

Aseptyka - zespół czynności umożliwiających jałowe przygotowanie leków lub produktów medycznych

Antyseptyka - postępowanie prowadzące do usuwania drobnoustrojów ze skóry, błon śluzowych i uszkodzonych tkanek.

Chemiczne środki dezynfekcyjne:

1. kwasy i zasady

• 10% roztwory zasad - dezynfekcja magazynów żywności i pomieszczeń po zwierzętach z chorobami wirusowymi

• 20% zawiesina Ca(OH)₂ (mleko wapienne) - dezynfekcja pomieszczeń, wagonów do transporu zwierząt, toalet, śmietników itp

• 1% HCl do przepłukania ust po przypadkowym naciągnięciu pożywki do ust

• 0,25-2,5% kwas nadoctowy - dezynfekcja przedmiotów z tworzyw sztucznych i porcelany

1. środku utleniające

• chloraminy i podchloryny - w różnych stężeniach do odkażania pomieszczeń, rąk. Chloraminy działają głównie w środowisku kwaśnym i głównie na bakterie Gram-ujemne. Podchloryny działają w środowisku obojętnym i kwaśnym, w niższych temperaturach

• ozon

• nadmanganian potasu

• 3% H₂O₂

2. alkohole (C1-C5)

• 80% propanol - ma działanie alergiczne

• 70% etanol

• alkohol benzlylowy

1. aldehydy

• aldehyd mrówkowy w postaci formaliny (37% formaldehydu + 10-15% aldehydy metylowego) - 3-20% roztwór służy do odkażania.

• aldehyd glutarowy w postaci aldesanu (septofarm) - działa w stężeniu 2% i może być wykorzystany w takim stężeniu, ale w czasie 4 h jako czynnik sterylizujący. Działa na bakterie Gram-ujemne, Gram-dodatnie, prątki gruźlicy, wirusy i grzyby chorobotwórcze.

1. związki fenolowe - mają głównie działanie bakteriobójcze.

• lizol - roztwór krezolu i kwasów tłuszczowych wykorzystywany w stężeniu 2-8%

• septyl - roztwór amylofenolu i fenylofenolu wykorzystywany w stężeniu 1-2% (w czasie 1 h)

• desson - roztwór chloroksylenol-terpineolu i soli potasowej kwasu rycynowego wykorzystywany w stężeniu 2-5%

1. związki powierzchniowo czynne - łatwo dysocjujące czwartorzędowe związki amoniowe. Działają lepiej na bakterie Gram-ujemne i drożdże, niemniej szybko powstają formy oporne.

• sterinol - 10% roztwór bromku dimetylo-laurylo-benzylo-amoniowego

• zanosept - 25% wodny roztwór bromku laurylo-propylo-amonowego

do odkażania stosuje się 2-10% roztwory

1. jodofory - koloidalne roztwory jodu w związkach powierzchniowo czynnych lub w polimerach spełniających rolę nośników

• 2-10% roztwory jodoseptylu lub incodyny

• jodyna - 10% roztwór jodu

1. chloroheksydyna - działą głównie na bakterie Gram-dodatnie

• abacil - 5% roztwór dwuglukonianu chloroheksydyny

1. sole metali ciężkich - niszczą tylko formy wegetatywne

Wymagania stawiane środkom dezynfekcyjnym:

1. skuteczność. Zależy od rodzaju drobnoustrojów, więc przed wyborem środka należy sprawdzić z jakimi drobnoustrojami można mieć do czynienia

2. działanie w małym stężeniu, w krótkim czasie w temperaturze otoczenia

3. brak negatywnego działania na żywność

4. brak negatywnego działania (w stężeniu użytkowym) na maszyny i urządzenia

5. brak zagrożenia dla ludzi, zarówno w trakcie, jak i po dezynfekcji

6. możliwość łatwego spłukania wodą

7. brak nieprzyjemnego zapachu

8. szerokie spektrum działania

4. MIKROSKOPIA

Zdolność rozdzielcza - zdolność rozpoznawania blisko leżących punktów

Powiększenie - stosunek wielkości obrazu pozornego A”, który widzimy w mikroskopie, do wielkości przedmiotu A. Wartość liczbowa jest równa iloczynowi powiększenia okularu i obiektywu.

Kąt aperturowy - kąt zawarty w powietrzu między skrajnymi promieniami światła biegnącymi od oglądanego przedmiotu do soczewki obiektywu. Im większa apertura numeryczna (NA) i mniejsza długość fali świetlnej, tym większa zdolność rozdzielcza (wyrażona mniejszą liczbą). d=λ/NA.

Typy mikroskopów (porównanie na końcu):

1. lupa

2. mikroskop świetlny złożony

• typy obiektywów

• achromatyczne

• fluorytowe (półchromatyczne)

• apochromatyczne

• planchromatyczne

• planapochromatyczne

• immersyjne

• HI/OI - immersja olejowa jednorodna (czarny pasek)

• WI - immersja wodna (niebieski pasek)

• Glyc - immersja z glicerolem (czerwony pasek)

• typy okularów

• ujemne Huggensa - z wypukłymi powierzchniami soczewek skierowanymi w kierunku obiektu, a płaskimi w stronę oka

• dodatnie Ramsdena - z wypukłymi powierzchniami soczewek skierowanymi w kierunku oka, a płaskimi w stronę obiektywu

• kompensacyjne (K)

• peryplanatyczne

• typy kondensorów

• chromatyczne - bez korekcji, o aperturze 1,2-1,4

• aplanatyczne - z korekcją sferyczną, o aperturze 1,4

• achromatyczne - z korekcją aberracji chromatycznej i sferycznej, o aperturze 1,4

1. mikroskop z ciemnym polem widzenia

2. mikroskop kontrastowo-fazowy

3. mikroskop ultrafioletowy

4. mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny)

5. mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny

6. transmisyjny mikroskop elektronowy

7. mikroskop skaningowy

• BARWIENIE DROBNOUSTROJÓW

1. Barwniki

Barwniki to związki chemiczne zdolne do adsorpcji na lub rozpuszczania się w barwionych substancjach, dając trwałe, barwne połączenia. W ich cząsteczkach wyróżniamy grupę barwną, chromoforową (azo-, nitrozo-, azoksy-, tiokarbonylową) oraz auksochromową, zdolną do tworzenia soli z barwionym substratem (grupy -NH₂, -OH). Zwykle używa się barwników zasadowych w roztworach alkoholach lub wodnych. Barwników kwaśnych używa się do barwienia tła. Często stosuje się zaprawy (fenol, jod) ułatwiające zatrzymywanie w komórce.

Barwienie leży u podstaw takich reakcji jak:

• tworzenie soli

• powstawanie wiązań kowalencyjnych

• wiązanie siłami Van der Waalsa

1. metody barwienia

• barwienie pozytywne - barwienie drobnoustrojów w preparacie; do obserwacji bakterii, drożdży i grzybów strzępkowych

• barwienie negatywne - barwienie otoczenia w preparacie; do obserwacji krętków i otoczek bakterii

• barwienie proste - barwienie przy użyciu jednego barwnika np. błękitu metylenowego lub fuksyny, barwienie drożdży fioletem metylenowym, barwienie barwnikiem Giemsy - riketsje na czerwono, krętki na fioletowo lub różowo, wybarwia też nukleoid i jąderko

• barwienie złożone - barwienie kilkoma barwnikami w odpowiedniej kolejności lub mieszaniną barwników

• metoda Grama:

• barwienie roztworem fioletu krystalicznego (2-3 minuty)

• utrwalenie płynem Lugola (1,5-2 minuty)

• odbarwienie metanolem (90% etanolu z acetonem, 30 s)

• dobarwienie barwnikiem kontrastowym (np. fuksyną karbolową lub sfraniną, 20 s)

Drobnoustroje zatrzymujące fiolet krystaliczny nazywa się Gram-dodatnimi, a zatrzymujące barwnik kontrastowy - Gram-ujemnymi. Wynik barwienia zależy od budowy ściany komórkowej.

• metoda Neissera - metoda pozwalająca wykryć polifosforany w komórkach maczugowców (Corynebacterium). Metoda polega na barwieniu barwnikiem Neissera (fioletem krystalicznym z błękitem metylenowym w alkoholu) i dobarwianiu roztworem chryzoidyny, która wypierając barwnik główny tworzy żółte zabarwienie wtrętów.

• metoda Ziehl-Neelsena - metoda uwidaczniania cech kwasooporności u prątków (Mycobacteriales) i niektórych promieniowców (Actinomycetales) oraz przetrwalników laseczek tlenowych i beztlenowych. Prątniki i promieniowce zawierają w ścianie komórkowej kwas mykolowy. Jego obecność można ujawnić za pomocą barwienia na gorąco roztworem fuksyny karbolowej (nie można jej usunąć etanolem z HCl). Następnie dobarwia się preparat błękitem metylenowym (prątki są wtedy czerwone na niebieskim tle)

• barwienie przyżyciowe - barwienie w dużym rozcieńczeniu, np. barwienie drożdży, grzybów nitkowatych i promieniowców błękitem metylenowym w rozcieńczeniu 1:10000

• BUDOWA ŚCIANY BAKTERII GRAM-DODATNICH I GRAM-UJEMNYCH

1. bakterie Gram-dodatnie

• warstwa sztywna - gruba warstwa peptydoglikanu

• warstwa plastyczna

• kwasy teichojowe - polimery fosforanu glicerolu lub fosforanu rybitolu podstawione resztami aminokwasów (D-Ala) i zawierające boczne łańcuchy mono- lub polisacharydowe. Kwasy teichojowe nadają komórce ładunek ujemny, zawierają 35-40 podjednostek, co stanowi ok. 50% suchej masy komórki. Kwasy te łączą się „odcinkiem kotwiczącym” z kwasem muraminowym.

Funkcje:

• nadają swoistość immunologiczną

• wykazują zdolność do modulacji odpowiedzi immunologicznej

• wywołują poliklonalną aktywację limfocytów B, aktywują makrofagi

• służą jako receptory dla fagów

• kwasy teichuronowe - występują u niektórych bakterii razem z kwasami teichojowymi lub występują wyłącznie. Są to polimery kwasu uronowego i innego cukru.

• kwasy lipoteichojowe - występują osobno lub z kwasami teichojowymi. Przechodzą przez ścianę komórkową i kotwiczą się w błonie. Zbudowane są głównie z fosforanu glicerolu podstawionego kwasami tłuszczowymi lub innymi podstawnikami.

Funcke:

• mogą stanowić główny antygen powierzchniowy

• biorą udział w wymianie jonowej

• aktywują dopełniacz, monocyty i makrofagi, pobudzają mitogenezę limfocytów

• pośredniczą w adhezji do komórek eukariotycznych

• białka:

• białko A - znajduje się częściowo w ścianie, a częściowo wystaje na zewnątrz. Może łączyć się z fragmentem Fc przeciwciał IgG

• białko M - kotwiczy się w cytoplazmie i przenika przez ścianę na zewnątrz. Umożliwia utrzymanie się Streptococcus pyogynes w organizmie zakażonym

• białko G - występuje u Streptococcus pyogynes; wiąże przeciwciała IgG

• bakterie Gram-ujemne

• błona zewnętrzna (OM) - stanowi barierę przepuszczalności dla związków hydrofobowych

• lipopolisacharyd (LPS) - najważniejszy składnik błony zewnętrznej. Odpowiada endotoksynie. Jest immunogenny.

• część O-swoista - jednostki oligosacharydowe determinujące swoistość antygenową LPS form gładkich bakterii. Może być receptorem dla fagów. Chroni bakterie przed ciłami układu immunologicznego

• rdzeń - determinuje swoistość serologiczną mutantów R lub form szorstkich, a region wewnętrzny warunkuje swoistość wspólną dla LPS większości bakterii Gram-ujemnych. Region Kdo stanowi łącznik z lipidem A

• lipid A - stanowi centrum aktywności biologicznej endotoksyny. Wywołuje efekt pirogenny (wzrost temperatury), stan zapalny, leukopenię z leukocytozą, hipoglikemię, wewnątrznaczyniowe wykrzepianie oraz szok septyczny prowadzący do zapaści i zgonu. Jest somnogenem (zaburza sen), indukuje także wydzielanie mediatorów komórkowych.

• fosfolipidy - tworzą zrąb; występują głównie w głębszej warstwie. Występuje fosfatydyloglicerol, kardiolipina, fosfatydyloetanoloamina

• białka - podzielono je na białka główne i poboczne, ale lepszy podział stanowią:

• białka strukturalne (matrycowe) - występują w całej objętości błony

• białko OmpA

• lipoproteina Brauna - tworzy kanał

• lipoproteina PAL

• białka funkcjonalne - związane z transportem

• poryny ogólnej dyfuzji

• białka OmpF - wytwarzane w środowisku bogatym w cAMP

• białka OmpC - wytwarzane w środowisku ubogim w cAMP

• poryny swoiste - powstanie indukowane obecnością odpowiedniego substratu

• LamB - przenoszenie maltozy i maltozodekstryn

• Tsx - przenoszenie nukleozydów

• Przenoszenie fosforanów

• Inne

• białko BtuB - u E. coli przenosi witaminę B₁₂

• siderofory - przenoszą żelazo

• enzymy

• antygen wspólny Kunina (ECA) - przypomina budową LPS. Może występować w formie wolnej, związanej z LPS i cyklicznej. Prawdopodobnie wiąże Ca²⁺ i może mieć udział w patogenezie.

• warstwa sztywna - 1-3 warstw peptydoglikanu

• warstwa plastyczna - znacznie grubsza niż u bakterii Gram-dodatnich

• przestrzeń peryplazmatyczna - znajduje się między błoną komórkową (wewnętrzną), a błoną zewnętrzną i zawiera ścianę mureinową. Może się łączyć z błoną zewnętrzna w tzw. złączach Beyera za pośrednictwem mureiny.

• Oligosacharydy błonopochodne (MDO) - stanowią barierę ochronną w przypadku zmian ciśnienia osmotycznego.

• białka

• białka unieczynniające antybiotyki β-laktamowe (penicylina) i aminoglikozydowe (streptomycyna)

• enzymy degradujące polimery o znaczeniu biologicznym (amylaza, nukleazy)

• białka wiążące (BP) aminokwasy, cukry, peptydy, witaminy, jony

7. MORFOLOGIA MIKROSKOPOWA

Wyróżniamy następujące kształty bakterii

1. kuliste

• forma pojedyncza - Micrococcus

• forma podwójna - Diplococcus (dwoinka) (np. Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis)

• forma poczwórna - Tetracoccus (czwórniak)

• paciorkowce - Streptococcus (np. Streptococcus pneumoniae)

• gronkowce - Staphylococcus (np. Staphylococcus aureus)

• pakietowce - Sarcina

2. cylindryczne

• pałeczki - Bacterium (np. Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Listeria mocytogenes)

• laseczki - Bacillus (B. subtilis, B. cereus, B. anthracis, Clostridium botulinum, C. tetani, C. perfringens, C. sporogenes) - laseczki wytwarzają endospory

• maczugowce - Corynebacterium (C. dyphteriae)

• wrzecionowce - Fusobacterium

• prątki - Mycobacterium (M. tuberculosis, M. leprae)

3. spiralne

• przecinkowce - Vibrio (V. cholerae)

• śrubowce - Spirillum (Rhodospirillum rubrum)

• krętki - Spirochetae - Borellia, Treponema (T. pallidium), Leptospira

• bakterie nitkowate - Chlamydobacteriales

• bakterie stylikowate - Caulobacteriales

• bakterie z wyrostkami - Hyphomicrobium

• bakterie pączkujące i tworzące wyrostki - Rhodomicrobium vannielii




Typ mikroskopu	Budowa	Zasada działania	powiększenie	Zdolność rozdzielcza	Zastosowanie
lupa	Posiada soczewkę skupiającą o krótkiej ogniskowej	Zwiększa tzw. kąta widzenia (kąta pod którym do oka wpadają promienie biegnące od skrajnych miejsc przedmiotu)	200-300x		Do oglądania małych przedmiotów
mikroskop świetlny złożony	System optyczny: obiektyw - ma krótką ogniskową i tworzy obraz powiększony, rzeczywisty, odwrócony okular - ma krótką ogniskową i tworzy obraz powiększony, pozorny, odwrócony. Rewolwer - pierścień z obiektywami Tubus - zwykle ruchomy element znajdujący się między okularem a obiektywem Statyw Stolik - płaski ruchomy element na którym umieszczony jest preparat. Można go podnosić lub opuszczać za pomocą dwóch śrub (mikro- i makrometrycznej) Źródło światła - zwierciadło lub lampka. Zwierciadło płaskie stosuje się w mikroskopach z kondensorem i światłem sztucznym, a wklęsłe, gdy stosuje się światło dzienne bez kondensora lub z kondensorem ale przy powiększeniach do 10x Kondensor - układ soczewek pozwalający oświetlić badany preparat wiązką promieni równoległych o aperturze odpowiadającej aperturze zastosowanego okularu	Powiększanie obrazu za pomocą systemu soczewek okularu i obiektywu	500-1500x	0,3-0,17 μm	Do oglądania mikro-organizmów
mikroskop z ciemnym polem widzenia	Posiada tzw. kondensor ciemnego pola posiada on przesłonę uniemożliwiającą bezpośrednie oświetlenie preparatu. a jedyne światło jakie dociera do obiektywu to promienie odchylone od pierwotnego przebiegu promieni równoległych. Stosuje się immersję między kondensorem i preparatem	Promienie załamane na przesłonie oświetlają preparat w taki sposób, że obserwowany obiekt jest jaśniejszy od otoczenia.	Podobna jak w mikroskopie świetlnym		Do oglądania żywych bakterii
mikroskop kontrastowo-fazowy	Kondensor zawiera tzw. płytki fazowe składające się z dwóch szklanych pierścieni, pomiędzy którymi umieszcza się trzeci krążek o grubości kilku μm i o takim współczynniku załamania światła, aby różnica faz pomiędzy światłem przechodzącym przez krążek, a promieniami przechodzącymi przez pozostałe pierścienie wynosiła 90° (1/4 dłg. fali)	Przekształca obiekty fazowe w amplitudowe poprzez odpowiednie zwiększenie różnicy faz		0,05 μm	Do oglądania żywych bakterii
mikroskop ultrafioletowy	System optyczny zbudowany ze szkła kwarcowego przepuszczającego promienie UV, a jako źródła światła - lampy rtęciowo-kwarcowe	Użycie światła o mniejszej długości fali pozwala na uzyskanie większej zdolności rozdzielczej		0,1 μm
mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny)	Mikroskop UV.	Wywołuje świecenie niektórych cząsteczek występujących naturalnie w organizmach (fluorescencja naturalna) lub organizmów wybarwionych fluorochromami np. erytrozyną czy rodaminą			W serologii
mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny	Posiada polaryzator, pryzmat dwójłomny i analizator.	Polaryzator umieszczony pod kondensorem polaryzuje światło, pryzmat znajdujący się za obiektywem rozdwaja wiązkę światła na dwie (zwyczajną i nadzwyczajną) oraz powoduje przesunięcie fazowe między wiązkami. Fale interferują ze sobą i w wyniku ich nakładania powstaje obraz interferencyjny sprawiający wrażenie przestrzennego.		0,1 μm	Do oglądania obiektów fazowych i amplitudowych
transmisyjny mikroskop elektronowy	Wiązka światła jest zastąpiona strumieniem elektronów emitowanych przez działo elektronowe. Zamiast układu optycznego natomiast posiada trzy elektromagnesy. Zamiast szkiełek podstawowych stosuje się siatki platynowe, miedziane, niklowe lub błonki koloidalne. Obraz jest przekazywany na ekran lub kliszę fotograficzną.	Szybko przemieszczające się w próżni elektrony o właściwości fali dłg. 1Å uginają się po przejściu przez preparat o bardzo małej grubości i są zbierane przez system „soczewek magnetycznych”	Kilkanaście tys. do milionów razy	4-10 Å (1 Å = 1x10^-10 m)	Do oglądania ultrastruktury komórek
mikroskop skaningowy	Typ mikroskopu elektronowego, w którym strumień elektronów nie przechodzi przez preparat ale ulega odbiciu od jego powieżchni.	rejestrowany jest potencjał lub prąd pomiędzy próbką a sondą skanującą - punkt po punkcie dla całej próbki:	15 000 - 50 000x	0,02 μm




1

---