S by
MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA - WYKŁADY
WYKŁAD 1
Mikrobiologia przemysłowa dotyczy możliwości wykorzystania drobnoustrojów do procesów przemysłowych. Dziedzina ta zajmuje się wykrywaniem, badaniem i dostosowaniem do przemysłowego wykorzystania metabolicznych procesów, właściwości drobnoustrojów. Związana z biotechnologią ( przemysł chemiczny, farmaceutyczny, kosmetyczny).
W mikrobiologii jednostką podstawową jest szczep - czyli populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku lub odmiany, wyróżniająca się określonymi cechami. Szczepy to różne klony wyprowadzone z poszczególnych czystych kultur, izolowanych niezależnie od siebie. Szczepy grupowane są w gatunki, gatunki w rodzaje, rodzaje w rodziny.
Kolonia bakteryjna - widoczne gołym okiem skupisko wielu komórek, powstałych w wyniku podziału jednej komórki bakteryjnej. W celu uzyskania pojedynczych kolonii stosuje się różne metody posiewów. W przypadku zliczania kolonii na podłożu stałym nie zlicza się z pojedynczych komórek, tylko z jednostek tworzenia kolonii. Grzyby podajemy z propagulach (ilościach przypadających na jednostkę podłoża).
Hodowlę uzyskaną z pojedynczej komórki bakteryjnej określamy jako czystą kulturę lub populację jednogatunkową. Mieszaninę różnych gatunków lub zanieczyszczoną nazywamy kulturą mieszaną lub populacją wielogatunkową.
Podłoża hodowlane:
Stosuję się do:
- izolacji
- namnażania (w celu otrzymania biomasy czy produktów metabolizmu mikroorganizmów)
- identyfikacji
- poznania cech morfologicznych i typu wzrostu
- określenia fizjologii
Stosujemy takie podłoża z pożywkami, które zapewni wyselekcjonowanym szczepom mikroorganizmów maksymalną ekspresję fenotypową określonej cechy.
Cechy podłoża mikrobiologicznego:
- zawartość wody >30%
- zawartość łatwo dostępnych, podstawowych źródeł węgla, azotu i energii
- zawartość soli mineralnych, będących źródłem takich pierwiastków jak P, S, Mg, Na, K, Fe, Zn, Ca, Cu, Mn, Co
- odpowiedni odczyn (dla bakterii pH 7,2-7,4, dla grzybów 4-6, i odpowiednia wartość ciśnienia osmotycznego)
- sterylność w miarę możliwości, zwłaszcza w przypadku podłoży płynnych, klarowność
Auksotrofy - są to mutanty, które utraciły skł. pokarmowe lub nie mogą go pobrać ze środowiska, dlatego stosuje się odpowiednie podłoże - wzbogacone. Rodotrofy - przeciwieństwo autotrofów.
Podział podłoży mikrobiologicznych:
ze względu na zawartość składników odżywczych
- minimalne
- pełne
-wzbogacone
b) ze względu na skład chemiczny
- naturalne (bulion, brzeczka, mleko)
- syntetyczne
- półsyntetyczne
c) ze względu na cel hodowli
- namnażające
- izolacyjne
- selektywne (reagujące na np. antybiotyki)
- różnicujące (cechujące się określoną cechą)
d) ze względu na konsystencję
- płynne
- półpłynne
- stałe
Płyny do rozcieńczeń - sterylne, izotoniczne roztwory o ciśnieniu osmotycznym odpowiadającym ciśnieniu wewnątrzkomórkowemu.
- sól fizjologiczna - 0.85 % r-r NaCl
- 0.1% woda peptonowa
- płyn Ringera (0.225% NaCl, 0.105% KCl, 0.012%CaCl2, 0.005%NaHCO3)
Dezynfekcja - proces zabicia wszystkich form wegetatywnych mikroorganizmów chorobotwórczych i niechorobotwórczych za pomocą metod fizycznych, chemicznych. Proces ten nie zapewnia całkowitej jałowości, gdyż pozostają aktywne formy przetrwalne bakterii)
Sterylizacja (wyjaławianie) - w ujęciu mikrobiologicznym to proces polegający na eliminacji wszystkich mikroorganizmów niezależnie od stadium rozwoju, zarówno form przetrwalnych jak i wegetatywnych. Przeprowadza się przy użyciu metod fizycznych, mechanicznych, chemicznych. Lepiej sterylizuje 40% r-r alkoholu niż 95% spirol, bo woda zwiększa adhezję do komórek bakterii.
Biostatyczność - hamowanie rozwoju wzrostu i rozmnażanie drobnoustrojów. Po przeniesieniu mikroorganizmów do środowiska pozbawionego środka dezynfekcyjnego lub po ustaniu jego działania. Mikroorganizmy odzyskują możliwość wzrostu, rozwoju i rozmnażania.
Biobójczość - wywołanie efektu letalnego ( śmiertelnego) po zastosowaniu danej substancji lub czynnika.
Metody fizyczne
termiczne
- czas śmierci cieplnej - czas potrzebny do zabicia wszystkich drobnoustrojów tego samego gatunku przy określonej temperaturze i składzie pożywki
- punkt śmierci cieplnej - temperatura, która zabija hodowlę bakterii w ciągu 10 minut (dla danego jednego gatunku)
a) zastosowanie wysokich temperatur na sucho
- wyżarzanie i opalanie
- sterylizacja gorącym, suchym powietrzem, temp 160 - 180
b) zastosowanie wysokich temperatur na mokro
- gotowanie
- sterylizacja gorącą bieżącą parą wodną
- pasteryzacja - długotrwała (temp 62-65 / 20 -30 min) LTLT (low temperature long time), krótkotrwała (temp. 72 / 15 sek.) HTST, momentalna (temp. 85-90 / 1-2 s.)
- tyndalizacja (pasteryzacja frakcjonowana) trzykrotna pasteryzacja przeprowadzana w odstępach co 24 godziny w aparacie Kocha
c) sterylizacja gorącą parą wodną pod ciśnieniem - sterylizacja w autoklawie. Proces zachodzi w określonym czasie, temperaturze i przy odpowiednim ciśnieniu dla uzyskania właściwego efektu sterylizacji
Pomiędzy ciśnieniem a temparaturą wewnątrz autoklawu a także pomiędzy temperaturą a efektem sterylizacji istnieje ścisła zależność przy nadciśnieniu
atm - temp w autoklawie 100 st.
0.5 atm - temp 111.7 - 112
1.0 atm - temp 120.6- 121 - stosowana w praktyce
2.0 atm - temp 133.9 - 134
Stosując dla poszczególnych temperatur zmienny parametr czasu ekspozycji, uzyskuje się podobne efekty
121 st przez 2 min
110 st - 20 min
100 st - 200 min
Im wyższe ciśnienie wewnątrz kotła tym wyższe są temperatury, a im wyższe temperatury tym krótszy okres sterylizacji. Stosując wyższe ciśnienie uzyskuje się możliwość zniszczenia zarówno form wegetatywnych jak i przetrwalnych.
Niektóre termowrażliwe produkty płynne poddaje się sterylizacji błyskawicznej (UHT) w systemie przepływowym lub poprzez wtrysk pary wodnej o temp. 135-150 st. w czasie 2 - 9 s. Procedura ta niszczy formy wegetatywne i przetrwalne w stopniu zapewniającym trwałość handlową produktu.
Promieniowanie UV, X, GAMMA
a) UV - Zabójcze lub hamujące działanie na mikroorgranizmy ma nadfioletową część widma słonecznego o długości 250 260 nm. Ta część widma jest najsilniej absorbowana przez kwasy nukleinowe i powoduje tworzenie się dimerów tyminowych w DNA (działanie mutagenne).
UV działa biobójczo zarówno na formy wegetatywne jak i przetrwalne drobnoustrojów. Najbardziej wrażliwe są wegetatywne formy mikroorganizmów z logarytmicznej fazy wzrostu.
Pod wpływem UV następuje:
- denaturacja lub rozerwanie łańcucha DNA
- hydratacja cytozyny
- dimeryzacja tyminy, cytozyny lub cytozyny z tyminą
- tworzenie wiązań między DNA i białkami
Oporność drobnoustrojów na działanie UV charakteryzowana jest na podstawie dawki naświetlenia D:
D=E*t D- dawka naświetlenia UV [mj/cm2], E - natężenie światła UV [mW/cm2], t -czas[s]
Stosowane w laboratoriach lampy UV są lampami kwarcowymi, wypełnionymi oparami rtęci, emitującymi w 95% promieniowanie o długości 258nm. Promieniowanie UV charakteryzuje się słabą przenikliwością wobec czego może być wykorzystywana tylko w niszczeniu mikroorganizmów:
- występujących w powietrzu pomieszczeń
- na odkrytych powierzchniach w pomieszczeniach zamkniętych
W obu przypadkach zapylenie musi być nieznaczne.
Sterylizacja promieniami UV stosowana jest w komorach laminarnych, salach operacyjnych, szpitalnych, laboratoriach mikrobiologicznych, a także znalazła zastosowanie w procesach uzdatniania wody
Efekt biobójczy promieniowania zależy od:
- objętości napromieniowanego powietrza
- wielkości powierzchni
- odległości i ustawienia lamp UV
- czasu emisji napromieniowania (nie powinien on być krótszy niż 30 min)
- odległości lampy od sterylizowanej powierzchni (nie może przekraczać 3 m)
- ustawienia lamp względem sterylizowanej powierzchni (prostopadle do powierzchni)
b) promieniowanie jonizujące (X, GAMMA)
Promieniowanie to charakteryzuje się bardzo dużą przenikliwością (większą od UV), energią i aktywnością biologiczną.
Mechanizm bezpośredniego niszczenia drobnoustrojów promieniami gamma polega na wyzwalaniu energii kinetycznej, która powoduje ubytki, pęknięcia, przestawienia całych odcinków kwasów nukleinowych lub jest przyczyną błędnego podstawiania zasad.
Działanie pośrednie polega na biobójczym działaniu promieni poprzez hydrolizę(radiolizę?) wody, jak H2O2(H20?) i wolne rodniki (H) i (OH), które inaktywują enzymy oddechowe, fermentacyjne oraz syntezę białek.
Zastosowanie promieniowania gamma w sterylizacji:
- sprzętu medycznego jednorazowego użytku
- surowców i preparatów farmaceutycznych
- utrwalania produktów spożywczych (świeżych i suszonych owoców i warzyw, mięs, przypraw i ziół, a zwłaszcza do niszczenia mikroorganizmów w zamkniętych pojemnikach, np. konserwach).
WYKŁAD 2
II Metody mechaniczne
1. Filtrowanie
Zasada metody - filtracja poprzez sterylne filtry o porach od 0.2 - 0.4 (0.75) um. Pory są mniejsze od wymiarów bakterii, odfiltrowane drobnoustroje pozostają na filtrze, a uzyskany filtrat jest jałowy.
Stosowane filtry:
- z ziemi okrzemkowej
- ze szkła spiekanego
- azbestowe
- membranowe
Zastosowanie: sterylizacja materiałów ulegającym w podwyższonej temperaturze zmianom fizycznym i chemicznym (np. pożywki zawierające witaminy, aminokwasy, surowicę, mocznik, składniki termoabilne).
2. Wirowanie - oddzielenie komórek mikroorganizmów od zawiesiny, służą do tego wirówki z regulacją obrotów i czasu wirowania.
III Metody chemiczne
Chemiczne środki dezynfekujące stosowane są do dezynfekcji
- podłóg, ścian i powierzchni roboczych
- linii technologicznych
- maszyn lub ich części
- skóry i odzieży ochronnej
Różnią się one aktywnością biologiczną i mechanizmami działania.
Aktywność biologiczna a co za tym idzie, skuteczność działania środków dezynfekcyjnych zależy od:
-rodzaju związku chemicznego
- stężenia i czasu działania dezynfektora
- rodzaju mikroorganizmów
- wieku i liczebności populacji
- czynników środowiskowych (temperatura, kwasowość podłoża i obecności w nim innych związków chemicznych, zwłaszcza organicznych).
Cechy dobrego środka dezynfekcyjnego:
- dobra skuteczność bójcza
- brak wzbudzania mechanizmów oporności u mikroorganizmów
- doskonała zdolność zwilżania powierzchni
- szybkie działanie i małe stężenie użytkowe
- stabilność w postaci rozwtorów roboczych
- brak toksyczności w stosunku do ludzi i zwierząt
- brak właściwości niszczących dezynfekowane powierzchnie
- wysoki stopień biodegradacji
- korzystne aspekty ekonomiczne
Mechanizmy działanie środków dezynfekujących zależą od struktury i właściwości chemicznych substancji aktywnej (biologicznie czynnej) preparatu.
Zastosowanie dezynfekatora może powodować:
- biostatyczność - zahamowanie wzrostu i rozwoju mikroorganizmów
- biobójczość - zabicie mikroorganizmów w wyniku działania na struktury bądź szlaki metaboliczne
Działanie biobójcze może polegać na:
- uszkadzaniu lub zmianie przepuszczalności ściany komórkowej i błony cytoplazmatycznej
- utlenianiu struktur komórkowych i zakłóceniu procesów metabolicznych
- tworzeniu kompleksów z białkami - blokowanie grup funkcyjnych ( -NH2, -SH, -COOH)
- dezaktywacji enzymów
- koagulacji cytoplazmy i denaturacji białek (cytoplazmatycznych, enzymatycznych), kwasów nukleinowych.
Etapy działania środka dezynfekcyjnego:
- Adsorpcja środka dezynfekującego na powierzchni komórki
- Zmiana ujemnego ładunku elektrostatycznego komórki i jej ruchliwości w polu elektrycznym
- Zmiany przepuszczalności błony cytoplazmatycznej
- Uwalnianie z komórki i wydalanie do podłoża składników błony cytoplazmatycznej (puryn, pirymidyn, pentoz, fosforanów, niektórych jonów) ---> ŚMIERĆ
- Dyfuzja preparatów dezynfekcyjnych do wnętrza komórki
uszkodzenie enzymów błonowych
zakłócenie prac oddechowych i metabolizmu sacharydów
przy wysokim stężeniu środka kolejną fazą jest koagulacja cytoplazmy - denaturacja protoplazmatycznych i enzymatycznych białek oraz kwasów nukleinowych ---> ŚMIERĆ
Oporność drobnoustrojów na działanie środków dezynfekcyjnych
Narastanie oporności wobec środków dezynfekcyjnych jest większe u G- pałeczek, u bakterii G+ proces ten jest znacznie wolniejszy. Podstawową przyczyną narastania oporności drobnoustrojów są błędy popełnione w technice dezynfekcji.
Mechanizmy powstawania oporności
Jeden szczep bakteryjny może posiadać kilka odrębnych mechanizmów oporności.
Formy oporne mogą powstawać w wyniku:
- samoistnej mutacji
- fenotypowej adaptacji
Oporność drobnoustrojów uwarunkowana genetycznie polega na uruchomieniu odpowiednich mechanizmów biochemicznych odpowiadających za:
- zmiany w podjednostkach robosomów
- zmniejszenie lub wyeliminowanie możliwości łączenia się preparatów z komórką
- biosyntezę enzymów hydrolizujących lub inaktywujących dany związek
- zmniejszenie przepuszczalności ściany komórkowej i błony cytoplazmatycznej
- zmiana szlaku metabolicznego
W procesach biotechnologicznych szczególnie niebezpieczne jest:
- oporność nabyta, niedziedziczona, ujawniająca się w wyniku naturalnej selekcji i adaptacji podczas ekspozycji szczepów na niskie stężenia dezynfekatoróe
- oporność nabyta, dziedziczona, będąca efektem mutacji lub pobrania od opornych bakterii fragmentu DNA kodującego cechę oporności nawet na kilka związków, przenoszony materiał genetyczny może być pochodzenia chromosomowego
- oporność chromosomalna lub cytoplazmatyczna (tzw. oporność pozachromosomowa, kodowana przez geny zlokalizowane na plazmidach)
Ważniejsze grupy związków stosowane w dezynfekcji:
1. Fenol i pochodne
- preparaty w których substancje aktywne to krezole, ksylofenole, bifenole
- dobra aktywność przeciwbakteryjna, znikomy wpływ na przetrwalniki bakteryjne i zarodniki grzybów ( denaturacja białek, ścian i błon komórkowych)
- max biobójczość w środowisku kwaśnym
- toksyczne i słabo biodegradowalne - coraz rzadziej stosowane
2. Czwartorzędowe sole amonowe (QAC - pochodne pirydyny)
- kationowe związki powierzchniowo czynne, obniżają napięcie powierzchniowe, wykazują dobrą zwilżalność, wysoką trwałość preparatu stężonego i roztworu roboczego (np. sterinol, laurosept)
- szerokie spektrum, silne działanie (bakterie G+, G-, pleśnie, drożdże, wirusy), długotrwały efekt
- mechanizm działania - zmiana przepuszczalności ściany i błony komórkowej
- biobójczość osłabia obecność w środowisku zanieczyszczeń (białka, tłuszcze, mydła, detergenty)
3. Związki chloru
- najczęściej stosowany jest podchloryn sodu (oksochloran sodu NaOCl) którego aktywność zależy od równowagi w roztworze pomiędzy HClO/OCl-
- najsilniejsze działanie w środowisku kwaśnym (pH 5-6)
- w zetknięciu z komórkami drobnoustrojów wydziela się zjonizowany tlen, który denaturuje białka, niszczy, błonę cytoplazmatyczną oraz inaktywuje enzymy z grupami -SH
- biobójcze działanie w stosunku do bakterii, drożdży, grzybów i wirusów, niszczy również formy przetrwalnikowe
4. Związki nadtlenowe
- kwas nadoctowy i nadtlenek wodoru, nadsiarczan potasowy, nadmanganian potasu, ozon
- aktywne w stosunku do form wegetatywnych i przetrwalnych bakterii
- komórki drobnoustrojów nie wytwarzają oporności na tę grupę związków
- uszkodzenie błony biologicznej, powstający rodnik tlenowy jako element silnie reaktywny reaguje m.in. z kwasami nukleinowymi, białkami.
5. Alkohole (etanol, izopropanol)
-szerokie działanie bakteriobójcze w stosunku do form wegetatywnych G+ i G-
- biobójczość polega na denaturacji białek i jest uwarunkowana obecnością wody (najsilniejsze działanie 50-70 % r-r wodny, który ułatwia penetrację alkoholu do komórki
- obecność zanieczyszczeń organicznych obniża skuteczność działania
6. Jodofory
- kompleksowe połączenia jodu z polimerami, biopolimerami lub związkami powierzchniowo czynnymi, pełniącymi rolę nośników
- uwalniany jod utlenia grupy -SH oraz tworzy kompleksy z białkami błony cytoplazmatycznej
- max aktywność pH 2-4
- szerokie spektrum biobójcze
7. Aldehydy
- aldehyd mrówkowy, glutarowy, formalina - denaturacja białek
REAKCJA: .....
- znaczna toksyczność (zakaz kontaktu z żywnością)
- wysoka biobójczość w stosunku do form wegetatywnych i przetrwalnych bakterii G+, G-, grzybów, wirusów
- aktywność pH 7.5 - 8.5
8. Sole metali ciężkich
- biobójcze działanie wykazują głownie związki metaloorganiczne, tworzą połączenia z grupami -SH białek, działają na formy wegetatywne bakterii
- sole srebra (azotany, cytryniany, mleczany) tworzą połączenia z grupami SH enzymów i białek strukturalnych komórki
9. Barwniki organiczne
- łagodne antyseptyki jako związki a charakterze zasadowym łatwo przenikają przez błonę cytoplazmatyczną
- barwniki trifenylometanowe (fiolet krystaliczny, zieleń malachitowa, brylantowa) niszczą bakterie G+, a 10 - krotnie wyższe stężenie również bakterie G-, reagują z kwasami nukleinowymi powodując śmierć komórki
- barwniki akrydynowe - hamują syntezę DNA, co zapewnia szerokie spektrum działania
10. Tlenek etylenu
- gaz o działaniu alkilującym bakterio- i wirusobójczy, niszczy również przetrwalniki
- do sterylizacji używa się czystego tlenku etylenu lub w mieszaninie z CO2 (1:9)
- sterylizacja prowadzona jest w komorach gazoszczelnych w temperaturze 30 - 65 st., przy względnej wilgotności 40 - 60 %, przy stężeniu gazu do 1200 mg/l
- zaletą tego gazu jest duża przenikalność, również przez tworzywa sztuczne, ze względu na możliwość sorpcji gazu przez wyjaławiany materiał, konieczny jest okres tzw. resorpcji
- wyjaławianie materiałów i sprzętu medycznego, wykonanych z tworzyw sztucznych
Określanie siły działania środków dezynfekcyjnych: Ocena taka wymaga określenia
- działania biostatycznego
- działania biobójczego
- działania użytkowego
WYKŁAD 3
Ustalenie stężenia użytkowego
Jest to takie stężenie ośrodka, które użyte w praktyce spowoduje zniszczenie mikroorganizmów. Jeżeli wyniki te są odmienne dla różnych szczepów, za stężenie użytkowe przyjmuje się największe rozcieńczenie działające jeszcze bakteriobójczo na najbardziej oporny szczep użyty do badania
OBRAZKI
Ocena skuteczności dezynfekcji (jałowienia)
a) Metoda fizykochemiczna
- ekspozycja specjalnie spreparowanej taśmy na określoną temperaturę (121 st.) przez określony czas (15 min) powoduje jałowienie się napisu AUTOCLAVE co potwierdza prawidłowość warunków procesu sterylizacji (odp. temp. i ciśnienie)
b) Metody biologiczne - wykorzystanie przetrwalników Bacillus lub Clostridium
Sporal A - wyjaławianie w gorącej parze wodnej pod ciśnieniem, w temp. min 121 st. przez 20 min
Sporal C - wyjaławianie suchym gorącym powietrzem w 160 st. przez 2 h lub 150 st. przez 2 h 54 min, 140 st. przez 3 h
c) Metody posiewów - wysiew wysterylizowanej próbki na podłoże hodowlane
d) Metoda termostatowa - umieszczenie wyjałowionych prób w temp. 37 st. przez 1-10 dni
e) Kontrola przepuszczalności filtrów, mechaniczne jałowienie przez filtry przepuszcza się szczep bakterii.
Źródła zakażeń w przemyśle:
- zakażenia pierwotme - spoza zakładu przemysłowego
1. surowce
2. woda
3. powietrze
- zakażenie wtórne - wewnątrzzakładowe
1. sprzęt technologiczny, aparatura, materiały filtracyjne
2. powietrze w pomieszczeniach produkcyjnych
3. Odzież i obuwie pracowników
4. Brudne ręce pracowników
5. Brak masek ochronnych
6. nosicielstwo chorób itp.
50-70% najlepsze stężenie alkoholu do sterylizacji, denaturacja białek, rozpuszczanie lipidów, fenole używa się rzadko bo są toksyczne
Analiza jakościowa mikroorganizmów
I Metoda bezpośrednia - mikroskop
II Metody pośrednie - hodowlane, wagowe, optyczne
I - opierają się na bezpośrednim liczeniu mikroorganizmów w preparacie mikroskopowym. Różnice pomiędzy metodami wynikają z rożnic w przyp. preparatów
1. Liczenie przy użyciu komór - komory Burkera, Hovarda i Thoma pozwalają na obserwacje tylko dużych komórek takich jak drożdże, zarodniki grzybów i strzępki grzybów.
Liczba drobnoustrojów w 1 ml:
L=4*106 * n * a
n - rozcieńczenie zawiesiny drobnoustrojów
a - średnia zawartość komórek w polu
Komora Burkera
L=2,5 * 105*n*a
2. Liczenie drobnoustrojów w preparacie przeżyciowym (bezpośrednim)
L=(100/Pi*r2 * h) *n*a
r - promień pola widzenia
n - grubość warstwy cieczy między szkiełkami [0.01mm]
Liczenie przeprowadzić w 3 preparatach zliczając w każdym po 20 pól.
3. Liczenie metoda Breeda w preparacie barwionym - zasada tej metody polega na wykonaniu równomiernego rozmazu określonej objętości hodowli, pobranej kalibrowaną pipetą Breeda (0.01ml) na znanej powierzchni odtłuszczonego szkiełka podstawowego, wysuszeniu, utrwaleniu i wybarwieniu preparatu.
Liczba drobnoustrojów
L= (A/Pi*r2 ) *a *x
A - pole rozmazu, a - średnia zawartość komórek w polu widzenia, x - 100, przelicznik pipety Breeda, r - promień pola widzenia wyznaczany mikrometrem obiektowym
Liczenie przeprowadzić w 3 preparatach zliczając w każdym po 20 pól.
4. Metoda DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)
Metoda oparta o mikroskopie fluorescencyjną. Pod mikroskopem liczone są drobnoustroje osadzone na filtrze membranowym o porach 0,45um, po uprzednim ich wybrawieniu fluorochromami (oranż metylowy). Metoda umożliwia odróżnienie komórek żywych od martwych. Żywe fluoryzują na żółto lub pomarańczowo, martwe na zielono. Metoda stosowana do określenia liczebności mikroorganizmów, np. w produktach spożywczych świeżych jak i przetworzonych w tym mrożonkach.
Zalety: szybko, dokładnie, tanio. Najlepsze wyniki uzyskuje się w zakresie 10^4-10^7 komórek drobnoustrojów w 1 ml.
II METODY HODOWLANE
Oparta jest na zdolności drobnoustrojów do wzrostu i rozmnażania, dzięki czemu oznacza się tylko żywe komórki zdolne do wzrostu na pożywkach płynnych (metoda rozcieńczeń) lub pożywkach stałych (metoda płytkowa i jej modyfikacje)
Posiew: podstawowa metoda diagnostyki mikrobiologicznej polegająca na przeniesieniu pobranego materiału biologicznego na odpowiednie podłoże mikrobiologiczne, umożliwiające wzrost mikroorganizmów…………
Metod i sposobów posiewów jest wiele, lecz kilka jest powszechnie używanych. Do posiewów, aby uzyskać wiarygodne wyniki używamy:
- jałowych podłoży hodowlanych ( płynnych lub stałych)
- sterylnego sprzętu
a) ezy - posiew na skosy agarowe, podłoża płynne, izolacja czystych kultur
b) drucik - hodowla kłuta na podłożach stałych
c) głaszczki - posiew na podłoże stałe
d) pipety - posiew na podłoże stałe i płynne
e) welwet w metodzie replik (podłoża stałe)
Miano - najmniejsza objętość gdzie obserwujemy wzrost
1. Metoda rozcieńczeń Listera 1:9 ml 10^-1 10^-2 itd. Można od razu do podłoża płynnego
Metoda rozcieńczeń stosowana do:
- izolacja czystych kultur ze środowiska płynnego
- określania miana mikroorganizmów w danym środowisku
- określania NPL (najbardziej prawdopodobnej liczby mikroorganizmów w 100ml materiały wyjściowego) w oparciu o statystyczne opracowanie zawarte w tablicach McCrady'ego.
TABELKA
2. Metoda płytkowa (Roberta Kocha)
- określanie liczby drobnoustrojów
- izolowanie czystych kultur
- obserwacje morfologiczne
Wada: wyniki zawsze zaniżone w stosunku do rzeczywistości, co wynika z:
- braku uniwersalnego podłoża hodowlanego i warunków inkubacji
- występowania niektórych bakterii w skupiskach i łańcuszkach (kolonie tych bakterii rozwijają się często nawet z kilkudziesięciu komórek)
W związku z powyższym liczebność bakterii w metodzie płytkowej podaje się jako JTK (jednostki tworzenia kolonii z ang. CFU)
Procedura:
a) rozcieńczenie materiału (zawiesina, próba wodna, glebowa itp. Postępowanie zgodnie z procedurą metody rozcieńczeń Listera)
b) posiew na płytki Petriego murawowo i wgłębnie w co najmniej dwóch powtórzeniach z każdego wysianego rozcieńczenia
c) inkubacja - czas i temp. inkubacji jest determinowana rodzajem wysianych mikroorganizmów.(jak jest z żelatyny to się nie odwraca, bo jest łatwo rozkładalnym białkiem i wtedy by spłynęło). Płytki agarowe inkubuje się zawsze do góry dnem, aby zapobiec rozpraszaniu i rozmywaniu rosnących kolonii bakterii poprzez wodę kondensacyjną.
d) liczenie: po okresie inkubacji liczymy wyrośnięte kolonie odrzucając płytki z liczbą kolonii powyżej 300, liczba poniżej 30 również jest wątpliwa, gdyż przypadkowe zakażenie może wpłynąć istotnie na wynik końcowy. Jeżeli na płytkach z powtórzeń różnica nie jest większa niż 10 % , to wyniki ze wszystkich próbek uśredniamy. Wyniki skrajnie odbiegające należy odrzucić.
Wynik (L) podaje się w JTK w 1 ml lub gramie badanego materiału korzystając ze wzoru:
L= a*b*c
a - średnia liczba kolonii, b - odwrotność rozcieńczenia, z którego wykonano posiew, c - współczynnik dla metody powierzchniowej, przyjmuje on wartość 0.1 co odpowiada 0.1 posiewanego materiału dla metody wgłębnej jest to analogicznie 1.
3. Modyfikacje metody płytkowe Kocha
A - Metoda filtrów membranowych - stosowana do określania ilości drobnoustrojów w środowisku wodnym, w których ich ilość jest niewielka, poniżej 20-30 komórek w 1 ml, co wiąże się z koniecznością ich zagęszczenia w jednostce objętości, poprzez sączenie określonych objętości badanych płynów. Rys.
B - metoda posiewów spiralnych. Rys.
C - metoda kropelkowa - metoda całkowicie zautomatyzowana poprzez zastosowanie aparatu typu Droplett składającego się z mikropipety i licznika kolonii bakterii. Rys.
D - metoda mikrohodowli Frosta
E - metoda posiewu ezami „plate loop”
F - metoda „roll tube”
G - gotowe zestawy z podłożami naniesionymi na plastikowe paski - służą do określania stopnia mikrobiologicznego zanieczyszczenia, przeznaczone głownie dla zakładów przemysłowych nie posiadających zaplecza laboratoryjnego. Rys.
Pertifilmy - jałowe plastikowe płytki zawierające gotowe pożywki, przykryte folią polietylenową. Na płytkach zaznaczone są kwadraty o pow. 1 cm2 ułatwiające licznie wyrosłych kolonii. Rys.
Wady i zalety metod hodowlanych;
Wady:
- oznaczanie tylko osobników żywych
- mikroorganizmy występujące w połączeniu oceniane są jako jedna komórka
- uwzględniane są tylko mikroorganizmy zdolne do rozwoju w danych warunkach hodowlanych (pożywka, temperatura, O2)
- długi czas pomiędzy wysiewem a uzyskaniem wyniku
Zaletą metod hodowlanych jest możliwość obserwacji morfologicznych zarówno komórek jak i kolonii.
Wady i zalety metod mikroskopowych:
Wady:
- możliwość liczenia drobnoustrojów dopiero powyżej 10^5 komórek/ml
- brak informacji o aktywności i żywotności mikroorganizmów ( z wyjątkiem DEFT)
- mogą być stosowane do liczenia dużych komórek
Zaletą jest szybka informacja o ilości drobnoustrojów w analizowanej próbie.
4. Metody wagowe
Metody te stosowane są dla określenia biomasy mikroorganizmów poprzez oznaczenie ciężaru świeżej lub suchej biomasy.
- ciężar świeżej biomasy określa się po odwirowaniu komórek (bakterie, drożdże) lub odsączeniu (drożdże, pleśnie). Wilgotna masa zawiera około 10-25% suchej masy
- suchą biomasę bakterii i drożdży określa się następująco - po odwirowaniu i przemyciu komórek, suszy się je do stałej wagi w 105 st. C, dla pleśni po przesączeniu zawiesiny przez sączek, następnie suszy się do stałej wagi (waga sączka znana)
5. Metody optyczne
Wykorzystują zależność wzrostu mętności roztworu wraz ze wzrostem liczebności mikroorganizmów. Metody te mogą być stosowane jedynie do kontroli wzrostu mikroorganizmów w klarownych pożywkach płynnych. Wyróżniamy tu metody turbidymetryczne i nefelometryczne
- metody turbidymetryczne - polegają na pomiarze światła zaabsorbowanego przez zawiesine drobnoustrojów. Do tego celu służą kalorymetry bądź spektrofotometry. Stosowana długość fali zależy od zabarwianego podłoża, np. dla podłoża żółtego jest to 540 nm.
Wynik podaje się jako wartość ekstynkcji ( ang. OD ) lub % transmisji.
Próbą kontrolną jest jałowa pożywka, nastawiona na odczyt 100 % przepuszczalności światła. Wyznaczając krzywą wzorcową, będącą liniową zależnością pomiędzy zawartością suchej biomasy a ekstynkcją E= f(s.m.) możemy odczytać zawartość suchej biomasy w badanej próbie.
- metody nefelometryczne - polegają na pomiarze natężenia światła rozproszonego w zawiesinie drobnoustrojów przy pomocy urządzenia zwanego nefelometrem. Natężenie światła po przejściu przez zawiesinę jest odwrotnie proporcjonalne do jej gęstości. W metodzie tej zazwyczaj stosuje się skale McFarlanda, która składa się z 10 wzorców, zawierających różne stężenia chlorku baru. Zmętnienie ich odpowiada zmętnieniu zawiesiny bakterii od 3*10^8 do 3*10^9 komórek w 1 ml zawiesiny.
Szybkie metody detekcji poziomu zanieczyszczeń mikrobiologicznych możemy podzielić na biochemiczne i biofizyczne
Metody biochemiczne:
- oznaczanie aktywności enzymów (dehydrogenazy, katalaza)
- oznaczenie poziomu określonych metabolitów i półproduktów (ATP, pirogronian, endotoksyny)
- oznaczanie wzrostu zawartości wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) w środowisku jako efekt działalności lipolitycznej, zawartość amoniaku - aktywność proteolityczna, kwasów - aktywność kwasząca, CO2 - aktywność metaboliczna
- oznaczanie zawartości specyficznych składników komórkowych (chityna, ergosterol)
Metody biofizyczne
- metody turbidymetryczne
- metody oparte na pomiarze zmiany impedancji czy konduktancji środowiska pod wpływem rozwoju mikroorganizmów
- metody radiometryczne
- Kalorymetria
- Cytometria przepływowa
Metody izolacji czystych kultur
Czysta kultura - populacja wyprowadzona z jednej komórki.
Izolacje czystych kultur:
- najczęściej przeprowadza się na podłożach zestalonych agarem
- w badaniach rutynowych stosuje się płytkową, rozcieńczeń (Listera), kropelkową
- w badaniach naukowych zalecane jest wykorzystanie mikromanipulatora
W badaniach rutynowych izolacje czystych kultur najczęściej przeprowadza się metodą płytkową Kocha. Znane są 3 warianty tej metody:
1. Metoda rozsiewu rysą (posiew redukcyjny)
- na całej powierzchni płytki Petriego
- metoda rozsiewu sektorowego
2. Metoda posiewu powierzchniowego
3. Metoda płytek lanych
W badaniach naukowych zalecana jest bezpośrednia metoda izolowania czystych kultur z zastosowaniem mikromanipulatora
Pomocnicze metody izolacji czystych kultur
W celu selekcji mikroorganizmów wykorzystuje się różnice fizjologiczne i biochemiczne drobnoustrojów, które pozwalają poprzez określone zabiegi hodowlane stymulować lub ograniczać rozwój określonych drobnoustrojów. Manipulacje te mogą obejmować:
- skład i pH pożywki
- temp. hodowli
- ciśnienie osmotyczne
- natlenienie hodowli
- stosowanie selektywnych inhibitorów wzrostu (np. nystatyna, aktidion - wstrzymanie rozwoju grzybów, chloramfenikol - bakterii).
WYKŁAD 4
Metody hodowli drobnoustrojów
Przy wyborze metody hodowli drobnoustrojów należy uwzględnić :
- wymagania pokarmowe
- wymagania co do warunków wzrostu - temperatura, natlenienie, ciśnienie osmotyczne, pH
Hodowle w warunkach laboratoryjnych można prowadzić :
- metodą powierzchniową na podłożach zestalonych
- na podłożach płynnych
W warunkach:
- tlenowych
- beztlenowych
W badaniach mikrobiologicznych stosuje się 3 typy hodowli:
a) hodowle okresowe (statyczne lub wstrząsane)
b) hodowle ciągłe
c) hodowle zsynchronizowane
1. Hodowle okresowe (statyczne lub wstrząsane),
drobnoustroje namnaża się w systemie zamkniętym, do czasu całkowitego wyczerpania składników pokarmowych lub zatrucia produktami własnego metabolizmu.
Obserwuje się tu szereg faz fizjologicznych, które są wyrazem zmian w metabolizmie i we wzajemnym oddziaływaniu między komórkami a środowiskiem.
W przypadku bakterii i drożdży wzrost drobnoustrojów określa się na podstawie wzrostu liczby komórek, co zdefiniowane jest jako liczba kom/ml*h
Parametrem stosowanym do pomiaru wzrostu drobnoustrojów tworzących wielokomórkowe plechy (grzyby, promieniowce) jest stężenie biomasy - wzrost definiowany jest jako szybkość zmian stężenia suchej masy komórek, czyli jako g s.m./dm3*h
W precyzyjnych badaniach wzrost drobnoustrojów jest określany na podstawie stężenia składników komórki związanych ze wzrostem lub ich rozmnażaniem, a zatem na podstawie zawartości: azotu komórkowego, białka, DNA.
Wzrost mikroorganizmów w hodowli okresowej można opisać graficznie, przedstawiając zależność liczby komórek lub biomasy od czasu trwania hodowli. Zapis graficzny hodowli okresowej to tzw. krzywa wzrostu, w której można wyróżnić kilka faz. RYS.
I - LAG faza (spoczynkowa, przystosowawcza, adaptacyjna)
II - Faza logarytmicznego wzrostu (wykładnicza)
III - faza zwolnionego wzrostu
IV - faza stacjonarna
V - faza zwolnionego zamierania
VI - faza logarytmicznego zamierania
Czas generacji (G) definiowany jest jako czas (t) dzielony przez liczbę generacji (n) powstałych w tym czasie czyli G=t/n. RYS.
2. Hodowle ciągłe - nieprzerwany rozwój drobnoustrojów reguluje dopływ porcjowanej pożywki przy jednoczesnym odpływie tej samej ilości zużytego podłoża wraz z produktami metabolizmu. Typ hodowli stosowany do:
- specjalnych badań eksperymentalnych
- przemysłowej produkcji biomasy
- w przemyśle fermentacyjnym do produkcji związków chemicznych
Schemat chemostatu RYS.
Zasadą chemostatu jest stan równowagi pomiędzy szybkością wzrostu u i szybkością rozcieńczania hodowli D, czyli u=D, co zapewni stałą szybkość wzrostu komórek i liczbę komórek w fermentorze.
Gdy u<D - komórki są wypłukiwane z fermentora i spada zawartość biomasy
Gdy u>D - nadmiernie wzrasta zawartość biomasy w fermentorze, co powoduje wyczerpanie się pożywki i gromadzenie się metabolitów.
Hodowle ciągłe pomimo, że pozwalają na wyeliminowanie zmienności warunków hodowli w trakcie jej trwania, to w praktyce przemysłowej powszechność ich stosowania jest ograniczona. Ograniczenie to wynika z:
- możliwości degeneracji szczepów
- selekcji osobników o gorszych cechach biotechnologicznych
- trudności zachowania czystości mikrobiologicznej
- tendencji do tworzenia przez niektóre mikroorganizmy kłaczków lub agregatów powodujących zarastanie ścian i przewodów fermentora.
Procesy ciągłe stosowane są najczęściej do:
- otrzymywania białka paszowego
- do produkcji etanolu, butanolu, acetonu, kwasów organicznych, niektórych antybiotyków
- przy oczyszczaniu ścieków metodą osadu czynnego
3. Hodowle synchronizowane - rozmnażanie większości osobników odbywa się równocześnie, a cała hodowla znajduje się w wyrównanym stadium tzn. w takiej samej fazie rozwoju osobniczego.
Hodowle synchronizowane znajdują zastosowanie w przypadku specjalnych celów badawczych, takich jak określenie w pojedynczej komórce zawartości:
- enzymów
- różnych typów RNA
- innych związków wielkocząsteczkowych
Synchronizacje podziałów komórkowych można osiągnąć poprzez:
- selekcję z populacji osobników znajdujących się w tej samej fazie rozwoju
- synchronizacje cyklu komórkowego wszystkich organizmów poprzez zmianę składu pożywki
Podział mikroorganizmów na grupy fizjologiczne
W oparciu o wymagania pokarmowe i środowiskowe, mikroorganizmy dzieli się na liczne grupy fizjologiczne, obrazujące możliwości ich wzrostu w określonych warunkach, co z kolei jest konsekwencja określonego wyposażenia enzymatycznego mikroorganizmów.
Określony gatunek, z zależności od rozpatrywanych kryteriów, można zaklasyfikować do kilku różnych grup fizjologicznych.
WYKŁAD 5
Ze względu na sposób odżywiania drobnoustroje dzieli się według 3 kryteriów:
- źródło węgla do syntez komórkowych
- źródło energii metabolicznej
- źródło elektronów i protonów
Mikroorganizmy grupujemy ze względu na wykorzystywane:
a) źródło węgla i elektronów:
- autotrofy (samożywne, zw. organiczne z prostych zw. nieorganicznych)
- heterotrofy (cudzożywne, rozkład martwej subs. organicznej)
b) źródło energii
- fotoautotrofy (energia słoneczna)
- chemoautotrofy (energia z reakcji chemicznych)
c) źródło donorów wodoru
- litotrofy (z subst. nieorganicznych)
- organotrofy (z subst. organicznych)
Ponadto mikroorganizmy można podzielić:
a) zależności od rodzaju wykorzystywanych, ostatecznych akceptorów elektronów na:
- tlenowe(aeroby)
- beztlenowe(anaeroby) - względnie lub bezwzględnie (fermentacja, oddychanie azotanowe, siarczanowe)
Są również formy tolerujące niskie stężenia tlenu, tzw. Mikroaerofile
SCHEMAT
b) w zależności od preferowanej temperatury na:
- psychrofile (zimnolubne) (optimum 10-20 st) / ok. 15
- mezofile (ciepłolubne) (25-40 st)/ ok. 30
- termofile (gorącolubne) (50-55 st)/ ok. 50
ZAKRESY
c) w zależności od preferowanego odczynu środowiska
- acidofile (kwasolubne - pH 2-5)
- neutrofile (obojętnolubne pH 6.7-7.5)
- alkalofile (zasadolubne pH 8-11)
Każdy organizm ma swoje kardynalne zakresy pH (min, opt, max), rozpiętość tych zakresów jest bardzo różna od bardzo wąskich (organizmy bardzo wrażliwe na zmiany pH) do bardzo szerokich.
d) w zależności od właściwości biochemicznych mikroorganizmy, głównie bakterie można przypisać do różnych grup fizjologicznych, np.
- ligninolityczne
- celulolityczne
- proteolityczne
- amylolityczne i wiele innych.
Jeden gatunek bakterii może przynależeć jednocześnie do kilku grup fizjologicznych, co wynika z jego właściwości biochemicznych.
Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych.
W licznych biotechnologiach wykorzystuje się szczepy przemysłowe o ściśle zaprogramowanych właściwościach metabolicznych.
Źródła pozyskiwania szczepów przemysłowych:
- środowisko naturalne
- kolekcje (banki) szczepów
Wydajność procesów biosyntezy lub biotransformacji prowadzonych przez drobnoustroje pozyskane ze środowiska naturalnego są zazwyczaj niewystarczające ze względów technologicznych.
Aktywność metaboliczną szczepów dzikich i pozyskiwanie pożądanych produktów ich metabolizmu można zwiększyć poprzez optymalizację warunków hodowli.
Maksymalna wydajność tych procesów nie przekroczy jednak granic zdeterminowanych genotypem.
Doskonalenie cech użytkowych szczepów przemysłowych, poprzez wprowadzenie trwałych zmian genetycznych, uzyskuje się na drodze modyfikacji genotypu.
Efektem modyfikacji genotypu są zasadnicze zmiany metaboliczno - fizjologiczne.
Modyfikacji genotypu dokonuje się poprzez mutagenezę ( i selekcja mutantów o cechach korzystnych dla danego procesu) oraz rekombinacje genetyczne ( fuzja protoplastów i rekombinacje DNA in vitro). Prowadzi to do zmiany metabolizmu, a szczególnie naruszenia określonych mechanizmów regulacyjnych.
Etapy:
- wybór miejsca i pobór prób
- wstępna obróbka pobranych prób
- namnażanie mikroorganizmów, selekcja i oczyszczanie w celu pozyskania czystych kultur (wyprowadzonych z pojedynczych komórek)
- określenie przydatności wyizolowanych kultur w procesach biotechnologicznych
Screening drobnoustrojów lub produktów ich metabolizmu - zespół selektywnych zabiegów, mających na celu:
- wykrycie i izolację interesujących nas mikroorganizmów lub produktów ich metabolizmu
- wstępną ocenę przydatności w procesach biotechnologicznych
SCHEMAT
Sposoby selekcji szczepów pożądanych ze środowiska
Skuteczność sceerningu wiąże się m.in. ze zwiększeniem w pobranym materiale koncentracji szczepów pożądanych, przy jednoczesnym zmniejszaniu udziału innych mikroorganizmów, co uzyskuje się stosując następujące zabiegi:
a) określone działanie na środowisko przed pobraniem próby
b) zastosowanie wabików (przynęt, pułapek)
c) wstępna obróbkę fizyczną lub mechaniczną próby
d) hodowlę wzbogacającą
Ad a)
- wprowadzenie określonego substratu pokarmowego
- wprowadzenie czynnika biostatycznego lub biobójczego dla niepożądanych grup mikroorganizmów
- modyfikacja warunków środowiskowych np. przez zmianę odczynu
Ad b)
- Wabiki wprowadza się do środowiska na określony czas
* naturalne (pyłek roślinny, nasiona, liście, kawałki drewna, martwe owady, włosy, pióra itp.)
* syntetyczne (plastikowe, metalowe lub szklane płytki, rurki powleczone określonymi substancjami)
Ad c)
- metody fizyczne - temperatura, wilgotność
- metody chemiczne - odczyn próby
- metody mechaniczne - wirowanie, flotacja
Ad d)
Hodowle wzbogacające - skład podłoża jest zdeterminowany wymaganiami pokarmowymi określonych szczepów, jednocześnie całkowicie ogranicza lub całkowicie hamuje rozwój drobnoustrojów niepożądanych ( stosowanie selektywnych podłoży syntetycznych).
Metoda nie gwarantuje absolutnej selektywności, prowadzi jedynie do zmiany stosunków ilościowo - jakościowych w wyjściowej populacji mieszanej, dzięki czemu łatwiejsza jest dalsza izolacja czystych kultur.
Czynniki selekcyjne:
- źródło węgla, azotu i fosforu
- ksenobiotyki jako jedyne źródło węgla i energii
- obecność określonych akceptorów elektronów (O2, NO3-, SO42-)
- dodatkowe czynniki wzrostowe (aminokwasy, witaminy)
- czynniki biostatyczne / biobójcze (antybiotyki)
- potencjał redox (hodowle tlenowe i beztlenowe)
- pH
- temperatura
- czas hodowli
Selekcja baterii produkujących kwas mlekowy (schemat)
Materiał fermentujący materiał roślinny, mleko i jego przetwory -->
Podłoże słabo zbuforowane zawierające glukozę (20 g/l), ekstrakt drożdżowy (10 g/l)-->
(Warunki hodowli: brak napowietrzania, temp. 20-35 st.C)
--> Wstępny okres rozwoju mikroflory: Aerobacter, Escherichia, z wyraźnia dominacja bakterii mlekowych - najpierw Streptococcus, nastepnie Lactobacillus
(Warunki hodowli: brak napowietrzania, temp. 48-52 st.C)
--> Hodowla: mieszanka termofilnych szczepów z rodzaju Lactobacillus (L. bulgaris...)
Selekcja bakterii produkujących kwas propionowy(schemat)
Materiał: żółty ser dojrzewający
--> Podłoże: zbuforowane zaw., ph 7, mleczan sodowy (20 g/l), ekstrakt drożdżowy (10g/l), sole mineralne (Warunki hodowli: brak napowietrzania, temperatura ok. 30 st.C)
--> Hodowla: Propiono....
WYKŁAD 6
Ulepszanie szczepów przemysłowych
Po co?
- Wydajność procesów biosyntezy i biotransformacji szczepów izolowanych ze środowiska naturalnego jest niewystarczająca dla procesów biotechnologicznych
- Zwiększenie aktywności metabolicznej i podwyższenie wydajności danego szczepu jest możliwe tylko w granicach określonych genotypem. Uzyskuje się poprzez odpowiedni dobór warunków hodowli (podłoże, temperatura, odczyn itp.)
Większość szczepów przemysłowych to szczepy ulepszone.
Najczęściej stosowanym zabiegiem są modyfikacje genoty pu szczepu doskonalące ich cechy technologiczne poprzez poprawienie ich ukierunkowanej wydajności metabolicznej (zmiany metaboliczno - fizjologiczne).
Dokonuje sie tego na drodze mutagenizacji i selekcji mutantów oraz rekombinacji genetycznych (fuzji protoplastów, klonowania genów).
W procedurze tej uwzględnia się oba typy zmienności mikroorganizmów:
- genotypową
- fenotypową
Mutacja - nagłe pojawienie sie komórki o zmienionym (nowym) genotypie, zdolnej do przekazywania zmienionych cech swemu potomstwu.
Forma o zmienionym genotypie to mutant, jego powstanie (związane z tym zmiany w genotypie) to mutacja, a proces prowadzący do mutacji to mutageneza.
Mutacja może się wiązać z nabyciem nowej cechy (np. oporności na antybiotyki) lub utratą wcześniej posiadanej (utrata zdolności produkcji jakiegoś enzymu, co wiąże się z utratą pewnych zdolności metabolicznych).
Powstające zmiany fenotypowe wynikają z modyfikacji genotypu w pierwszorzędowej strukturze DNA.
Mutacje dzielimy na:
- spontaniczne: częstość mniejsza niz 10^-5, w przypadku niekorzystnych zmian mogą stanowić poważny problem technologiczny, zwłaszcza w hodowlach ciągłych, możliwość ich wystąpienia zmusza do ciągłej preselekcji szczepów
- indukowane: wywoływane czynnikami zewnętrznymi
Mutacje indukowane są to mutacje indukowane czynnikami mutagennymi (zwiększającymi ich częstotliwość od kilku do kilkudziesięciu tysięcy razy), powstałe mutanty to mutanty indukowane.
Rodzaje mutacji indukowanych:
- mutacje punktowe: tranzycja, transwersja
- delecje i insercje prowadzące do przesunięcia się ramki odczytu (frame shift)
Czynniki mutagenne TABELA
Brak jednoznacznej korelacji pomiędzy miejscem i rodzajem wywołanej mutacji DNA, a typem otrzymanego mutanta i ostatecznym efektem fizjologicznym mutacji uzasadnia stosowanie wielokrotnej mutagenizacji i różnych mutagenów.
Optymalizacja polega na:
- doborze odpowiedniego rodzaju i dawki mutagenów
- umiejscowieniu czasu ich działania w określonej fazie replikacji DNA
- opracowanie efektów najbardziej efektywnej selekcji pożądanych mutantów
Dlaczego UV?
- ogólna dostępność i łatwość użycia
- łatwość dozowania dawek poprzez dobór odpowiedniej mocy lampy, czasu działania i odległości od naświetlanego obiektu
- łatwość odtwarzania warunków mutagenizacji
- przewaga efektu mutacyjnego nad letalnym
- możliwość uzyskania wszystkich typów mutantów
- możliwość wywołania mutacji w komórkach wegetatywnych i spoczynkowych (np. sporach)
W hodowlach zsynchronizowanych MNNG zastosowane w odowiedniej fazie replikacji DNA pozwala na kontrolowanie procesu mutagenezy w określonym regionie genomu, ponieważ:
- wywołuje mutacje punktowe, dotyczące pojedynczych genów
- max efektywność działania podczas replikacji DNA
- często powstają mutacje równoczesne skupione w jednym regionie DNA
Efektywność mutagenizacji zależy od:
- rodzaju i stężenia użytego czynnika
- fazy rozwoju komórki
- warunków hodowli przez mutagenizacją jak i w trakcie jej trwania
Etapy mutagenizacji i procesów pomutacyjnych:
- penetracja mutagenu do komórki
- oddziaływanie na DNA wywołujące niestabilne zmiany pierwotne
- naprawa uszkodzeń pierwotnych z możliwością zajścia trwałych zmian wtórnych w DNA
- stabilizacja mutacji powodująca utrzymanie się zmian w kolejnych pokoleniach komórek
- zmiany biochemiczne w komórce i fenotypowe ujawnienie sie mutacji
SCHEMAT z Chmiela
W pozyskiwaniu szczepów przemysłowych najbardziej przydatne są szczepy wykazujące dużą podatność na mutagenezę indukowaną (prowadząca do ich ulepszania), a równocześnie mało podatne na mutacje spontaniczne, co warunkuje ich dużą stabilność genetyczną.
Etapy selekcji mutantów:
I Wstępne testy - eliminacja szczepów mało przydatnych
II Dokładniejsza charakterystyka szczepów wyselekcjonowanych w etapie I
III Dobór optymalnych warunków hodowli i procesu najlepszych szczepów wyselekcjonowanych w etapach poprzednich
W technologiach przemysłowych procesy selekcyjne powtarzane są cyklicznie. Szczepy już stosowane, sprawdzone w warunkach przemysłowych, stanowią bazę do pozyskiwania lepszych ich wariantów.
Metody selekcji mutantów:
I Jednoetapowe - skrining juz podczas izolacji szczepów
II Dwuetapowe - testowaniu i selekcji poddaje się wyizolowane wcześniej czyste kultury mikroorganizmów
1. Metoda płytkowa z użyciem wskaźników - umożliwia szybkie, półilościowe izolowanie mikroorganizmów wytwarzających lub przekształcających określone związki chemiczne, np.
- wytwarzanie kwasów organicznych
- wytwarzanie amin
- produkcja enzymów ( amylazy, proteazy, celulazy, nukleazy)
- produkcja inhibitorów enzymów
2. Metoda podwójnej hodowli na płytkach Petriego - selekcja szczepów produkujących antybiotyki, witaminy, aminokwasy SCHEMAT. Metoda nieprzydatna do selekcji szczepów wytwarzających produkty gromadzone wewnątrzkomórkowo.
3. Metoda replik z testem auksanograficznym.
4. Selekcja mutantów pokarmowych (auksotroficznych) metodą penicylinową(wzbogacania mutantów auksotroficznych) SCHEMAT
5. Metoda krążków agarowych SCHEMAT
6. Metoda skrinigu komponentów farmaceutycznych, np. skrining inhibitorów B-laktamaz SCHEMAT
7. Selekcja szczepów opornych na toksyny (antybiotyki, ksenobiotyki i inne)
a) metoda płytek gradientowych
b) zestawy płytek z różnymi stężeniami toksyn
Zastosowanie mutantów w przemyśle.
Dzięki mutacjom pozyskuje się coraz bardziej wydajne szczepy drobnoustrojów wytwarzających aminokwasy, alkohole, kwasy organiczne, witaminy, substancje domowe i inne metabolity.
- mutanty auksotroficzne zdolne są do zwiększonej produkcji antybiotyków
- na drodze mutacji otrzymuje sie mutanty, które oprócz wysokiej wydajności cechuje wybiórczość produkcji, tzn. że głównym produktem przemian jest określony związek chemiczny, a trudne do usunięcia produkty uboczne wytwarzane są w ilościach śladowych
- np. wyselekcjonowane mutanty Corynebacterium glutamicum produkują L-lizynę z wysoką, 30% wydajnością w stosunku do substratu węglowego.
Rekombinacje genetyczne uzyskuje się poprzez:
hybrydyzację, czyli krzyżowanie szczepów
konstruowanie sztucznych kombinacji genów in vitro i uzyskiwanie ekspresji genów dokładnie zaprogramowanej informacji genetycznej w komórkach
Hybrydyzacja:
- naturalna - krzyżowanie drobnoustrojów na drodze płciowej lub paraseksualnej. Polega na przekazaniu informacji genetycznej z komórki dawcy do komórki biorcy > wymianie odcinków DNA w procesie crossing over (rekombinacja) > segregacji materiału genetycznego > powstaniu hybryd (rekombinantów)
- fuzja protoplastów - usunięcie ściany komórkowej, a poprzez to ułatwienie fuzji protoplastów, również międzygatunkowej.
7