TWykłady prowadzi prof. Dr hab. Inż. Tadeusz Tuszyński.
*motyw przewodni z Terminatora 2*

Jakie mamy mikrobiologie (według podręczników ukazujących się)?
- Ogólną;
- Kliniczną;
- Środowiskową (w tym wody, gleby, powietrza...);
- Żywności;
- Weterynaryjna;
- Drobnoustrojów ekstremalnych;
- Rolna;
- Techniczna; (bardziej rozumiana w sensie rozkładu materiałów technicznych przy udziale drobnoustrojów, czyli zjawiska o charakterze negatywnym)
- Przemysłowa;
- Prognostyczna.

Jest tego sporo. Słowo "mikrobiologia" przez lata nabrało wielu nowych znaczeń. Dawniej była to domena biologii i szeroko pojętych nauk o życiu – dzisiaj nawet uczelnie techniczne zajmują się mikrobiologią.

Procaryota – bakterie, sinice, promieniowce.
Eucaryota – grzyby (drożdże i pleśnie).

Zarówno te, jak i te, mogą mieć zastosowanie w procesach przemysłowych.

Wirusy – drobnoustroje niemające zdolności samodzielnego powielania się.
Wirusy – cząstki infekcyjne niemające zdolności samodzielnego powielania, jedynie za pomocą gospodarza.

Stosowane jako wektory w biotechnologii oraz do produkcji szczepionek. To wszystko.

Tropizm komórkowy – wirus może zaatakować tylko jedną, właściwą sobie komórkę.
Oprócz tego, wirus nie jest w stanie przetrwać poza komórką.

To dwie przyczyny, dla których jeszcze istnieje życie.

Dla bezpieczeństwa: powtórz sobie budowę bakterii gram+ i gram-.

Do zapamiętania również: bakterie grupy coli. Escherichia Coli, Klebisella, Enterobacter, Citrobacter.

Miano coli – największe rozcieńczenie, w którym stwierdza się obecność bakterii z grupy coli. Najmniejsza ilość wody, w której już stwierdza się obecność tychże.

Budowa komórki drożdży – różnice w budowie ściany komórkowej bakterii a drożdży a pleśni – inne cuda – wszystko trzeba powtórzyć.

Przetrwalnikujące: clostridium, bacillus.

HACCP – Hazard Analysis and Critical Control Point System. Analiza Zagrożeń W Punktach Krytycznych.

Mikroskopy i aparatura laboratoryjna.

Mikroskopy użyteczne są w każdej dziedzinie nauki, jednak szczególnie w naukach biologicznych.
Mikroskop optyczny ma zdolność rozdzielczą nawet do 0,1 mikrometra. Mikroskopy elektronowe są w stanie ukazywać z bliska struktury, których wymiary mierzy się w nanometrach.
Mikroskop optyczny może powiększać – teoretycznie – do 3600x, jednak pracuje się na do 1200x, bo aberracje powodują nieczytelność obrazu powiększonego bardziej. Mikroskopia elektronowa sięga już do powiększeń znacznie wyższych rzędów, nawet do 100000x, praktycznie zaś w granicach 30-50k x.
Mikroskop transmisyjny powiększa nawet do miliona razy.

Gr. Micros + scopeo = mały + oglądam.
I wiek n.e – Rzymianie odkryli powiększjaące właściwości szkła.
Nazwa "mikroskop" pochodzi od Greka Demiscianusa (1614 rok).
Soczewki – podobieństwo do ziaren soczewicy.
1667 – Leeuwenhoek, powiększenie 270x. Czerwone ciałka krwi, plemniki, tkanki roślin i zwierząt.
17 w. - obserwacja chromatyczna. Nierównomierne załamywanie światła przechodzącego przez soczewkę.
W latach 30. XVIII w. Chester Hall użył drugiej soczewki o innych właściwościach, co zmniejszyło aberrację chromatyczną.
1872 rk – Abbe Ernst, prof. Uniwersytetu w Jenie, współwłaściciel Zeissa zakładów optycznych. Przyrząd oświetlający, udoskonalenie obiektywu achromatycznego przez użycie soczewek zanurzonych w cieczy.
1876 – Abbe, teoria falowych właśćiwości światła. Skutek dyfrakcji. Obrazem nie punkt, a krążek świetlny, tym większy im silniejsze powiększenie.
1903 r. - Zsigmondy Richard (1865-1929) – ultramikroskop – obserwacje cząstek o wymiarach pojedynczych mikrometrów (Nobel w 1925)
1935 – Zernike Frits (1888 – 1966). Zasada kontrastu faz. Możliwości badania bezbarwnych i przezroczystych materiałów biologicznych (badanie procesów w żywych komórkach – Nobel!

1941 – pierwszy mikroskop z kontrastem faz (Carl Zeiss, Jena)
1931 – Knoll Max i Ruska Ernst, prototyp mikroskopu elektronowego.
1981 - Binning Gerd i Rohrer Heinrich – scanningowy obraz obiektów (Nobel)
Mikroskopy elektronowe – podstawową wadą jest niemożliwość obserwacji ruchu charakteryzującego żywe komórki (giną one w próżni).
Ciągłe doskonalenia mikroskopów optycznych, zastosowanie technologii cyfrowej i kamer o coraz wyższej zdolności rozdzielczej.

Są dwie dominujące firmy produkujące mikroskopy – Nikon (głównie optyczne) i Olympus. Przez sentyment do japońskiej precyzji, popularniejszy jest Nikon, aczkolwiek Olympus dzielnie dotrzymuje im kroku.

(Schemat budowy mikroskopu. Każdy chyba zna.)

(Zasada działania olejku immersyjnego, najczęściej cedrowego. To chyba też znamy.)

zdolność rozdzielcza mikroskopu to najmniejsza odległość dzieląca ddwa punkty, które w obrazie są postrzegane oddzienie.
Zdolność rozdzielcza mikroskopu świetlnego to 0,2-0,25 mikrometra.


d – zdolność rozdzielcza
lambda – długość fali tworzącej obraz, dla świetlnego w granicach 0,45-0,55 mikrometra, dla elektronowego nawet 0,005 nanometra.
A – apertura numeryczna obiektywu.
A = n * sin(alfa)
n – wsp. Załamania fali tworzącej obraz charakteryzujący środowisko między preparatem a soczewką.
Alfa – kąt pomiędzy osią optyczna obiektywu a najbardziej skrajnym promieniem wpadającym do soczewki czołowiej przy prawidłowym zogniskowaniu układu.
n = 1 lub 1,56 przy zastosowaniu olejku immersyjnego. Alfa = 75 do 85 st.
A = 1,2 do 1,4

Współczesne mikroskopy elektronowe i jonowe (wiązka jonów) pozwalają dostrzec budowę wewnętrzną i zewnętrzną różnych obiektów, obrazy bakteriofagów i wirusów, różnych molekuł, a także ułożenie atomów w sieci krystalicznej!

Mikroskopy jonowe powiększają teoretycznie do 10 mln razy, co pozwala na rozróżnienie pojedynczych atomów!

Podstawowa aparatura i sprzęt w labie mikrobiologicznym:

I Mikroskopy optyczne – świetlne (zwykłe i stereoskopowe).
- Z użyciem obiektywu immersyjnego (obiektyw największego powiększenia + olejek cedrowy)
- Mikroskop do oglądania w ciemnym polu widzenia (ultramikroskop)
- Mikroskop UV – zdolność rozdzielcza 0,1 (0,08 mikrometra), granica sprawności teoretycznej mikroskopu optycznego.
- Mikroskop fluorescencyjny – różnicowanie martwych i żywych komórek.
- Mikroskop kontrastowo – fazowy – obserwacja zewnętrznych struktur.
- Mikroskop konfokalny – fluorescencyjny z użyciem światła lasera (do badań cytologicznych)

II. Mikroskop elektronowe.
- Zamiast światła widzialnego strumień elektronów. Zdolność rozdzielcza 0,2 – 1 nm (1 nm to 10^-9 cm)
- Transmisyjny – powiększa do mln razy.
- Skaningowy – powiększa do 100 tys. Razy.
- Skaningowy – tunelowy
- Jonowy – do 10 mln razy.

III. Mikroskop akustyczny.
Fale świetlne zastąpione przez fale dźwiękowe, zdolność rozdzielcza do 1-2 nm.

W transmisyjnym mikroskopie elektronowym zamiat źródła światła mamy źródł elektronów, zamiast soczewek optycznyc są elektromagnetyczne, a obrazy obserwuje się na ekranie świecącym pod wpływem padających elektronów.

Mikroskopy elektronowe.
Długość fali elektronowej wyraża wzór:



Skaningowy mikroskop elektronowy służy do badania zróżnicowanych przestrzennie powierzchni próbek i pozwala na uzyskanie ich plastycznego, nieomal trójwymiarowego, obrazu o znacznej głębi ostrości.
Strumień elektronów jest skupiany przez kondensor i obiektyw w taki sposób, że maksymalnie skoncentrowana, prawie punktowa wiązka elektronów pada na powierzchnię próbki pokrytą warstewką metalu (złoto, platyna), która nie przepuszcza elektronów.

Zdolność rozdzielcza (3-10 nm) uzależniona jest w pierwszym rzędzie od rozmiarów (średnicy) wiązki elektronowej.

(Schemat układu tworzącego obraz w skaningowym mikroskopie elektronowym)

Mikroskop współczesny to dwa układy soczewek (obiektyw, okular) na jednej osi optycznej, składające się nawet z 10 różnych soczewek wykonanych ze specjalnych gatunków szkła. Maks. Pow obiektywu 120x, okularu 30x, razem 3600 razy. Przy tak cdużym powiększeniu obraz jest częściowo zniekształcany.
Różne mikroskopy o specjalnej budowie do badań biologicznych, medycznych, metrologicznych i innych.
Nawet najdoskonalszy świetlny nie pozwala odróżnić szczegółów mniejszych niż 0,3 mikrometra. Np. Riketsji i mykoplazm (ok. 0,1 mikrometra) można już nie iujrzeć.
Nie pozwala badać wewnętrzej budowy wirusów i bakterii.

Gdy w transmisyjnym mikroskopie leektronowym wykorzysta się do tworzenia obrazu fale elektronowe ugięte na przestrzennej sieci atomów, to w największych powiększeniach (w mikroskopie około miliona razy) zobaczyć można dla bardzo cienkich preparatów obraz struktury atomowej.

Odmiany mikroskopów świetlnych:
1. Technika ciemnego pola.
Wykorzystuje się zjawisko dyfrakcji (ugięcia) promieni świetlnych padających na obiekt o bardzo małych rozmiarach.
Przykład – dostrzeganie drobnych cząsteczek kurzu. Jeżeli znajdują się w smudze światła wpadającego przez szczelinę w zasłonie okiennej – warunek obserwacji – spoglądanie na smugę światła z boku tak, aby była widoczna na ciemnym tle.
Mikroskopowanie w ciemnym polu umożliwia dostrzeżenie cząstek o wymiarach poniżej zdolności rozdzielczej układu.
Metodę ciemnego pola stosuje się głównie do obserwacji żywych preparatów oraz w metalografii.

Mikroskop kontrastowo-fazowy.
Siatkówka oka reaguje na długość fali świetlnej – barwę – i amplitudę (jasność).
Nie reaguje zaś na fazę światła.
Różne struktury obecne w preparacie powodują odmienne przesunięcie fazy.
W mikroskopie kontrastowym zstosowano specjalny układ, który przesunięcie fazy przekształca w zmianę amplitudy.
Sturktury obecne w preparacie dostrzegane są w postaci skontrastowanej – jako ciemniejsze i jaśniejsze.
Technika stosowana do badania hodowli komórkowych (komórek niebarwionych) oraz w preparatach słabo zabarwionych do wzmocnienia kontrastu (metody histochemiczne).

Mikroskop interferencyjny.
- Przekształca różnicę faz świetlnych w różnicę ich amplitudy.
- Służy do kontrastowania obrazu, analizy ilościowej suchej masy badanych struktur i określania grubości skrawków.
Mikroskop polaryzacyjny.
- Wbudowane dwa pryzmaty (polaryzator i analizator) lub siatki polaryzacyjne powodujące polaryzację światła.
- Obiekty widoczne jako jasne na ciemnym tle – do analizy preparatów histopatologicznych.

Optyka Nomarskiego.
- Specjalne systemy optyczne, które sa modyfikacją mikroskopii kontrastowo-fazowej i interferencyjnej.
- Pozwala na wzmocnienie kontrastu niebarwionych struktur komórkowych i uzyskanie ich plastycznego, prawie trójwymiarowego obrazu.

Konfokalny.
Scanningowy mikroskop świetlny przepuszcza promienie świetlne wyłącznie z płaszczyzny formowania obrazu, eliminując światło pochodzące z warstw poniżej i powyżej preparatu. Umożliwia obserwację optycznych przekrojów preparatu w określonej płaszczyźnie.
Źródłem światła laser emitujący wąski promień tworzący plamkę o średnicy 0,1 mikrometra (teoretyczna zdolność rozdzielcza).

Odwrócony.
Niektóre preparaty biologiczne wymagają mikroskopowania od dołu, np. Hodowle w płaskich naczyniach szklanych, w których komórki osiadają na dnie.
Układ optyczny odwrócony o 180 st. - źródło światła i kondensor w górze mikroskopu, obiektyw i okular w dolnej.

(Zasada działania autoklawu może być na egz. Trzeba koniecznie znaleźć schemat.)

(Schemat anaerostatu i rodzaje filtrów bakteriologicznych. Zasada działania pompki wodnej na podciśnienie.)

Skuteczniejsza sterylizacja jest w atmosferze odpowietrzonej. Skuteczniejsza obróbka jest gorącą parą wodną niż elektrycznie.

Co powinno posiadać każde urządzenie ciśnieniowe?
(Urząd dozoru techniczego – UDT – dokładnie pilnuje, by nie eksploatowano urządzeń ciśnieniowych, które posiadają defekty.)
1. Zawory bezpieczeństwa – otworzą się samoczynnie, jeśli włączy się ciśnienie zbyt wysokie niż to, na które jest przeznaczone dane urządzenie. Może być ciężarkowy lub sprężynowy i lepiej znać oba typy ;
2. Płynowskaz – wskazuje poziom cieczy.
3. Manometr
4. Termometr lub inny system mierzenia temperatury
5. Zawór zwrotny (przy dużych instalacjach szczególnie – autoklaw niekoniecznie musi taki mieć).

1 Ba ~ 0,1 Mpa
Dawniej 1 Ba to 1 atmosfera fizyczna.

Niektóre drobnoustroje przeżyją nawet ciśnienie rzędu 1000 MPa. Pod ciśnieniem rzędu 300-400 MPa rozwijać się mogą nawet niektóre rośliny. Niektóre nawet szczególniej.

Ziarniaki są odporniejsze od laseczek i pałeczek. Bakterie w ogóle są odporniejsze od drożdży i grzybów.

Gniazdo zaworu – wolna przestrzeń w komorze, zamykana przez grzybek zaworu. Grzybek, osadzony na mechanizmie, blokuje przepływ.
W zaworze ciężarkowym umieszczony jest na cięgle, pracujące przeguby po drodze, zaś na drugim końcu cięgła są ciężarki. Jeśli wpływająca substancja pokona ciężar ciężarków, zawór zostaje otwarty i następuje odpływ.

W sprężynowym siłę ścisku daje pokrętło na sprężynie. Jeśli ciśnienie pokona siłę sprężystości sprężyny, zawór się otworzy i nastąpi wypływ.

Minimalny poziom grzewczy to 100 mm powyżej linii ogniowej.

Bezpieczeństwo pracy z drobnoustrojami (ryzyko mikrobiologiczne).
- Laboratoria w obszarze gospodarki żywnościowej
- Laboratoria mikrobiologiczne i biotechnologiczne szkół wyższych, instytutów naukowych i badawczych
- Laboratoria służby zdrowia, jednostek kontrolnych, wojskowe.

Konieczna znajomość zasad postępowania z drobnoustorjami celem zachowania bezpiecznej pracy dla ludzi i środowiska.
Skutki działania drobnoustrojów są funkcją:
- Gęstości populacji
- Wrażliwości osób i stanu fizjologicznego organizmu
- Warunków środowiskowych.

Bezpieczeństwem pracy z mikroorganizmami zajmują się między innymi:
- WHO
- Międzynarowodowa Unia Towarzystw Mikrobiologicznych (JUMS)
- Federacja Europejskich Towarzystw Mikrobiologicznych (FEMS)
- Europejska Federacja Biotechnologów (EFB)
- Europejska Wspólnota Gospodarcza (EWG)
Obszary zainteresowań:
- Patogenność mikrobów
- Efekty toksyczne i uczuleniowe ich działania
- Skażenie środowisk naturalnych
- Inne zagrożenia

Grupy ryzyka mikrobiologicznego:
- Ryzyko mikrobiologiczne jest powodowane przeniknięciem mikrobów do otoczenia i jego zakażeniem bezpośrednim lub pośrendim.
- Ważne w jego ograncizaniu jest przestrzeganie zasad Dobrej Techniki Mikrobiologicznej (DTM)
- Wyróżnia się grupy ryzyka w zależności od patogennośći mikroorganizmów dla ludzi, zwierząt i roślin, szybkość rozprzestrzeniania się w środowisku oraz dostępnych metod leczenia.

Wirusy to CZĄSTKI INFEKCYJNE...

Grupa I – mikroby nie powodują chorób u ludzi, ale są potencjalnym zagrożeniem.
Grupa II – mogą być przyczyną zachorować, ale nie rozprzestrzeniają się w społeczeństwie, środowisku, zagrożenie potencjalne.
Grupa III – mikroby mogą powodować cieżkie schorzenia i stanowią istotne zagrożenie przez rozprzestrzenianie się, np. Bacillus anthracis, psuedomonas, yersinia pestis (dżuma), brucella sp. (brucelowa) czy też wirus pryszczycy.
Grupa IV – powoduje bardzo ciężkie schorzenia i zagrożenie życia, rozprzestrzeniające się w środowisku, trudno poddające się leczeniu (brak antidotum?): Ebola, Lassa, Marburg (gorączka krwotoczna), Clostridium botulinum (toksyna botulinowa), Ricinum communis (toksyna rycynowa).

Klasyfikacja laboratoriów:

Grupa ryzyka	Klasyfikacja	Przykłady	Mikroby
I – małe indywidualne i środowiskowe ryzyko	Podstawowe, Typ I	Nauczanie podstawowe	Drobnoustroje o małym zagrożeniu dla człowieka i środowiska
II – umiarkowane ryzyko indywidualne i ograniczone ryzyko społeczne (środowiskowe)	Podstawowe, Typ I (komory mikrobiologiczne i inne niezbędne urządzenia)	Nauczanie uniwersyteckie, publiczna służba zdrowia, podstawowa służba szpitalna	Bacillus cereus, staphylococcus aureus, candida albicans, aspergillus niger
III – Duże ryzyko indywidualne, niskie środowiskowe	Typ II – wyposażenie specjalistyczne	Specjalne laboratoria diagnostyczne	Brucella sp., Salmonella typhi, salmonella paratyphi, shigella dysenteriae, HIV
IV – duże ryzyko indywidualne i środowiskowe	Typ III – maksymalne zabezpieczenie w laboratoryjne wyposażenia i środki ochronne	Jednostki pracujące z groźnymi patogenami	Wirus Ebola, wirus Kongo, wirus gorączki Lassa

Zarys kursu podstawowego dla DTM:
*Problemy ogólne
1. Źródła zagrożeń
2. Zagrożenia laboratoryjne: biologiczne, chemiczne, fizyczne, a także pożarowe i elektryczne
3. Obowiązki i prawa obowiązków w zakresie DTM
*Czynności przygotowawcze:
1. Wyposażenie laboratoriów
2. Higiena osobista
3. Odzież ochronna
*Czynności przy prowadzeniu doświadczeń
1. Stosowanie pipet automatycznych lub wspomaganych mechanicznie;
2. Minimalizowanie tworzenia aerozoli
3. Właściwe korzystanie z boksów do prac mikrobiologicznych
4. Właściwa obsługa autoklawów i urządzeń sterylizujących
*Czynności ratunkowe
1. Pierwsza pomoc
2. Likwidowanie materiału, lokalne procesy, odkażania
3. Wypadki i przeciwdziałanie
*Ogólne przepisy laboratoryjne
1. Przechowywanie materiału stanowiącego zagrożenie
2. Transport materiału stanowiącego ryzyko mikrobiologiczne
3. Operowanie i opiekowanie się zwierzętami laboratoryjnymi
4. Kontrola występowania i przeciwdziałania obecnośći roztoczy, insektów, stawonogów itp.
*Procedura kontrolna
1. Dotycząca gospodarki odpadami: a) sterylizacji, b) spalania.
2. Procedura odkażania.

Polskie kolekcje mikroorganizmów – PCM.

Dwie firmy opanowały utrzymywanie szczepów aktywnymi przez długi czas: Novonordis i jakaś druga.

Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu zawiera największą polską kolekcję mikroorganizmów.

Zbiór szczepów bakteryjnych oraz bakteriofagów.
Zarejestrowana w Światowej Federacji Kolekcji Drobnoustrojów (WFCC, nr 106) oraz w Europejskiej Organizacji Kolekcji Drobnoustrojów.

Światowa Organizacja Własności Intelektualnej (WIPO – World Intellectual Property Organization).
W oparciu o istniejącą bazę kolekcji, kadrę naukową i możliwości techniczne, przyznała kolekcji PCM status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów postępowania patentowego (IDA – International Deposity Authority).
- Status krajowego organu deopzytowego.
- Ma w swoich zbiorach około 3000 szczepów bakteryjnych, szczególnie o charakterze medycznym, należących do 83 rodzajów i 298 gatunków, oraz szczepy patentowe.

Kolekcja zawiera szczepy do testowania aktywności antybiotyków, środków dezynfekcyjnych, mutagenów, lizozymyu, fagocytów, do testowania cytozyny, uracylu, witamin, do wiązania haptoglobin, szczepy wytwarzające antybiotyki, enzymy, białko A, etanol, substancje immunologicznie czynne, toksyny, witaminy, szczepy degradujące fenol, toluen, cyjanki i inne.

Szczepy w kolekcji weryfkuje się w zależności od potrzeb, na żywotność, stałość cech morfologicznych, fizjologicznych, genetycznych.
Materiał jest zabezpieczany przez liofilizację i głębokie zamrożenie. Inwentaryzacja jest prowadzona komputerowo i w rejestrze pisemnym.

Minimalna liczba próbek bakterii jaką powinien dostarczyć deponujący wynosi 10 próbek zliofilizowanych, na podłożu hodowlanym lub zamrożonych (po 0,5 ml), a w przypadku bakteriofagów co najmniej 10^9 pfu/ml, 10 x 1,0 ml lub 2 x 5 ml lizatu wolnego od komórek. Bakteriofagi należy dostarczać wraz z odpowiednim szczepem gospodarza.

Szczepy stosowane w produkcji preparatów farmaceutycznych"
Lactobacillus rhamnosus, streptococcus equisimilis.

Laboratoryjne szczepy bakterii patogennych:
Staphylococcus aureus

Zbiór szczepów bakterii mlekowych:
Bacillus subtilis ok. 100
Bifidobacterium longum
Enterococcus faecalis
Escherichia coli ok. 1000


Kolekcja szczepów bakteryjnych Narodowego Instytutu Leków w Warszawie.

Znaczenie kolekcji.
Jest unikatowym zbiorem tego typu nie tylko w skali kraju, ale i regionu Centralnej i Wschodniej Europy.
To jedyna kolekcja o takiej skali prowadzona na tym obszarze, w której znaczna część szczepów jest scharakteryzowana pod względem oporności na antybiotyki i chemioterapeutyki, a także zbadana metodami biologii molekularnej pod względem wzajemnego pokrewieństwa, posiadanych mechanizmów zjadliwości i oporności na leki.

Kolekcja liczy blisko 30000 izolatów.
- Międzynarodowe szczepy referencyjne (np do kontroli podłoży, antybiogramów, mechanizmów oporności, cech biologicznych);
- Szczepy pozyskiwane w ramach krajowych i międzynarodowych programów monitorowania tzw. Drobnoustrojów alarmowych tj. Szczególnie niebezpiecznych dla zdrowia publicznego.
- Szczepy izolowane z epidemii szpitalnych i pozaszpitalnych
- Szczepy z zakażeń bakteryjnych...

- Bezpieczństwo kolekcji zapewniane przez utrzymywanie kolekcji w głębokim zamrożeniu (-70 st. C), bankowanie szczepów w 2, a w części w 4 powtórzeniach (każde w innej zamrażarce), liofilizację szczepów najwrażliwszych i najcenniejszych, klimatyzację pomieszczenia zamrażarek, wykorzystanie systemów podtrzymywania temperatury poprzez rozprężanie CO2, monitorowanie zasilania, temperatury pomieszczenia oraz pracy zamrażarek przez system alarmowy powiadamiający pracowników o awarii.

Kolekcja drobnoustrojów przemysłowych Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej ŁOCK 105. (Macierzysty wydział profesora.)

Na zbiory Kolekcji składają się szczepy drożdży (280), grzybów strzępkowych (200) oraz bakterii (151). Zasoby te są sukcesywnie wzbogacane w nowe odmiany izolowane ze środowisk naturalnych.
Kolekcja ŁOCK 105 współpracuje z ośrodkami badawczymi, zakładami przemysłowymi i wyższymi uczelniami dostarcając je dla ich potrzeb technologicznych, badawczych i dydaktycznych.

Ostatnia: Kolekcja Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie.

Kolekcja Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych powstała w 1950 r.
2500 kultur drobnoustrojów, głównie o znaczeniu przemysłowym.
Rolą kolekcji jest przechowywanie drobnoustrojó w warunkach zapewniających im wysoką przeżywalność i zachowanie właściwości metabolicznych, za które są cenione.
Kolekcja przechowuje drożdże winiarskie, piwowarskie, gorzelnicze, piekarskie i paszowe, grzyby strzępkowe wytwarzające m. in. enzymy proteolityczne, lipolityczne, pektynolityczne, celulolityczne, glukoamylazę i inne.
Bakterie fermentacji mlekowej, octowej, dekstranotwórcze, izolaty środowiskowe, mikroorganizmy zakażające żywność.

Wszystkie 2500 zidentyfikowano metodami mikrobiologii klasycznej. Identyfikacja powinna być potwierdzona metodami molekularnymi. Na identyfikację i włączenie do kolekcji czeka ponad 500 liofilizatów.

Kolekcja IBPRS na mocy porozumienia z Urzędem Patentowym z 1993 posiada uprawnienia Krajowego Organu Depozytowego, ale nie chorobotwórczych.

Biotechnolodzy i mikrobiolodzy zobowiązani są do stosowania sprawdzonego materiału biologicznego, jakim są szczepy mikroorganizmów przechowywane w odpowiednich warunkach.
Wartością są nie tylko sczepy przechowywane w kolekcji, ale również informacje o ich dostępności.

Globalna Sieć Informacji o Bioróżnorodności GBIF – Global Biodiversity Information Facility.

Podstawowe cele:
- Zgromadzenie istniejących na świecie danych o bioróżnorodności w jednym spójnym ogólnoświatowym systemie
- Opracowanie i wdrożenie standardów dotyczących danych o bioróżnorodności oraz sposobów ich prezentacji
- Udostępnienie światowych danych o bioróżnorodności wszystkim zainteresowanym odbiorcom (w tym przede wszystkim placówkom naukowym).
- Portal internetowy GBIF (http://www.gbif.net) umożliwia przeszukanie niemal 126 milionów rekordów danych pochodzących z 201 źródeł informacji.
- Obecnie w GBIF uczestniczy 47 krajów i 35 organizacji, które we wspólnej deklaracji zobowiązały się udostępniać dane o bioróżnorodności.
- Polska przystąpiła do GBIF w marcu 2001 jako Członek Stowarzyszony.

Krajowa Sieć Informacji o Bioróżnorodności KSIB.
- Struktura otwarta, tzn. Może do niej należeć każda organizacja posiadająca dane o bioróżnorodności.
- Aktualnie zrzesza tylko 27 uczestników.

Przechowalnictwo mikroorganizmów – kolekcja czystych kultur.
Jakie są zadania takiej kolekcji?
- Przechowywanie kultur drobnoustrojów;
- Poszukiwanie nowych szczepów i ich ulepszanie;
- Klasyfikacja i identyfikacja drobnoustrojów;
- Badania nad doborem skutecznych metod przechowywania drobnoustrojów;
- Prowadzenie działalności usługowej dla nauki i przemysłu.

Szczepy stosowane do badań naukowych powinny być deponowane w kolekcjach kultur.
Przechowywane szczepy powinny być preparatami aktywnymi o stałych cechach fizjologicznych i produkcyjnych.
Pierwsza kolekcja powstała w 1904 roku w Holandii (Centraalbureau voor Schimmelcultures – CBS).
Światowa Federacja Kultur Drobnoustrojów (Japonia – World Federation of Culture Collections – WFCC)
WFCC zrzesza 60 krajów, razem 600 kolekcji.
Informacja o kolekcjach w katalogu WFCC (World Directory of Collections Cultures of Microorganism – WDCC)

(Po 250 mln lat dalej da się ożywić przetrwalniki niektórych bakterii.)

American Type Culture Collection (ATCC) gromadzi około 40 tys. Szczepów drożdży, bakterii i pleśni, powstała w 1925.
Northern Regional Research Laboratory w Preorii Illinois (USA). Około 80k szczepów drożdży, bakterii, grzybów, glonów.
Centraalbureau voor Schimmelcultures w Instytucie Naukowym Królewskiej Akademii Nauk i Sztuki w Holandii też ma sporo.

The Department of Culture Collection Rosyjskiej Akademii Nauk Pushchino ok. 6K szczepów drożdży, bakterii i grzybów strzępkowych.

Europejski projekt bazy danych Microbial Information Network Europe (MINE)
- Zunifikowanie danych, ujednolicenie programów komputerowych i komend dla przeszukiwania baz, ułatwia wymianę informacji między kolekcjami.
Pełny zestaw informacji o szczepie obejmuje:
- Nazwę (name)
- Informacje wewnętrzne (internal administration)
- Status
- Informacje podstawowe (strain administration)
- Środowisko i historię szczepu (environment and history)
- Oddziaływania biologiczne (biological interactions)
- Genotyp i genetyka (genotype and genetics)
- Inne właściwości (properities)
- Płciowość (sexuality)
- Warunki hodowlane (growth conditions)

- Właściwości chemiczne i enzymatyczne (chemistry and enzymes)
- Zastosowanie praktyczne (practical applications)

Drobnoustroje przemysłowe oceniane są na podstawie wydajności i szybkości tworzenia produktu, szybkości wzrostu, stabilności genetycznej i fenotypowej, wymagań pokarmowych i tolerancji na warunki środowiska, a także czystości produktu i łatwości jego wydzielania.

Przechowalnictwo!
Cel: zabezpieczenie szczepów pod względem czystości mikrobiologicznej, maksymalnej żywotności, stabilności cehc fizjologicznych i genetycznych.

Stosowane metody powinny zapewnić:
- Wysoką wydajność produktu
- Powtarzalność procesu
- Maksymalną przeżywalność
- Przeciwdziałanie spontanicznym mutacjom,
- Ograniczenie przypadkowego zanieczyszczenia i uszkodzenia komórek.

Nie ma uniwersalnej metody przechowywania drobnoustrojów.
Szczególnie cenne szczepy wymagają opracowania indywidualnych metod.

1. Okresowe przesiewy mikrobów na pożywki stałe lub plynne, przechowywane w temp. 4 st. C
Wady:
- Może wystąpić zmiana morfologii i biochemii
- Częste przeszczepy stwarzają ryzyko zanieczyszczenia
- Ryzyko pojawienia się niekorzystnych mutantów

2. Skosy agarowe zalewane jałową parafiną (1 warstwa)
- Zapewnia warunki beztlenowe, ogranicza metabolizm i zanieczyszczenia
- Metoda zalecana szczególnie dla drożdży, które mogą zachować żywotność i stabilność nawet do 2 lat.

3. Kultury suszone – polecane szczególnie dla grzybów strzępkowych.
- Suszenie pod normalnym lub obniżonym ciśnieniem w obecności czynnika pochłaniającego wodę, np. Tlenku fosforu V
- Suszenie na drodze sublimacji ze stanu głębokiego zamrożenia
- Suszenie bezpośrednio na podłożu wzrostowym – grzyby strzępkowe i promieniowce, obficie wytwarzające spory

3a. Przechowywanie kultur suszonych w postaci konidiów, skosów lub innych podłóż wzrostowych.
3b. Przechowywanie kultur suszonych po wymieszaniu z jałowym piaskiem, glebą, żelem silikonowym lub węglem aktywnym (nawet do paru lat).
3c. Rozprowadzenie spor w jałowej wodzie destylowanej, wprowadzenie do jałowej gleby lub gleby z piaskiem kwarcowym i suszenie w temp. Pokojowej (ok. 24 st. Celsjusza, 1 miesiąc).
- Probówki zatopić w płomieniu palnika lub korek i stearyna i przechowywać w 4 st. C.
- Zawiesinę drobnoustrojów nanieść na odpowiedni nośnik (piasek, kulki szklane, paski bibuły) i wysuszyć w eksykatorze pod próżnią.

4. Kultury liofilizowane.
Liofilizacja składa się z dwóch etapów:
- Oziębianie i zamrażanie zawiesiny komórek (-70 st. C)
- Suszenie w wysokiej próżni (sublimacja wody) do zawartości wody około 1%.
Niewielka ilość wody chroni substancje białkowe przed degradacją i stanowi warunek dobrej żywotności.
Tlen działa toksycznie na zamrożone komórki. Po zamrożeniu trzeba szybko sublimować.
Proces liofilizacji wywołuje stosunkowo duży efekt letalny, należy używać biomasę z fazy wzrostu stacjonarnego, o dużej gęstości – oraz dodawać związków ochronnych (dimetylosulfotlenek, glicerol w stężeniu do 10%, surowicę końską, odtłuszczone mleko, sacharozę)
- Liofilizaty przechowuje się w około 4 st. C.
Uwaga. Komórki dobrze przeżywające liofilizację nie zawsze stanowią dobry materiał do procesów biotechnologicznych.
Przykładem protektora jest cukier – trehaloza.

5. Przechowywanie kultur w stanie zamrożenia.
- Metodę stosuje się najczęściej do kultur niewytwarzających zarodnikow lub słabo przeżywających w procesie liofilizacji.
a. Przechowywanie w chłodniach (-20 do -70 st. C)
b. Przechowywanie w ciekłym azocie (-196 st. C)

Zawieszenie komórek z fazy wzrostu wykładniczego, w roztworach ochronnych i przeniesienie do plastikowych ampułek lub fiolek po 1 cm sześcienny, które po zatopieniu się zamraża.
Oprócz ampułek i fiolek stosuje się propylenowe lub szklarne kapilary (słomki), jako minipojemniczki do jednorazowego użycia.

Strukturę komórek może zniszczyć formowanie kryształów lodu. Ważna jest szybkość zamrażania i reaktywacji komórek oraz stosowanie protektorów.
Substancje ochronne – protektory – to serwatka, bulion, mleko, pepton, żelatyna, surowica krwi, węglowodany (glukoza, sacharoza, laktoza, a najlepiej dekstran), roztwory aminokwasów, glicerol i inne.
Dekstran syntetyzowany przez leuconostoc mesenterioides lub dextranicus. Może być zamiennikiem osocza krwi.

Optymalna szybkość zamrażania jest zwykle różna dla różnych grup drobnoustrojów, zależna także od proporcji powierzchni do objętości komórki, zawartości wody oraz wrażliwości komórek na stężenie ekstraktu.
Po głębokim zamrożeniu komórki powinny być szybko ożywione (unikając rekrystalizacji lodu). Próbki po wyjęciu z zamrażarki powinny być umieszczone w łaźni wodnej o temp. 35-40 st. C.

Amoniak jako czynnik chłodniczy pozwala na otrzymanie -33 st. C.

Przygotowanie szczepionek przemysłowych
1. Namnożenie szczepow w optymalnych warunkach i uzyskanie dużej liczby aktywnych komórek.
2. Standaryzacja składu – dotyczy szczepionek wieloskładnikowych (zestawienie właściwych proporcji gatunków czy szczepów);
3. Zabezpieczenie żywotności komórek i ich właściwości biochemicznych poprzez odpowiednie jej utrwalenie – hodowla zagęszczona, suszona, powlekana lub zawiesina wodna, kultury na nośniku (piasek, węgiel aktywny, cytrynian wapnia), liofilizaty, zamrażanie.
4. Reaktywacja na odpowiednich podłożach hodowlanych.

Przykłady:
Szczepionki piekarskie (startery) – liofilizowane lub mrożone lactobacillus i s. Cerevisiae w proporcji około 100:1
Szczepionki mleczarskie w formie skoncentrowanej, liofilizowanej, w tabletkach, mrożonego granulatu lub odwirowane w odpowiednich środowiskach ochronnych.
- Przeżywalność komórek w liofilizatach wynosi 30 do 50%, a w preparatach zagęszczonych nawet 100%.
- W przemyśle mleczarskim kultury firmy Biolacta-Texal lub firmy Ch. Hansen (streptococcus thermophilus, Lactobacillus, bulgaricus, L. Acidophilus i bifidobacterium sp.)
Do innych procesów (kwasy, antybiotyki, preparaty enzymatyczne) na indywidualne zamówienie.
- Szczepionki dypu DVS (Direct Vat Set) w formie mrożonego granulatu lub liofilizatu.

Dążąc do unifikacji metod przechowywania można wymienić kilka ogólnych zasad:
- Dla drobnoustrojów zarodnikujących i przetrwalnikujących najkorzystniejsze są spory z 1-2 tygodniowej hodowli.
- Niezarodnikujące lub trudno sporujące – korzystniej przechowywać wegetatywne komórki pochodzące z fazy stacjonarnej. Strzępki grzybów i promieniowców trzeba mechanicznie pofragmentować, np. W homogenizatorze nożowym.
- Duże znaczenie ma optymalizacja składu podłoża stosowanego do namnażania drobnoustrojów przed i po przechowywaniu. Szczególnie te użyte do aktywacji szczepu mogą w istotny sposób wpływać na ujawnienie się jego cech technologicznych.

Do namnażania drobnoustrojów przed przechowywaniem zalecane są podłoża minimalne, uniemożliwiające zbyt obfity wzrost wegetatywny.
Celowe jest też stosowanie organicznych źródeł azotu w podwyższonym stężeniu, co sprzyja obfitej sporulacji; podobny efekt daje duże zasolenie podłoża, np. 2,5-5 g/l NaCl.
Spośród licznych sposobów przechowywania należy wyróżnić:
- Pasażowanie, czyli okresowe przeszczepianie na świeże podłoże. Dotyczy to przechowywania hodowli na skosach, jak i w podłożach ciekłych, w temperaturze +4 st. C lub pokojowej. Dopuszczalne jest też zalewanie warstwą jałowej parafiny odcinającej dostęp powietrza (zalecane zwłaszcza dla grzybów).

Do najważniejszych metod należą: suszenie ich w temperaturze powyżej 20 st. C, liofilizacja oraz zamrażanie.



Utlenianie biologiczne i przenoszenie energii w metabolizmie komórki drobnoustrojów.

Utlenianie biologiczne w komórce (lub z udziałem energii świetlnej) -> Energia -> Zmagazynowanie w komórce w postaci energii chemicznej (wiązania makroergiczne w ATP i ADP) -> Hydroliza reszt fosforanowych z ATP i ADP i uwalnianie energii – ilość energii zależna od pH i stężenia substancji reagujących. -> Zużycie energii w reakcjach endoergicznych.

Źródłem węgla dla zdecydowanej większości drobnoustrojów są najczęściej związki organiczne, węglowodany, ale każdy związek mający węgiel jest potencjalnie źródłem węgla. Drobnoustroje wykorzystujące węgiel w formie gazowej to autotrofy – nieliczne bakterie to potrafią.
Reszta to chemoorganoheterotrofy – grzyby i większosć bakterii.
Chemolitotrofy to bakterie metanowe, wodorowe, żelazowe, nitryfikująće, siarkowe niefotosyntetyzujące...

Wzrost drobnoustrojów w warunkach hodowli okresowej.
- Substraty dostarczane są jednorazowo w początkowej fazie procesu;
- W trakcie trwania procesu nie usuwa się ibomasy ani metabolitów, z wyjątkiem produktów gazowych (CO2).
- Wzrost nieograniczony (wykładniczy) występuje tylko w pewnym przedziale czasu w hodowli okresowej (faza wzrostu logarytmicznego).
1. Faza spoczynkowa (przygotowawcza):
Od wprowadzenia komórek do pierwszych podziałów lub pączkowania;
Liczba komórek nie wzrasta
Czas fazy jest krótki, gdy do takiego środowiska przeszczepia się komórki z fazy wzrostu wykładniczego.

2. Faza akceleracji – wzrost tempa namnażania komórek, intensywny metabolizm, duża wrażliwość komórek na czynniki zewnętrzne.

3. Faza wykładnicza (logarytmiczna)
- Nieograniczony wzrost
- Minimalnu czas generacji g i podwojenia biomasy td (dla prokariotów 15-60 minut, dla eukariotów 90-120 minut). Maksymalna właściwa szybkość wzrostu mi.

(Pytanie na wzór użytkowy na mi może się pojawić na egzaminie.)

4. Faza opóźnienia (wzrostu opóźnionego) – zwolnienie tempa wzrostu na skutek zmniejszenia się stężenia substratów i gromadzenia szkodliwych metabolitów. Pod koniec fazy liczba komórek i biomasy siągają wartości maksymalne. Początek zamierania podziałów i pączkowania.

5. Faza stacjonarna (zastoju) – dalsze działanie czynników ograniczających tempo wzrostu. Tempo przyrostu komórek równoważone szybkością ich zamierania (równowaga dynamiczna). Maksymalne stężenia biomasy (czyli plon biomasy).

6. Faza letalna (zamierania). Więcej komórek obumiera niż powstaje młodych. Możliwa jest autoliza komórek – wydzielanie enzymów komórkowych. Dalsze zmiany składu chemicznego roztworu (niekorzystne). Faza przyspieszenia i opóźnienia może być włączona odpowiednio do fazy zastoju i stacjonarnej.
Hodowle okresowe są najczęściej stosowane w laboratoriach i przemyśle biotechnologicznym – winiarstwo, browarnictwo, drozdżownictwo, gorzelnictwo, mleczarstwo.

Uproszczony model wzrostu populacji drożdży:
Komórka macierzysta -(czas generacji, substraty)-> komórka macierzysta + komórki potomne.

Dla drożdży pączkujących licza pokoleń (n) liczona jest w linii najstarszej komórki potomnej.

W odniesieniu do bakterii czas generacji jest równy wiekowi osobniczemu komórek (długość życia jednego pokolenia).

Komórka macierzysta bakterii dzieli się na dwie potomne (w hodowli obecne 2 równieśnicze komórki tej samej generacji).
Komórka macierzysta drozdży po wypączkowaniu jest zdolna do dalszego rozmnażania (jednocześna obecność w hodowli komórek z różnych pokoleń).

Uproszczony (teoretyczny) model wzrostu populacji bakterii:

Komórka macierzysta -(czas generacji, substraty)-> 2 kom. Potomne.

Warunki wzrostu:
- źródło węgla – najczęściej związki chemiczne, węglowodany. Bakterie autotrofowe i fotosyntetyzujące mogą też z CO2. Względne tlenowce włączają około 10% węgla z substratu do materiału komórkowego w procesie beztlenowym, a w tlenowym 50-55%. Przyjmując 55% węgla w s.s. Komórki, możemy wyliczyć ilość C w pożywce.

Przyjmująć 40g/dm3 suchej substancji komórek, którą chcemy uzyskać w procesie tlenowym, ilość niezbędnego węgla będzie wynosić 40/2 * 100/50 = 40 g

W 40g s.s. Jest 20g węgla. Jeśli 20 g C, to w pożywce musi być 20 x 2 = 40 g.
Jeśli C w postaci heksozy to 40 x (180/72) = 100 g/dm3 C.

Pożywki i podłoża organiczne (naturalne i syntetyczne), pożywki i podłoża mineralne, pożywki ciekłe: koloidalne, zawiesiny i emulsje (n-alkany), roztwory pożywek tworzą układy cieczy nienewtonowskich (komplikacje z modelowaniem, obliczaniem np. Stopnia natlenienia, mocy mieszania, współczynnika przenoszenia tlenu).

Do biosyntez najczęściej wykorzystuje się melasę. Innymi często stosowanymi pożywkami ciekłymi są brzeczka, wyciąg z mąki sojowej i kukurydzianej, bulion, serwatka i mleko, ługi posiarczynowe i n-alkany (C12-C20), ścieki przemysłowe i gnojowica, specyficzne pożywki złożone do hodowli komórkowych i tkankowych.

6. Podłoża stałe
– odpady przemysłu spożywczego (wysłodki buraczane, młóto – największy odpad przy produkcji piwa – rozdrobniony jęczmień, kwasy tłuszczowe), rozdrobnione ziemniaki, zboża, kukurydza, plewy, otręby pszenne i inne.
- Specyficzne podłoża syntetyczne.

Źródło azotu:
- Amoniak lub sole amonowe
- Azot organiczny (aminokwasy, związki purynowe, pirymidynowe, witaminy)
- Najtańszym źródłem azotu jest mąka sojowa i arachidowa, mączki mięsne i rybne, wyciągi z kiełków słodowych lub drozdży, serwatka, kazeina i różne hydrolizaty enzymatyczne produktów bogatych w białka.
- Azot stanowi 10% suchej substancji większości organizmów i stąd można obliczyć minimalną zawartość azotu w pożywce.
- Forma dostarczonego azotu zależy od rodzaju hodowlanych organizmów, kosztów i celu fermentacji.

Źródło soli mineralnych – składniki niezbędne do wzrostu.
- Fosfor, potas, siarka, magnez stanowia główne skłądniki nieorganiczne pożywek drobnoustrojów.
- Metale śladowe – żelazo, miedź, cynk, mangan, kobalt, molibden.
- Źródła: woda, pożywka oraz inne dodatki.

Skład pożywek ustalany jest empirycznie i doświadczalnie.
Podstawowymi składnikami są węgiel, azot i fosfor, makro- i mikroelementy oraz witaminy i inne biostymulatory wzrostu.
Ważny jest stosunek zawartości C:N:P, np. W biomasie drożdży 6:1:0,2 i podobny w pozywce hodowlanej, w oczyszczaniu ścieków – metodą osadu czynnego i złóż biologicznych C:N:P = 106:16:1 lub P:N:BZT5 = 1:3:45.

Około 40 pierwiastków potrzeba do odżywiania drobnoustrojów.

Sześć niemetali (C, O, H, N, P, S) i dwa metale (K i Mg) stanowią średnio 98% s.s. Bakterii i grzybów. To tzw. Makroelementy.

Skład pożywek i podłóż hodowlanych ustalany jest głównie na podstawie skłądu biomasy drobnoustorjów, które mają być na niej hodowane.
W warunkach tlenowych masę źródła węgla można wyliczyć na podstawie współczynnika Wydajności komórek W: W = sucha substancja komórek/zużyty substrat (źródło węgla)

W przypadku bakterii W dla glukozy wynosi około 0,5 (z 1 g glukozy otrzymuje się 0,5 s.s. Komórek)
Ilość glukozy niezbędna była do otrzymania np. 30 g s.s. Komórek z 1 dm^3 pożywki będzie równa 30:0,5 = 60 g/dm^3 pożywki.

Bakterie fermentacji mlekowej.
Morfologia i fizjologia:
- Niejednorodna grupa beztlenowców z sekcji 12 (Bergey) – ziarniaki (nieprzetrwalnikujące)
- Gramdodatnie ziarniaki należące do rodzajów Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus.
- Gramdodatnie, nieprzetrwalnikujące pałeczki regularne z sekcji 14, z rodzaju Lactobacillus.
- Gramdodatnie, nieprzetrwalnikujące pałeczki nieregularne z sekcji 15, z rodzaju Bifidobacterium.
- Względne beztlenowce, produkujące od 0,6 do 3% kwasu mlekowego.

- Fermentacja mlekowa to proces przemiany cukrów do kwasu mlekowego, kwasu octowego, aldehydu octowego, etanolu, CO2, acetoiny, diacetylu i butanodiolu.

Kwas mlekowy: CH3-CHOH-COOH

Diacetyl: CH3(C=O)(C=O)CH3
Acetoina: CH3CH(OH)(C=O)CH3

Butanodiol: 2,3-butylenoglikol.
CH3CH(OH)CH(OH)CH3

Bakterie kwasu mlekowego heterofermentatywne dają mnóstwo produktów ubocznych, dlatego nadają się bardziej do udoskonalania produktów mleczarskich. Do produkcji kwasu mlekowego najlepiej użyć homofermentatywnych.

Homofermentatywne: L. Lactis, L. Delbrueckii, L plantarum, L. Acidophilus, Streptococcus thermophilus, L. Bulgaricus, L. Helveticus.
Heterofermentatywne:
L. Mesenteroides, L. Brevis, L. Fermentum, Lactococcus lactis ssp. Lactis var. Diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. Cremoris.
Zdolność do wytwarzania laktozy jest limitowana obecnością enzymu beta-galaktozydazy.yk

W Polsce popularnym podłożem jest melas – rozcieńczona brzeczka, kilkanaście % cukru.
Dla szczepów termofilnych biosynteza przebiega w temperaturze 45-60 st. Celsjusza.

Dekstran jest zamiennikiem osocza krwi w medycynie.
L. Dextranicus potrafi go wytwarzać.

(Kiedy na egzaminie pada pytanie o cechy technologiczne, fizjologiczne i inne bakterii, trzeba koniecznie wspomnieć tak o wadach, jak o zaletach!)

Homofermentacja przemienia glukozę w szlaku EMP (Meinhoffa-Parnassa) z wytworzeniem kw. Mlekowego (90%) i niewielkiej ilości ubocznych metabolitów dwuwęglowych oraz CO2.
Heterofermentacja przemienia glukozę w szlaku fosfokatalazy pentozowej, który jest odgałęzieniem cyklu heksomonofosforowego (HMP).
Powstają: kwas mlekowy, diacetyl, aldehyd octowy, kwas octowy, alkohol etylowy, CO2.

Zarówno produkcja, jak i modyfikacja produktu spożywczego (można powiedzieć – biotransformacja).

Probiotyki – produkty zawierające żywe mikroorganizmy, które dodatnio wplywają na zdrowie ludzi i zwierząt.
Przeciwdziałają rozwojowi patogenów, zużywają składniki odżywcze niezbędne dla innych mikroroganizmów, wydzielają cyznniki hamujące rozwój drobnoustrojów – bakteriocyny
Aktywują system odpornościowy. Oddziaływują korzystnie na metabolizm cholesterolu i rozkład czynników antyżywieniowych.
Ułatwiają przekształcanie prokarcinogenów i obniżają aktywność enzymów katalizującyhc powstawanie karcinogenów.
Mogą dostarczać do organizmu laktazy i w ten sposób ułatwiają spożywanie i trawienie laktozy.

Przykładem takich szczepów są lactobacillus acidophilus, bifidobacterium bifidum i longum – stanowią one stały składnik mikroflory przewodu pokarmowego człowieka.
Zarówno forma L jak i D kwasu mlekowego jest człowiekowi przyjazna.
L. Acidophilus..
... dobrze rozwija się w pH 4-5 lub niższym i w temp. Około 45 st. Celsjusza.
Naturalnie występuje w wielu produktach żywnościowych – mleko i przetwory.

Fermentowane napoje mleczne i sery: Streptococcus – lactis, diacetilactis, cremoris, thermophilus.
Leuconostoc – cremoris, mesenteroides, citrovorum
Lactobacillus – acidophilus, bulgaricus, brevis, caucasicus, helveticus, plantarum
Fermentowane produkty roślinne – różne gatunki paciorkowców i pałeczek w tym l. Mesenteroides, l. Brevis, l. Fermentum, l. Plantarum, pediococcus damnosus (syn. P. Cerevisiae)
Fermentowane produkty mięsne – rodzaje: lactobacillus, micrococcus, pediococcus, streptococcus (a także inne liczne bakterie, w tym Aerobacter, Bacillus, Staphylococcus, Vibrio oraz grzybów: Debaryomyces, Penicillium)
Kwas mlekowy: Lactobacillus delbrueckii, bulgaricus, leichmanii
Dekstran: Leuconostoc mesenteroides
Nizyna: Streptococcus Lactis
Preparaty lecznicze: Lactobacillus acidophilus, bifidus

Kwas jabłkowy: CO(OH)CH2CH(OH)COOH przemeinia się w mlekowy z wydzieleniem CO2. Nazywa się to biologicznym odkwaszaniem – mocniejszy kwas ulega przemianie w słabszy kwas.

Do pH 4,5 żywność prawdopodobnie wystarczy spasteryzować. Powyżej – sterylizować.

Prebiotyki to substancje obecne lub wprowadzane do pożywienia w celu stymulacji rozwoju prawidłowej flory bakteryjnej jelit.
Preparaty prebiotyczne nie zawierają żadnych mikrobów, a jedynie substancje stymulujące ich rozwój, np. Białka, tłuszcze, oligosacharydy lub polisacharydy, które nie ulegają trawieniu i w formie niezmienionej docierają do światła jelita.

Mają korzysty wpływ na organizm człowieka: pprawiają wchłanianie jonów wapnia, magnezu, żelaza. Zwiększają aktywność korzystnej mikroflory jelitowej, zapobiegają rozwojowi chorobotwórczych.
Do prebiotyków należą np. Oligofruktoza oraz inulina.
W stanie naturalnym występują w korzeniach lub bulwach niektórych roślin, np. Topinambur, cykoria..
Łagodnie słodka w smaku, posiada około 1/100 słodyczy sacharozy.
Wykazuje dobroczynny wpływ na organizm – mniejsze wchłanianie tłuszczów, łatwiejsze trawienie w przypadku diet wysokobiałkowych, obniża pSzerokie wykorzystanie w przemyśle spożywczym:
Może być stosowana przez diabetyków i osoby odchudzające się, doskonały zagęstnik zup i sosów, nadaje kruchość i przedłuża świeżość ciast i ciastek, może zastępować skrobię i tłuszcz w produktach deserowych, np. Kisiel czy budyń.
Jest dobrym stabilizatorem emulsji, np. Majonezów.

Pozyskiwanie i doskonalenie mikroorganizmów.

1. Metody klasyczne – procesy biotechnologiczne z udziałem drobnoustrojów izolowanych ze środowisk naturalnych. Albo procesy z udziałem szczepów modyfikowanych.

1.1. Mutacje
Mutant – komórka o zmienionym genotypie
Mutageneza – proces prowadzący do powstania mutanta
Mutacja spontaniczna – pewna liczba mutacji powstaje w warunkach naturalnych. Liczba mutantów w populacji (10^-4 do 10^-11) zależy od warunków środowiska, wieku populacji itp.

Mutacje indukowalne – przez działanie mutagenami.
_ Punktowe – zmiany pojedynczych zasad: tranzycja, transwersja. Są odwracalne.
- Delecje – utrata jednej lub większej liczby zasad w DNA.
- Insercje – wstawienie jednej lub większej liczby zasad w jeden lub więcej genów.
Mogą powodować wytworzenie białka niefunkcjonalnego lub białka o obniżonej aktywności.

To główna droga pozyskiwania wydajnych szczepów.
Do produkcji penicyliny stosuje się mutanty dzikiego szczepu Penicillum chrysogenum Q-176.
Podstawowy aminokwas w żywieniu zwierząt i człowieka, L-lizyna syntetyzowany przez mutanta bakterii corynobacterium glutamicum z 30% wydajnością. Znaczna nadprodukcja lizyny przekracza potrzeby metaboliczne bakterii.
Dwa typy mutantów:
1. Mutacja genu kodującego dehydrogenazę homoserynową. Mutacja wyeliminowała enzym i zahamowała wytwarzanie treoniny.
2. Poprzez mutację kinaza asparaginowa utraciła zdolność do reagowania na inhibicję ze strony L-lizyny i w płynie pohodowlanym gromadzą się duże ilości tego aminokwasu.
Poprzez mutacje pozyskuje się wydajne szczepy drobnoustrojów do biosyntezy aminokwasów, alkoholi, kwasów organicznych, substancji wzrostowych i innych metabolitów.

Na egzaminie będzie też fuzja protoplastów.

Protoplasty grzybów – sok żołądkowy ślimaka Helix pomatia lub enzymy lityczne wytwarznae przez drobnoustroje z rodzajów Cytophaga, Arthrobacter.

Podczas kontaktów następuje przemieszczenie i agregacja cząśtek białkowych w błonie cytoplazmatycznej, fuzji sprzyja pH=0,9 oraz Ca2+
Podczas fuzji protoplastów powstaje układ heterokariotyczny, w którym następuje kariogamia i rekombinacja. W następstwie samorzutnej lub indukowanej haploidyzacji, następuje segregacja nowych genotypów.
Nowe genotypy protoplastów inkubuje się w odpowiedniej pożywce w celu regeneracji ściany kom. I otrzymywania pełnowartościowych komórek.
Efektywność procesu fuzji zwiększają elektrycznei mpulsy rzędu kilku kV/cm (elektrofuzja).

Selekcja rekombinantów wymaga genetycznie trwałych markerów fizjologicznych. Najczęściej do hybrydyzacji używa się szczepów o różnych wymaganiach pokarmowych, opornych na określony antybiotyk itp.
Nowe metody sleekcji na specjalnych pożywkach wykorzystuje się naturalne właściwości szczepów – czynnik killerowy, pigmentacja itp.
Zastosowanie fuzji protoplastów pozwala na rekombinację wewnątrz – jak i międzygatunkową i ma doniosłe znaczenie w badaniach technologicznych oraz praktycznym wykorzystaniu szczepów.

Technologia rekombinacyjna DNA – możliwość uzyskania drożdży i bakterii syntetyzujących białka ludzkie (interferony, insulinę, rakowy czynnik nekrotyczny) i inne.
Somatotropina – hormon wzrostu – zbudowano sztuczny gen, który wklonowano do plazmidu i wprowadzono do E. coli – umożliwia produkcję hormonu w ilości nawet 2 mg/dm3
Somatotropina jest polipeptydowym hormonem wytwarzanym przez przysadkę mózgową (19 aminokwasów). Jeśli jest go za mało, mamy karłowatość.
Insulina – wytwarzana przez trzustkę, reguluje metabolizm węglowodanów u człowieka. Insulina pochodzenia zwierzęcego jest mniej efektywna niż ludzka.
Insulina – Gensulin, rekombinowany szczep E. coli (Bioton S.A. 2002, około 12% rynku). Teraz pojawiły się lepsze preparaty, tak szybkie, jak i wolne.

Aktywna insulita składa się z polipeptydów A i B połączonych mostkiem -S-S-
Zsyntetyzowano chemiczne geny odpowiedzialne za produkcję polipeptydów A i B.
Syntetyczne geny wklonowane do plazmidu w taki sposób, aby znalazły się za aktywnym promotorem E. Coli i poprzedzały gen, którego ekspresja była kontrolowana tym promotorem.
W wyniku transkrypcji i translacji sztucznego genu otrzymuje się białko, którego fragment stanowi polipeptyd A lub B insuliny.
Białka fuzyjne A i B produkowane są w oddzielnych hodowlach E. Coli i po ich izolacji odszczepia się fragmenty A i B.

Rekombinacja szczepów w biotechnologii.
Komórki Lactococcus lactis ssp. Lactis zawierają plazmid z wklonowanym fragmentem genu
Technika rekombinacji DNA w laboratoriaoch jest powszechnie stosowana do ulepszania szczepów Bacillus subtilis i zwiększonej produkcji (wydajności) m. in. amylaz, glukanów, proteaz, lipaz, celulaz. Cecha ta jest jednak nietrwała i po krótkim czasie wydajność znów spada.

Metody kontroli zanieczyszczeń mikrobiologiczncyh w przemyśle spożywczym.
Tradycyjne:
- Płytkowa metoda posiewów -w prowadzenie do jałowej pożywki na płytce określonej ilości badanej próbki lub wymazu z odpowiednich rozcieńczeń. Określa się ogólną liczbę drobnoustrojów, liczbę drożdży, pleśni lub bakterii.
- Metoda tamponowa – badanie zanieczyszczeń dużych powierzchni – beczki, kadzie, kontenery, przewody, zawory, uszczelki, nawet ręce pracowników.
- Wypłukiwania – badanie mikroflory opakowań (butelki, słoje, konwie, elementy linii technologicznych)
- Metoda odciskowa – do oznaczania zanieczyszczeń folii, pergaminów, wieczek, korków i drobnych przedmiotów. Polega na odciśnięciu badanych materiałów na powierzchni podłoża agarowego.

Metoda bezpośrednia – wprowadzenie do badanego naczynia upłynnionej pożywki agarowej, rozprowadzenie równą warstwą po wewnętrznej pożywki i po jej zasytygnięciu zamknięcie, inkubacja.
Metoda filtrów membranowych – przesączenie okreslone objętości badanego płynu przez filtr 0,2-0,4 mikrometra. Filtr umieszcza się na powierzchni płytki Petriego.
Gotowe zestawy z podłożami na plastikowych paskach. - Pobieranie prób poprzez odciśnięcie paska na powierzchni pożywki wymazem z waty lub zanurzenie paska w badanej próbce, na 3-4 sek. Paski inkubuje się w odpowiednich fiolkach.
Gotowe płytki plastikowe (petrafilm) zawierajace gotowe pożywki przykryte są folią polietylenową. Posiew za pomocą pipety.

Klasyczne techniki liczenia iidentyfiakcji na płytkowej hodowli Kocha
- Posiew klasyczny
- Automatyczny posiew na ruchomą płytkę Petriego (technika płytek spiralnych)
- Nanoszenie próbki na płytki kroplami (metoda kropelkowa)
- Hodowla na wewnętrznych ścianach probówek.

Podłoża i techniki
- Brzeczkowe
- Jw, z dodatkiem aktidionu
- Gotowe testy – paski adhezyjne
- Oznaczanie epifuorescencji mikroorganizmów na membranie filtracyjnej DEFT (Direct epifluorescence technique)

Analizy jakościowe
- Test odporności na temperaturę
- Różne podłoża diagnostyczne
- Oznaczanie aktywnośći esteraz w oparciu o reakcje biochemiczne zachodzące w komórkach, które powodująrozpad substratów (dioctan fluoresceiny) z uwodnieniem barwnej fluoresceiny (pomiar fluorescencji)
- Testy immunofluorescencyjne – użycie specyficznychc przeciwiciał i połączenie ich z immunoglobulinami znakowanymi barwnikami (fluoresceina, rodamina) umożliwia rozróżnianie w mikroskopie fluorescencyjnym...



Metody turbidymetryczne – pomiar ilości światła zaabsorbowanego przez zawiesinę drobnoustrojów (spektrofotometry).
Nefelometria – pomiar natężenia światła rozporszonego w zawiesinie drobnoustrojów (nefelometry)
Zawartość pirogronianu – aktywność biochemiczną mikroorganizmów określa się poprzez pomiar metabolitów. Wykrozystuje się redukcję kw. Pirogronowego do mlekowego z udziałem dehydrogenazy mleczanowej. Do klasyfikacji mleka, w którym kontrolne stężenie pirogronianu wynosi 0,5 ppm, a w skażonym 3-30 ppm.

Monitorowanie skażeń z zastosowaniem bioluminescencji – opiera się na pomiarze stężenia ATP, który występuje we wszystkich żywych organizmach orślinnych, zwierzęcych i drobnoustorjach, gdzie pełni rolę akumulatora energii.
Zakleżność pomiędzy poziomem biologicznego zaneiczyszcenia a ilością ATP mierzy się z zastosowaniem substratu i enzymu – lucyferyny i lucyferazy świetlika (Photinus pyralis).
Intensywność światła jest równoważna do ilości ATP, a zatem i do liczby żywych komórek w analizowanej próbie.
Lucyferyna + ATP + Mg2+ -(lucyfereaza)-> Utleniona lucyferyna + AMP + CO2 + hv

Wynik pomiaru podawany jest w jednostkach RLU (relative Light Unit – względne jednostki świetlne).

Określenie zawartości adenyozynotrifosforanu. Całkowita zwartość ATP w komórkach drożdży wynosi 10^-12 g na komórkę.
Jeden wyemitowany foton odpowiada 1 cz. ATP.
Wynikiem reakcji kompelksu enzym-substrat jest przekształcenie energii chemicznej ATP w kwant światła.
Intensywność światła jest proporcjonalna do zawartości ATP, a więc ilości metabolicznie aktywnych komórek w próbce.
Technika bioluminescencji pozwala wykryć już 10^-13 g ATP, co odpowiada około 10 komórkom drożdży.

Moduły elektrometryczne (impedymetryczne, kodunktometryczne0
- Pomiar wzrostu przewodnictwa i spadku oporu elektrycnzego środowiska w wyniku zmiany substancji obojęncyh elektrycznie w jonowe, na skutek rozwoju drobnoustrojów.
- Zmneijszenie impedancji (zmiana oporu w czasie0 mierzy się za pomocą impedymetrów.
- Czas detekcji (od początku pomiaru do momentu zmian właściwości elektrycnzych) jest odwrotnie proporcjonalny do skażenia środowiska.

PFGE – elektroforeza pulsacyjna (pulse-field gel electrophoresis)
Elektroforeza żelowa w polu pulsującym. Rozdział chromosomów na żelu i poddanie ich działaniu zmiennego pola elektrycznego. Powstające prążki stanowią elektroforetyczny kariotyp danego mikroorganizmu.
PCR – polymerase chain reaction.
- Termiczna denaturacja DNA
- Asocjacja starterów z matrycą
- Polimeryzacja DNA – polimeraza
- Terminacja.

RAPD – random amplified polymorphic DNA.
- Ekstrakcja DNA
- Powielanie PCR przy odpowiednim starterze
- elektroforeza na żelu agarozowym
- Wybarwienie i obserwacja w UV

RFLM (restriction fragment length polymorphism)
- Rozdział fragmentów restrykcyjnych DNA na żelu, denaturacja i przeniesienie na bibułę nitrocelulozową
- Hybrydyzacja DNA z wyznakowanym, komplementearnym do niego framgentem DNA
- Suszenei bibuły i autoradiografia na kliszy fotograficznej
- Identyfikacja pozycji radioaktywnego fragmentu.

Metody cytometryczne
- Cytometria przepływowa
Wiązka światła padająca na przepływające komórki ulega rozproszeniu. Na tej podstawie lub na połączeniu z pomiarem DNA i barwieniem fluorochromami określa się liczbę i rodzaj komórek.

Ciągły pomiar flokulacji w oparciu o prawo Lamberta-Beera.

Metody mikrokolorymetryczne – ilość ciepła wydzielana przez mikroby jest proporcjonalna do liczby komórek oraz intensywności ich wzrostu.

Metody prognostyczne.

Mikrobiologia prognostyczna to subdyscyplina mikrobiologii żywnośći zajmująca się opracowywaniem modeli matematycznych rekacji drobnoustrojów na określone warunki środowiskowe oraz weryfikacją ich zastosowania do przewidywania wzrsotu, przeżywalności i inaktywacji mikroorganizmów w żywności (definicja własna).

Główne przyczyny prowadzące do rozwoju tej gałęzi mikrobiologii.
- Preferencje konsumentów dla świeżych, mniej przetworoznych produktów żywnościowych, co spowodowało opracowanie nowych systemów utrwalania, polegającycn a zastosowanie szeregu czynników, które łącznie przedłużają trwałość żywności ("hurdle technology"). Istnieje więc konieczność ilościowego określenia efektów każdego czynnika dla zapewnienia bezpieczeństwa mikrobiologicznego żywności.
- Stosowanie systemu HACCP wymagającego dokonania analizy potencjalnych zagrożeń mikrobiologicznych i określania limitów krytycznych dla parametrów krytycznych punktów kontrolnych.
- Konieczność określania bezpieczengo okresu przechowywania różnych rodzajów produktów żywnościowych obecnych w handlu miezyanrodowym.
- Zmiana epidemiologii zatruć i zakażeń pokarmowych ze względu na pojawienie się zagrożenia nowymi rodzajami drobnoustrojów, wzrost handu międzynarodowego i zwięskzenie liczby osób o obniżonej odproności
- Konieczność szacowania ryzyka mikrobiologicznego w całym łańcuchu żywnościowym
- Powszechna dostępność mikrokomputerów.

Założenia.
- Mikrobiologia prognostyczna żywności jest oparta na założeniu, że reakcja populacji mikroorganizmów na czynniki środowiskowe jest powtarzalna i że poprzez określenie tych czynników jest możliwe, na podstawie dokonanych w przeszłości badań, określenie potencjalnego rozwoju lub inaktywacji mikroorganizmów.
- Prace w dziedzinie termobakteriologii zostały zapoczątkowane już 1950 przez Russella.
(...)


Zasady prognozowania
- Większość doświadczeń mających na celu opracowywanie modeli prognostycznych przeprowadzanych jest w płynnych podłożach wzrostowych, które nie odpowiadają warunkom środowiska żywności. Opracowane modele są następnie weryfikowane dla określonych produktów w czasie ich produkcji, przechowywania i dystrybucji.
- Konstrukcja modelu prognostycznego odbywa się w etapach:
Planowanie
Wykonanie doświadczeń i opracowanie wyników
Sformułowanie modelu matematycznego
Weryfikacja modelu dla warunków istniejących w żywności

Rodzaje modeli
1. Wzrostu mikroorganizmów
2. Inaktywacji
3. Zbiorcze

Możliwości zastosowania:
- Przewidywanie okresu przydatności do spożycia
- Prognoza bezpieczeństwa mikrobio produktów przy zmianie składu lub technologii produkcji
- Obiektywna ocena konsekwencji ewentualnych niezgodności w procesie produkcyjnym i przechowywaniu żywności,
- Tworzenie bazy dla opracowywania przewodników, norm, kryteriów,
- Wyznaczanie limitów krytycznych parametrów w krytycznych punktach kontrolnych systemu HACCP (Hazard Analysis of Critical Control Points)
- Narzędzie edukacyjne dla pracowników w przemyśle i handlu.

Mikrobio prognostyczna może stać się b. Istotnym narzędziem w projektowaniu nowych wyrobów, pozwalając na oszacowanie potencjalnych zagrożeń i zaproponowanie metod utrwalenia, a także określenie możliwości i warunków przechowywania.

Zastrzeżenia i wady modeli prog
- Uwzględnianie zbyt małej liczby czynników decydujących o rozwoju, przeżywalności lub inaktywacji mikrobów.
- Ograniczenie liczby determinantów uwzględniających czynniki wzrostu. Należy unikać sytuacji, gdy modele staną się zbyt skomplikowane.
- Brak zadowalającej zgodności (walidacji) do wynikó innych badań, szczególnie konkretnych produktów żywnościowych (modele dotyczą warunków laboratoryjnych)
- Modele tworzone są głównie dla mikroflory patogennej, a tylko niewielka ich ilość dotyczy drobnoustrojów powodujących zepsucie produktów.

Model Hauschilda – stosowany dla bakterii przetrwalnikujących.
Założenia: Pojedynczy przetrwalnik rozwinie się i będzie produkował toksyny w żywności. Wpływ środowiska na kiełkowanie przetrwalników jest silny.

P = (ln (n/q))/s
P – prawdopodobieństwo wytworzenia toksyny botulinowej
n – liczba próbek doświadczlanych
q – liczba próbek nietoksycznych
s – liczba przetrwalnikow w 1 próbie.

Na podstawie P obliczamy log 1/P, który odpowiada logarytmowi liczby przetrwalników niezbędnych do wytworzenia w produkcie toksyny.

Modele kinetyczne opisują wpływ stanu kultury bakteryjnej i warunków środowiska na kinetykę wzrostu mikroorganizmów, szczególnie na okres trwania logfazy i czasu generacji.
Ten model jest stosowany dla nieprzetrwalnikujących patogenów.
Wzrór Gompertza jako czteroparametrowa funkcja wzrostu:

Lt = A+C*e^(-e^(-B(t-M)))

Lt – logarytm liczby bakterii w czasie t [log(jtk/ml)]
A – logarytm początkowej liczby bakterii [log(jtk/ml)]
C – liczba log cykli wzrostu – asymptotyczna wielkość wzrostu
M – czas, w którym absolutna szybkość wzrostu jest max [h]
B – relatywna szybkość wzrostu w czasie M – log((jtk/ml)/h)

Model kinetyczny Belehradeka – określa wpływ temp. Na rozwój mikroorganizmów.

(k)^0,5 = b(T-Tmin), gdzie k to wsp. Szybkości wzrostu, b to wsp. Estymowany (nachylenie linii regresji), T – temp inkubacji [K], Tmin – minimalna temperatura wzrostu [K]

Model Arrheniusa:

ln k = ln A – Ea/RT
k – wsp. Szybkości wzrostu
A – parametr współzależny (do określenia)
R – stała gazowa (8,314 J K^-1 mol^-1)
T – temp inkubacji [K]
Ea = energia aktywacji.

Model Davey'ego (zmodyfikowany Arrheniusa)

ln(k) = Co + C1/T + C2/T^2 + C3*aw + C4*aw^2

k – wsp. Szybkości wzzrostu
T – temp. Inkubacji
aw – aktywność wody
C – współczynniki zależne (do wyznaczenia)

Modele wielomianowe, tzw. Powierzchni odpowiedzi (uwzględniają funkcje logistyczne + Gompertza i inne – bardziej złożone)

Modele inaktywacji cieplnej:

Logarytmiczny porządek obumierania:

dN/dt = k*N, gdzie N to liczba komórek przeżywających ogrzewanie w czasie t, k to współczynnik proporcjonalności, zaś dN/dt – szybkość inaktywacji.

Modele inaktywacji nietermicznej, np. Listeria monocytogenes w pH<5,5

t_4-D = m(pH-pH0)

Gdzie t to czas osiągnięćia 4-D (10^4 – krotnej) inaktywacji
pH0 – pH natychmiastowej inaktywacji otrzymanej przez ekstrapolację linii regresji dla t = 0.
m – nachylenie linii regresji.

Do pH 4,5 wystarczy pasteryzacja, powyżej – potrzebna już sterylizacja.

Korozje mikrobiologiczne i inne zagrożenia przemysłowe.
Pierwsze relacje pomiędzy mikrobami i materiałami – Pasteur (1882-1895), Koch (1843-1910).
1914-1928 wykazano m. In., że promieniowce z Actinomyces wykorzystują kauczuk naturalny jao źródło węgla.
1899-1968 - Bruno Schulze wprowadził pojęcie biologii materiałów.
1956-1988 – rozwój mikrobiologii materiałów technicznych.

Materiał od wpływem enzymów mikroorganizmów zostaje rozłożony na proste związki cehmiczne.

Mikrobiologiczna korozja materiałów nieorganicznych:
Materiał -(metabolity mikrobów)-> Procesy chemiczne wywołujące korozję

Ochrona – dodatki substancji antybakteryjnych (baktericydy) i przeciwgrzybowych (fungicydy) mikrobiocydy.

Mikroflora pleśniowa w budynkach:
Źródła mikroflory:
- Zarodniki i konidia drobnoustrojów przenoszone powietrzem
Zanieczyszczenia mikroflorą materiałów budowlanych na etapie ich wytwarzania
Przechowywanie materiałów i elementów na wolnym pwoietrzu w kontakcie z gruntem

Najczęściej identyfikowane grzyby strzępkowe w budynkach to penicillium, aspergillus, cladosporium, alternaria, fusarium, mucor, rhizopus oraz scopulariopsis i Verticillium

Warunki środowiskowe rozwoju:
- Pożywka – składniki farb emulsyjnych, klejowych i wapiennych, drewno i mokroorganizmy osiadające wraz z kurzem
- Temperatura – 18-25 st. Celsjusza
Dostępność światła i tlenu
Wilgotność wzglęna powietrza powyżej 60%

Uwaga – tak wysoki poziom wilgotności występuje tylko w niektórych zakłądach
Należy zabezpieczać przegrody budowlane okładzinami o wysokim oporze dyfuzyjnym.

Tzw. Korozja cegieł i zaprawy murarskiej:
Cegły (Al2O3 x SiO2, kaolin) -(thiobacillus)->obniżenie pH z 8 do około 4, kruszenie materiału, spadek wytrzymałości.
Beton -(thiobacillus) -> pH 1,0-3,0, spadek masy i wytrzymałości.

Korozja kamienia
Drobnoustroje fotolitotroficzne (sinice, glony) wykorzystujące światło jako źródło energii
Chemolitotroficzne (Nitrosomonas, Nitrobacter, Thiobacillus), wykorzystujące amoniak, azotany, siarkowodór, siarkę jako źródło energii (utlenianie) i CO2 jako źródło węgla.
Chemoorganotroficzne, pozyskujące energię z przemian substancji organicznych
Porosty jako symbionty (glon+grzyb)
Korozja szkła dotyczy główne szkła optycznego, witraży o głębokości 40-80 mikrometrów
Grzyby Asp. Versicolor, Penicillium funiculosum, alternaria tenuis, asp. Fischer

Korozja żelaza i miedzi
Główne bakterie: Thiobacillus (utleniają siarkę), desulfovibrio, desulfotomaculum (redukujące siarczany)
Bakterie żelaziste: gallionella ferruginea
Alcaligenes, flavobacterium, methylobacterium, pseudomonas (biofilm we wnętrzu rur miedzianych)

Drewno i materiały drewnopodobne

Drewno (celuloza) -(mikroorganizmy i ich celulazy)-> glukoza

Zgnilizna biała (drewno jaśniejsze niż zdrowe) – hirschioporus abietinus i fomes fomentarius rozkładają wszystkie składniki drewna
Zgnilizna brunatna – większość grzybów drewna – lignina nie ulega rozkłądowi, a w kńcowej fazie rozkładu powstaje szary proszek
Zgnilizna szara – głównie workowce (ascomycetes) i grzyby niedoskonałe (deutermycetes) np. Cheatomium globosum
Zgnilizna korozyjna (biała jamkowata) – grzyb phellinus pini, tworzą się kieszonki wypełnione białą, mazistą celulozą. Powoduje dużo strat w lasach sosnowych.
Grzyby rozkładające drewno w budynkach (grzyby domowe) wywołują brunatną zgniliznę drewna i należą do Basidiomycetes (podstawczaków) – domowy właściwy serpula lacrymans, piwniczny coniophora puteana i domowy biały poria vaillantii

Optymalne warunki rozwoju to wilgotność drewna min. 20%.
Ochroną jest próżniowo ciśnieniowe nasycanie drewna impregnatem (fungicydem)

Było jeszcze coś z papierniczych, ale nie zdążyłem z apisać.

Czynniki hamujące wzrost grzybów:
Obniżenie temperatury poniżej 10 st. Celsjusza
Dodatek do wyrobów w czasie produkcji środków grzybobójczych
Utrzymywanie wilgotności względnej powietrza w mieszkaniach poniżej 70%.

Tkaniny i włókna.
1. Rozkład bawełny.
W 1 g wykazano obecność 2*10^9 b akterii, cellvibrio sp., 3x10^7 promieniowców streptomyces, 10^7 strzępkowców aspergillus i 2*10^6 drożdży.
Mikrobiologiczny rozkład bawełny następuje przy wilgotności względnej powietrza wyższej niż 75%
2. Włókna łykowe (len, konopie, juta, sizal, manila)
- Len i konopie podatne są na rozkłąd mikrobiologiczny
- Włókno pod wpływem drobnoustrojów i w podwyższonej wilgotnośći powietrza traci wytrzymałość mechaniczną.

3. Wełna (alfa-keratyna – 19 grup peptydowych z wiązaniami disiarczkowymi)
- Utrata spoistości tkanin i przędzy, zmiany barwy i zapachu.
- Bacillus subtilis, chromobacterium violaceum, pseudomonas aeruginosa.
Rozwój bakterii termofilnych (wzrost temp. Do około 70 st. C) może doprowadzić do sapozapalenia wełny
Tkaniny i wykładizny dywanowe z surowców naturalnych i syntetycznych – porosty grzybów plesniowych.
Skóra i wyroby skórzane:
- Wilgotność względna powietrza powyżej 88% i wilgotność skóry 13-14%
Zmniejszenie wytrzymałości, zmiany barwy – Bacillus megaterium, grzyby z rodzaju aureobasidium, aspergillus, penicillium, chaetomium, pichia, tritirachium i inne.
Bakterie i grzyby chorobotwórcze obuwia.
Ponad 20 gatunków bakterii i grzybów, np. Trichophyton, microsporum, Epidermophyton.
W użytkowanym przez 8 miesięcy obuwiu stwierdzono na 1 cm kwadratowy około 2k bakterii, 7k pleśni i 4k drożdży.
Dla zabezpieczenia skóry i wyrobów skórznaych stosuje się mikrobiocydy: kwas 2,4,5-trichlorofenylooctowy, 4-nitrofenol i inne, w stężeniu 0,3-0,4%.

Kauczuk, guma i tworzywa sztuczne
- Bardziej podatny na skażenia jest kauczuk naturalny otrzymywany przez koagulację lateksu pozyskiwanego z drzewa kauczukowego oraz kauczuk butadienowo-styrenowy i polibutadienowy.
Czym niższa masa cząsteczkowa (do 10k), tym większa podatność na rozwój grzybów.

Węglowodory mogą być przez drobnoustroje konwertowane na kwasy tłuszczowe z wydzieleniem wody. Szczególnie podatne są alkany od C12 do C21, czyli paliwa silnikowe, oleje opałowe po zanieczyszceniu wodą oraz związkami azotu, fosforu, siarki.
Powstaje czarny lub brązowy szlam.paliwach silnikowych stwierdzono m. in. grzyby Hormoconis resinae (cladosporium resinae), bakterie pseudomonas, alcaligenes i desulfovibrio desulfuricans (redukuje siarczany) oraz rózne szczepy drożdży.
Rozwój mikroorganizmów w cieczach chłodzących i smarujących (utrata właściwości smarnych, zmiana barwy, korozja metali, przyrke zapachy etc.), głównie Aspergillus, Penicillium, Botrytis i Cladosporium.

Leki i kosmetyki – kremy, maści i płyny są podatne na rozwój bakterii i grzybów.
Bakterie tj. Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Erwinia.
Pleśnie – Aspergillus, Mucor, Trichoderma, Fusarium, Monospora.
Drożdże – Candida, Monilia i Torula.

Zakażenia powodują rozkład aktywnych skłądników ksometyku, leku
Zmiany właściwości fizycznych
Zmiany cech sensorycznych, zapach, barwa
Problemy produkcji i kontroli leków i kosmetyków

Mikrobiocydy dopuszczone do stosowania w opakowaniach z papieru i tektury stykajacych się z żywnością:
- Octan i chlorowodorek n-dodecyloguaniny (warunki: pH żywn. Powyże 5,0 i brak etanolu do 0,5% masy papieru)
- Aldehyd glutarowy - W procesie produkcji papieru i tektury, w ilości do 300 ppm s.s.
- 1,3,5-trietyloheksahydro-1,3-5-triazyna w ilości 0,05-0,15% s.s. W produkcji papieru it ektury.
- Metaboran barowy (jw.)
- Boraks i kwas borny (dla powłok na papierze i tekturze)
- 1,2,-bezizotiazolin-3-on – w ilości do 0,0031 mg/cm^3 papieru lub tektury.
- O – fenylofenol – dodatek do asfaltu przy produkcji papy w ilości 3%s.

Armatura: włazy aparatów.
Do dużych, oprócz różnych drożności, każdy zbiornik ma wiele króćców.
Bezciśnieniowe otwierane sporadycznie są zamykane na śruby i mają uchwyt. Ciśnieniowe otwierane sporadycznie także są zamykane na śruby. Są też ciśnieniowe otwierane często i szybko, a także wysokociśnieniowe otwierane często.
Najczęściej stosowane połączenia to kołnierzowe. Innym rozłącznym (znacznie droższym) jest gwintowane.
Połączenia nierozłączne to: spawane, lutowane, klejone, zagrzewane i nitowane.
Innymi elementami instalacji są pokrywy, kołnierze, włazy, wzierniki i poziomowskazy, dławnice, uszczelnienia i zawory.

A po co nam to? Otóż są to podstawowe węzły nieszczelności i potencjalne wrota zakażeń w przemyśle!

Cieczowskazy: rurkowy, ze szkłem refleksyjnym i inne.
Zawory różnego typu: grzybkowy prosty, grzybkowy membranowy, zawór bezpieczeństwa, zawór zwrotny kulkowy, zwrotny grzybkowy i zwrotny klapowy. (Schematy tychże, jak również płynowskazów, warto znać).

Zawór zwrotny ma grzybek na elastycznym przegubie (w klapowym) lub sprężynie (w grzybkowym), który wchodzi w gniazdo zaworu. Podciśnienie powoduje cofanie się cieczy, a cofająca się ciecz naciska na grzybek, zamykając zawór.

Biofilm – błona biologiczna, biowarstwa – zespół drobnoustrojów ściśle przylegających do okreslonego podłoza.
Tworzenie biofilmu rozpoczyna się od adhezji (adsorpcji, przyłączenia) komórek do powierzchni stałej lub interfazy, np. Woda/powietrze.

Osiadanie drobnoustrojów -> adsorpcja (na trwałych związkach) -> stabilizacja biowarstwy -> dojrzewanie i rozwój biofilmu.

Biofilm jest dynamicznym kompleksem zaglomerowanych mikroorganizmów, rosnących na stałych podłożach, pozostających w ciągłym kontakcie ze środowiskiem wodnym. Składa się on z wielu gatunków bakterii i pierwotnych organizmów (archea), żyjących w granicach matrycy, powstałej z wydzielanych poza komórkę polimerycznych substancji (extracellular polymeric substances), EPS.


Biofilm charakteryzuje się strukutrą heterogeniczną, różnorodnością genetyczną, złożonymi interakcjami w populacji drobnoustrojów, pozakomórkową matrycą polimerycznych substancji.
EPS to mieszanina róznych polimerów, zwaierających m. in. polisacharydy, białka, fosfolipidy i kwasy nukleinowe, wzajemnie powiązane.

Niektóre z wielocukrów matrycy mają charakter obojętny, inne zaś, wydzielane przez bakterie gram-, są polianionami jak np. Egzopolisacharyd alginianiu, produkowany przez pseudomonas aeruginosa, który w łatwy sposób łączy się z kationami wapnia i magnezu, tworząc zręby matrycy biofilmu.
W przypadku bakterii gram-dodatnich, polisacharydy mają głównie charakter kationowy.

Co to jest biofilm? Co to jest EPS? (Przyspiesza adsorpcję). Jakie znaczenie ma biofilm, pozytywne i negatywne? (Negatywne – infekcje i reinfekcje. W biofilmie żaden środek dezynfekcyjny nie poradzi sobie, najpierw trzeba zniszczyć biofilm. Pozytywne – złoża, produkcja folii mikrobiologicznej, szata mikrobiologiczna organizmu - skóra.) Proces tworzenia biofilmu.

Kwasy organiczne. Biosyntezy od strony technologicznej. Biosynteza białka mikrobiologicznego.

Fermentacje – biosyntezy, chociaż nie wszystkie da się tak nazwać. Np. Produkcja octu technicznie nie jest fementacją, bo jest tlenowa. Fermentacja mlekowa – tak, beztlenowa, ale octowa jest pseudofermentacją!
Spontaniczne i kierowane procesy mogą być wykorzystywane do różnych procesów, przemian.

Bakterie kwasu octowego i mlekowego (technologiczne – pozytywy i negatywy, fizjologiczne i morfologiczne – przypomnij sobie, będzie na egzaminie. Zarówno zakażenia, jak i szczepy użyteczne):
Pojęcia, które trzeba znać – probiotyki (żywe szczepy, kultury bakterii kwasu mlekowego o prozdrowotnych, korzystnych oddziaływaniach na przewód pokarmowy ludzi i zwierząt, a nawet cały organizm. Produkt probiotyczny – zawierający takie kultury o cechach probiotycznych, czyli naukowo udowodnionym korzystnym, prozdrowotnym oddziaływaniu na organizm), prebiotyki (substancje przyspieszające i inicjujące rozwój kultur probiotycznych – czyli błonnik pokarmowy, wszystkie substancje, które nie są trawione w organizmie człowieka, bo nie ma enzymów, które by je hydrolizowały. Typową substancją błonnika jest inulina – bo nie mamy inulinazy, pektyna, celuloza...), symbiotyki

Gluconobacter oxydans, acetobacter xylinum i aceti uznawane są szkodniki, choć kiedyś były produkcyjne – teraz zastąpione przez oxydans do biosyntez. A. Orleanese (octowanie win, moszczów owocowych, octów owocowych), Schutzenbachii, Curvum, pasteurianum.
Bakterie kwasu octowego są gram-ujemne, mlekowego gram-dodatnie.

W czasie octowania następuje wiele różnych infekcji.

Kwas octowy używany jest do wielu biosyntez w zakładach chemicznych, podobnie mlekowego – na wielką skalę.

Przez autolizę drożdży może powstać amoniak, siarkowodór, merkaptany, merkaptyle, disiarczki... Wszystkie pachną obrzydliwie.
Dlatego zachowanie odpowiednich warunków jest tak ważne.

Octowe – dział BXII, klasa alphaproteobacteriae, rodzina acetobacteriaceae obejmującej 18 rodzajów.
Praktycze zastosowanie: acetobacter (15 gatunków), gluconobacter (4 gatunki), gluconoacetobacter (10).

Pordukcja kwasu octowego to niepełne utlenianie alkoholu etylowego. Powinny to być szczepy o zwiększonej tolerancji na aldehydy, kwas octowy oraz na duże stężenia etanolu. Można do syntezy, oprócz teanolu i prostych alkoholi (propanol i butanol), także sacharydów i ich pochodnych (mannitolu).

Opt. Temperatura 25-35 st.
Optymalne pH 5,4-6,2
Źródło azotu – fosforan lub siarczan amonu. Najlepszy fosforan diamonu, ale drogi.
Inne: sole magnezu, ptoasu, żelaza, wapnia, śladowe ilośći molibdenu i miedzi.
Metabolizm oksydacyjny (NIE fermentacyjny!)
Rodzaj Gluconobacter preferuje środowisko kwaśne, pH 3,6
Dobrze uposażone w enzymy łańcucha oddechowego – cykl oksydacyjny.

Szkodniki: gluconobacter xylinus, Nicienie – węgorek octowy (anguillula aceti), muszki octowe (drosophila aceti), drożdże (candida mycoderma)

Cykl HMP i glukoneogeneza – warto je znać.
Pirogronian ulega przemianie w aldehyd octowy (uzyskany z etanolu, propanolu bądź butanolu), ktry przekształca się w octan.
Glukoza i sorboza muszą przeistoczyć się w pirogronian przez HMP. Mleczan także zostaje przerobiony na pirogronian, a potem aldehyd, octan.

Etanol + tlen -> (bakterie octowe) -> kwas octowy + 494 kJ energii.

Powstawanie aldehydu octowego – etanol -> dehydrogenaza alkoholowa -> aldehyd + 2H + 17 kcal
Hydratacja aldehydu:
Aldehyd + h2o -> dwie OH przy C (CH3CH(OH)2)

Dehydrogenaza następnie prowadzi dehydratację powyższego związku, otrzymujemy octan + 2H+ + 2 e.

Elektrony i protony (po 4) zostają potem przekazane przez układ cytochromowy na tlen, tworząc wodę i dając 134 kcal energii (494 kJ).

Podstawowym surowcem do biosyntezy kwasu octowego są substraty zawierające etanol, bezpośrednio poddane fermentacji octowej: spirytus (ziemniaczany, zbożowy, melasowy, owocowy), przefermentowany sok owocowy (moszcz), wino oraz piwo. Spirytus surowy nazywa się destylatem rolniczym.

Podłoża do produkcji octu:
– spirytus o małej zawartości fuzli i pozbawiony pirydyny (toksyczna!). Zmieszany z octem (szczepienie) – tzw. Denaturat octowy – z poprzedniej szarży.
Woda – spełniająca wymagania wody przeznaczonej do spożycia (wg Rozporządzenia Ministra Zdrowia)
Pożywki (siarczan potasu i magnezu, fosforan amonu, autolizaty drożdży i glukoza)

Jak sięfermentuje?
- Powirzchniowo – metoda orleańska, w poziomo ułożónych beczkach w kufach
Ociekowa – stojakowa lub generatorowa – w zbiornikach wypełnionych porowatym materiałem
Wgłębna – w acetatorach (bioreaktorach – np. Acetator Fringesa) z wydajnym systemem napowietrzającym

Wino z octem winnym zaprawione acetobacter orleanensis -> proces octowania (dodawanie świeżych porcji wina) -> surowy ocet. Oto metoda powierzchniowa.

Metoda stojakowo-ciągła.
Do 20% etanolu, 2% kwasu octowego i 78% wody, pożywki około 0,05-0,1% w płynie fermentacyjnym.
W metodzie stojakowej ciepło wydzielane w reakcji utleniania etanolu ogrzewa wnętrze stojaka do temperatury wyższej od otoczenia, powodując przepływ zasysanego powietrza przez stojak.
Fermentacja odbywa się w kadziach cylindrycznych – stojakach – dębowych lub modrzewiowych, lub kamionkowych, wysokość około 3m. Wypełnione są wiórami bukowymi.

Na wiórkach lokują się bakterie.
Mozna zawracać, jeśli za mało zaoctowane.

Metoda generatorowa – okresowa.
10-13% alkohol, 1% kwas octowy, 86% woda, pożywki.
W metodzie generatorowej fermentacja przebiega w generatorze z wiórami bukowymi w ten sposób, że w momencie zmniejszenia stężenia EtOH do wymaganej wartości, określoną częśc cyrkulującej cieczy zastępuje świeża brzeczka.

Metoda bezwiórowa jest znacznie wydajniejsza – acetator Fringsa (okresowa 4h)
10% alkohol, 1% kw. Octowy, rszta woda z pożywkami.
Po zakończeniu szarży pozostawia się w acetorze ocet zarodkowy, około 6000l (z 16000l)

Zużycie 100^ospirytus (l) na 1l octu 10% - stojakowa 0,13, generatorowa 0,11, bezwiórowa 0,10
Przerób spirytusu w l/dobę na metr sześ wiórków lub acetatora – 1,2-2, 4,6, 2-30
Zużycie pożywki w gramach na 100l spirytusu – 50-100, 200-500, 2000
Zużycie neergii elektrycznej w Kwh/100l octu 10% - 1, 1,2, 1,5

Do fermentacji kw. Mlekowego stosuje się homofermentatywne bakterie ze streptococcus (lactococcus):
Streptococcus lactis, streptococcus cremoris, thermophilus (b. Dobre, w wyższej temperaturze, nawet 55-60 st. C), delbrueckii, bulgaricus.

Fermentacja 5-10 dni (3-5)
W temperaturze 45-60, pH 5-7
W czasie fermentacji powstający kwas mlekowy neutralizuje się wodorotlenkiem wapnia, powyżej 3% zawartości bakterie hamują bowiem proces.
Surowce: sacharoza, melasa, skrobia po hydrolizie, serwatka
8 dm^3 kw. 50% ze 100 kg serwatki.

Kwas mlekowy występuje w dwóch czynych postaciach – prawoskrętny jest przyswajalny. Lewoskrętny nieszkodliwy dla organizmu, ale nie jset też wykorzystywany ani do celów energetycznych, ani do budowy komórek. Po prostu powoli się go wydala.
D/-/ ma -OH po prawej stronie na wzorze.

(Ekstrakt, by nazywać się koncentratem, powinien mieć 65%)

Otrzymowanie!
Surowce: skrobia ziemniaczana lub zbożowa po scukrzeniu amylazą, sacharoza, glukoza, serwatka, permeat mleka lub serwatki, ługi posulfitowe i, oczywiście, melas.

Fermentacja w pożywce 10-13% sacharydu, związki azotowe, biostymulatory (kiełki słodowe, niechmieloną brzeczkę słodową, zarodki żytnie i pszenne, autolizaty drożdżowe, wyciągi z fasoli lub wyki) oraz makro- i mikroelementy jest najczęściej prowadzona przez bakterie Lactobacillus, np. Delbrueckii ssp. Bulgarius, wymagające do wzrostu złożónej mieszaniny aminokwasów, które rozwijają się intensywnie w 50 st.C, wytwarzając ponad 2% kwasu mlekowego, lub Streptobacterium i Lactococcus.
Dla utrzymania kwasowego pH 5,5-6,0 dodaje się węglan wapnia w ilości stechiometrycznej w stosunku do syntetyzowanego kwasu.
Kwasowość regulowana wodortlenkiem wapnia lub amonu w sposób ciągły, co umożliwia utrzymanie opt. PH i przyspieszenie fermentacji. W pierwszej dobie odfermentowuje 4-5% sacharydu, reszta stopniowo.
Ciecz pofermentacjna alkalizowana wodortlenkiem wapnia do 9-10 pH, ogrzewana do 80-90 st.C w celu oddzielenia kom. Bakterii, białek, kiełków, zarodków i odbarwiana węglem aktywnym.
W roztworze zzagęszczonym do 25% mleczanu wpania w wyparce próżniowej prowadzi się krystalizację soli.

Z kryształów mleczanu wpania wkas mlekowy jest uwalniany kw. Siarkowym VI, a po oddzieleniu wytrąconego osadu gipsu zagęszczany do wymaganego stężenia, oczyszczany.
Kwas mlekowy po destylacji można oczyszczać, ekstrahując rozpuszczalnikiem organicznym (np. eterem etylowym) i filtracji na węglu aktywnym po destylacji, na przeciwprądowej estryfikacji metodą ciągła, destylacji (próżnia, pod ciśnieniem), chromatografii jonowymiennej.
Z serwatki, laktoza jest fermentowana w 30-35 st. C przez mezofile. (Serwatkę pomijamy, ppodobnie reaktor fluidalny i dalsze oczyszczanie).

Procukcja:
1. Fermentacja – namnażanie czystych lkultur w laboratorium na brzeczce jęczmiennej, sacharozie, melasie.
Namnażanie w aparatach Lindnera
2. Etap wydzielania, zagęszczania i oczyszczania kwasu mlekowego – rozłożenie mleczanu na wolny kwas mlekowy i gips, z pomocą kw. Siarkowego. Oczyszcznaie przez dodatek żelazocyjanku potasu i wapnia – wytrącenie meltai. Oddziela się jonity, odbarwia węglem aktywnym i zagęszcza w wyparkach do 50-85%.

Produkcja kw. Cytrynowego – środek zakwaszający w produkcji napojów gazowanych, dżemów, galaretek, majonezów i do stabilizacji barwy, smaku i zapachu.
Największe znaczenie: pleśnie tj. aspergillus niger, wentii i clavatus oraz liczne drożdże – candida lipolytica, oleophila, tropicalis, intermedia, guillermondii, wyselekcjonowane specjalnie.

(Wzór strukturalny kwasu cytrynowego!)

COOH-CH2-C(COOH -OH)-CH2-COOH

Podst. Surowiec – melasa, syrop glukozowy, sacharoza, an awet niektóre frakcje lipidowe, n-alkany.
Podczas biosyntezy powstają produkty uboczne – kwas szczawiowy, wytrącany jako szczawian wpania. Oddzielany przez filtrację.
Odzyskiwany kwas cytrynowy z płyny pohodowlanego przez wytrącenie węglanem wapnia, a z cytrynianu wapnia tak otrzymanego uwalnia się kwasem siarkowym VI
Etap prowadzi do powstania roztworu kwasu cytrynowego i wytrącania

Nadprodukcja!
Ważne, żeby była.
Niektóe szczepy A. Niger wykazują ją, co jest wynikiem zakłócenia cyklu Krebsa, polegającym na zablokowaniu aktywności enzymów odpowiedzialnych za jego dalszą konwersję!
Jest to efekt warunkwaony genetycznie, ale wydajność gromadzenia kwasu można zwiększyć prze odpowiedni skład pożywki – źr. C 10-14%, deficyt fosforanów i jonów manganu, cynku i żelaza oraz dobre nadtlenienie.
Warunki takie umożliwiają nieznaczny rozwój pleśni i zapobiegają zarodnikowaniu, to źle.
Przy użyciu A. Niger można uzyskać kwas metodą hodowli wgłębnej lub powierzchniowej.

Kw. Cytrynowy jest jednym ze tapów cyklu krebsa, jego głównym zadaniem jest utlenianie zw. Org., a nie wydzielanie ich do podłoża.
Korzystne warunki:
Cukier – 10% wgłębna, 16% powierzchniowa.
Niedobór manganu, cynku, żelaza, mniej niż 0,1 mg na 100 cm3
Ograniczona ilość zw. Azotu, fosforu – limitacja wzrostu grzybni.
Wartość pH 3,5-6,5
Dobre natlenienie środowiska

Przerób kwas propionowy - źródło glicerol, propionibacterium theonii najlepiej. Prawie czysty kwas propionowy.

Zastosowanie – perfumeria, estry
- Tworzywa sztuczne, włókna tkacie, błony membranowe
- Inhibitory grzybów pleśniowych