Mikrobiologia przemysłowa Wykład

Egzamin: 01-02-2006
s. 220, A3
podział na grupy:

8:15 – 10:00 – nazwiska od A do L

10:15 – 12:00 – nazwiska od Ł do Ż

MIKROBIOLOGIA PRZEMYSŁOWA WYKŁAD [2005]
Dr Rucka

Niniejszy dokument sporządzony został dzięki wkładowi pracy jednej osoby – koleżanki z
roku, Madzialenki – za co wszyscy serdecznie jej dziękujemy. Oby każdemu tak chciało się
chcieć, wtedy wszystkim byłoby łatwiej ☺

12-10-2005

Wykład 2

Woda – jako element podłoża, jest tłem pożywki, środowiskiem

Jakość wody jest bardzo istotna. W procesach przemysłowych używa się głównie

wodę wodociągową, sterylizuje się już wszystko razem w reaktorze. Obecność związków
ż

elaza może wpływać niekorzystnie na produkcję np. antybiotyków, kwasu cytrynowego.

Dlatego należy na bieżąco kontrolować wodę do celów mikrobiologicznych. Woda powinna
być filtrowana.

Woda – medium do chłodzenia w trakcie procesu, do mycia – jest to woda gorszej jakości

Wiele zakładów produkcyjnych ma własne ujęcie wody np. odwierty, powierzchniowe. W
zależności od tego, skąd pochodzi, należy ją uzdatnić. Plusem jest to, że zakład może
kontrolować stan tej wody. Bardzo często browary mają własne ujęcia wody.

skład podłoża:

woda

źródło węgla

źródło azotu

inne składniki: fosfor, witaminy, prekursory (w zależności od mikroorganizmu)

ródło węgla – główny składnik podłoża, potrzebny do biosyntezy, źródło energii dla

mikroorganizmów, aby obniżyć koszty szuka się tanich i efektywnych źródeł, głównie używa
się węglowodanów, zaczyna się wykorzystywać węglowodory np. pozostałość po destylacji
ropy naftowej

węglowodany:

Monosacharydy

- glukoza – składnik podłóż mikrobiologicznych, najczęściej w laboratoriach jako
monosacharyd, dość rzadko występuje w naturze (np. w winogronach), najszybciej

przyswajana, w przemyśle używa się glukozy pochodzącej z hydrolizy skrobi (procesy
chemiczno-enzymatyczne), powstaje syrop glukozowy
Podczas sterylizacji glukoza może wchodzić w reakcję z aminokwasami z podłoża,
dlatego podłoże i glukozę sterylizuje się osobno

{rysunek – krzywa diauksji – gdy w podłożu są dwa źródła węgla}

Oligosacharydy

- laktoza

– powszechna w przyrodzie – w mleku od 3 do 8 %, przemysłowo

otrzymywana przez odparowanie serwatki, nie wszystkie mikroorganizmy rozkładają
laktozę

- sacharoza – w owocach, burakach cukrowych, trzcinie cukrowej

Melasa – zawiera niewykrystalizowane cukry po produkcji cukru, produkt
uboczny, zawiera również inne składniki, doskonałe źródło węgla do podłóż
mikrobiologicznych, ponieważ jest produktem naturalnym, więc jej skład może
się wahać, może również zawierać mikroorganizmy (zakażona!), wymaga
wstępnej analizy

Polisacharydy

- skrobia

– składnik energetyczny składowany u roślin w bulwach, jest

nierozpuszczalna, trzeba ją chemicznie modyfikować, żeby można ją było rozpuścić,
większość organizmów przyswaja skrobię

- celuloza

– bardzo rozpowszechniona, składnik ściany komórkowej roślin, jednak

niewiele organizmów ją przyswaja, dlatego wymaga wstępnej obróbki

ródło azotu – mogą być w dwóch postaciach: nieorganiczne sole lub źródło organiczne

⇒

Sole azotu – np. nawozy mineralne, mocznik, sole amonowe

⇒

Organiczny – łatwiej przyswajalny, wykorzystuje się produkty uboczne przemysłu

spożywczego np. syrop kukurydziany, syrop ziemniaczany – w postaci aminokwasów

- ekstrakt drożdżowy – liza komórek drożdży w 50°C, ogrzewanie do 75°C,
plazmoliza, filtracja, wirowanie, zawiera witaminy, aminokwasy

19-10-2005

Wykład 3

ZASZCZEPY MIKROBIOLOGICZNE

Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów:

- bakterie – podział

- drożdże – pączkowanie

- grzyby – plecha

Pomiary ilości komórek:

- stężenie komórek

- stężenie masy komórek

Są to dwa zasadniczo różniące się parametry np. zaraz po podziale komórki

bakteryjnej mam dwie komórki, ale są jeszcze małe i ich masa się nie zmieniła, jest jak masa
jednej komórki. W praktyce mierzy się zarówno masę i ilość komórek.

•

Pobieramy próbkę o znanej objętości, robi się posiew i zlicza się liczbę komórek lub

liczymy komórki pod mikroskopem

•

Obecnie można automatycznie zliczać liczbę komórek, jednak automat nie rozróżnia

komórek martwych i żywych

•

Pomiar przez posiew jest jednak długotrwały (24-48h), co jest problemem, gdy chcemy

na bieżąco kontrolować hodowlę

Pomiar masy – mierzymy komórki żywe i martwe pozostałości komórek, ale są to pomiary
szybkie
⇒

Wprost – oddziela się na sączkach mikroorganizmy (lub przez wirowanie) od płynu

pohodowlanego, próbkę suszymy i ważymy

⇒

Pomiar turbidometryczny – mierzymy rozpraszanie światła

Możemy robić również pomiary niebezpośrednie mierząc jakiś składnik np. wydzielany przez
komórki – CO

Trzeba wyznaczyć współczynnik opisujący zależność między masą (ilością) komórek a
mierzonym składnikiem. Jednak ilość pewnych składników może zależeć od warunków
fizjologicznych, a masa się nie zmienia.
Można mierzyć również: białka, ATP, kwasy nukleinowe.

!!! Problem jest z grzybami, gdyż one nie rosną w postaci pojedynczych komórek tylko w
koloniach, dlatego nie wiadomo, co mierzyć.

Dobry zaszczep mikrobiologiczny

1.

Zawiera żywe i aktywne komórki

Jest dostępny w dużych ilościach

Wolny od zanieczyszczeń

Jego komórki muszą mieć zachowaną zdolność do wytwarzania interesującego nas

produktu

Dlaczego żywe i aktywne komórki?

Dążymy do tego, aby skracać do minimum fazę adaptacyjną hodowli. Podłoże do hodowli
inokulum różni się od podłoża produkcyjnego. Podłoże takie ma taki skład, aby komórki

mnożyły się jak najszybciej, natomiast podłoże produkcyjne ma taki skład, aby powstało jak
najwięcej pożądanego produktu

Czemu skracamy okres adaptacyjny:

•

Ekonomia – jest to czas, gdy nic się nie produkuje

•

Jest to czas, w którym najłatwiej o zakażenie hodowli

Staramy się również, aby podłoża nie różniły się drastycznie. Ważne jest również, aby
zaszczepu było dużo, jest to około 3% objętości hodowli.

Hodowla inokulum jest procesem wieloetapowym:

Bakterie przechowywane są na skosach

Hodowla w pożywce płynnej w kolbach (max. 0,5 litra)

Hodowla w mini-reaktorach – przelewamy całość kolb (kilkadziesiąt litrów)

Przenosimy zaszczep do reaktora produkcyjnego

Po drodze sprawdzamy czystość hodowli, oraz czy nasze komórki nadal potrafią produkować
oczekiwany produkt tzn. jak się komórki zestresują, to zapomną, czego je nauczyliśmy☺

Gdy używamy drożdży często jest tak, że jako zaszczepu używamy organizmów z
poprzedniej szarży np. w produkcji piwa drożdże osadzają się, osad taki przemywamy wodą,
antybiotykami, filtrujemy i można je ponownie użyć. Istnieje jednak niebezpieczeństwo
degeneracji komórek np. wytwarzają jakiś produkt uboczny, dlatego tego samego zaszczepu
używamy około 5 razy i dajemy nowy zaszczep (nowe zastępy dzielnych drożdży gotowych,
by zmierzyć się z chmielem i jęczmieniem☺).

Inokulum do procesów grzybowych
W większości wypadków używamy spor do inokulum.

1.

Doprowadzamy grzyby do sporulacji przez ustalenie odpowiednich warunków np.

ograniczamy dostęp źródeł azotu, jako podłoża używamy np. zmieloną kukurydzę, kromki
chleba, w warunkach wysokiej wilgotności

Zbieramy spory, liczymy i możemy dalej postępować na dwa sposoby:

Używamy spor do zasiewu – wydłuża się faza adaptacyjna, nie potrzeba

dodatkowej instalacji

Skiełkowujemy spory w osobnej instalacji, dopiero potem zaszczepiamy w

reaktorze produkcyjnym

Gdy mamy grzyby niesporulujące:
- homogenizacja grzybni
- zaszczepiamy reaktor

Wzrost grzybów może mieć charakter rozproszony lub w agregatach.

26-10-2005

Wykład 4

Skąd możemy otrzymywać zaszczepy?

Z komórek macierzystych, w większości krajów są przedmiotem opatentowanym

Zakupienie z kolekcji szczepów

Wyizolowanie szczepów ze środowiska – długa droga

Kradzież szczepów ☺

Przechowywanie szczepów
Musimy je przechowywać tak, aby nie uległy zmianom genetycznym, aby nie doszło do
zakażenia, muszą zachować żywotność i praktyczność

1.

Obniżanie temperatury – spowolnienie procesów metabolicznych lub ich całkowite

zahamowanie
•

Na skosach agarowych, w lodówce w temperaturze 5-10°C, można je przechowywać

maksymalnie pół roku

•

W ciekłym azocie (<150°C) – można przechowywać do kilkudziesięciu lat, komórki

muszą być odpowiednio przygotowane, zawiesza się je w glicerolu, zamyka w
ampułkach, poddaje powolnemu zamrażaniu, wysokie koszty przechowywania

Do bieżącego użytku przechowujemy bakterie na skosach w lodówce, ale zawsze
przechowujemy żelazną rezerwę komórek trzymanych w inny sposób np. w ciekłym azocie

2.

Odwadnianie komórek – powoduje to spowolnienie procesów metabolicznych

•

Posiew na podłoże stałe np. gleba, produkty spożywcze, doprowadza się do wzrostu i

powoli suszy (w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni), pozwala przechowywać
szczepy przez długi czas (kilkadziesiąt lat), głównie przechowuje się w ten sposób
grzyby promieniowce

•

Liofilizacja – odwadnia się komórki w obniżonej temperaturze, zamraża się komórki

w płynnym podłożu, następnie odpompowuje się powietrze, obniża się ciśnienie, co
powoduje, że lód przechodzi ze stanu stałego w parę, podłoże zawiera czynniki
chroniące np. mleko, surowica, glutaminian sodu, ampułki z takimi zliofilizowanymi
komórkami można przechowywać minimum 10 lat, nie trzeba utrzymywać niskiej
temperatury, przy zamrażaniu komórki mogą ulec zniszczeniu i nie wszystkie komórki
mogą być zliofilizowane

BIOSYNTEZA METABOLITÓW

Podział metabolitów:
- pierwotne – związki niskocząsteczkowe, są konieczne do wzrostu komórek, np.
aminokwasy, monosacharydy
- wtórne – często związki wielkocząsteczkowe, ich synteza zachodzi później podczas wzrostu
hodowli, nie są potrzebne do wzrostu komórki, są ważne z punktu widzenia przeżycia
producenta

Jeśli chcemy otrzymywać metabolity pierwotne, musimy utrzymywać hodowlę (ciągłą) na
etapie wzrostu logarytmicznego, gdy chcemy metabolity wtórne – etap fazy stacjonarnej.

Jak przekonać komórkę, aby produkowała dany produkt?

Każdy organizm ma mechanizm kontroli np.
Sprzężenie zwrotne – końcowy produkt szlaku metabolicznego hamuje cały szlak np.:

Jako inhibitor pierwszego enzymu ze szlaku – gdy stężenie produktu końcowego dojdzie do
pewnego poziomu, zachodzi inhibicja enzymu, gdy wyczerpuje się produkt, cykl rusza od
nowa
Produkt może też być represorem genu kodującego enzym, enzym w ogóle nie powstaje –
większa oszczędność.

By komórka nadprodukowała dany produkt, trzeba ominąć system kontroli:

⇒

Utrzymujemy stężenie produktu końcowego na niskim poziomie przez zwiększenie

przepuszczalności błony np. dodajemy do podłoża antybiotyki uszkadzające błonę lub
otrzymujemy szczep mutantów, które nie wytwarzają błony, w ten sposób produkujemy
kwas glutaminowy, ten sposób dodatkowo pozwala na łatwiejsze uzyskanie produktu z
komórki

⇒

Wprowadza się zmiany genetyczne, które sprawiające, że organizm wytwarza enzym

niewrażliwy na sprzężenie zwrotne, wtedy szlak metaboliczny działa niezależnie od
stężenia produktu końcowego, ten sposób jest trudniejszy do wykonania

09-11-2005

Wykład 5

Podstawowy szlak regulacji metabolizmu to sprzężenie zwrotne.

Enzym, którego synteza jest regulowana przy udziale końcowego produktu szlaku
metabolicznego (mechanizm represji) nazywamy enzymem represyjnym. Represorem mogą
też być produkty pośrednie w szlaku metabolicznym.

Znajomość mechanizmu regulacji jest bardzo ważna, gdy chcemy otrzymywać produkt
końcowy lub sam enzym.

Przykłady omijania:

•

Komórki mutujemy tak, aby nie wytwarzały biotyny (która jest składnikiem błony

komórkowej), zwiększa się przepuszczalność błony komórkowej , taka komórka nie
zatrzymuje produktu końcowego, nie następuje sprzężenie zwrotne, komórka jest
nadproducentem

•

Dodanie antybiotyku – penicyliny, która uszkadza ścianę komórkową, prze to zwiększa

się przepuszczalność komórki

Represja kataboliczna – przy danym środowisku, komórka nie produkuje danego enzymu,
dopiero zmiana w środowisku prowadzi do uruchomienia jakiegoś szlaku metabolicznego,
może to być np. ubytek określonego źródła węgla.

Niektóre komórki mogą być wrażliwe na własny antybiotyk, zwłaszcza w fazie wzrostu
logarytmicznego, gdzie przeważają młode, szybko dzielące się komórki. Natomiast w fazie
stacjonarnej przeważają dojrzałe komórki, bardziej odporne na własny antybiotyk. W tej
fazie można sobie pozwolić na produkcję antybiotyku. Może on eliminować szczepy
konkurenckie, które zaczynają się namnażać. Komórka zaczyna produkować antybiotyk gdy
zabraknie jakiegoś składnika np. źródła węgla, azotu czy fosforu. Odpowiednio dobierając
skład podłoża, możemy sterować produkcją antybiotyków.

Obecność jakichś związków w podłożu może indukować jakiś szlak metaboliczny. Związki
te nazywamy induktorami.

Produkcja wielu antybiotyków również działa na zasadzie sprzężenia zwrotnego np.
penicyliny, chloramfenikolu.

Jeżeli mamy komórki zmutowane tak, aby nadprodukowały jakiś związek (np. nie produkują
biotyny) otrzymujemy produkcję metabolitu nawet 1000-krotnie większą, musimy jednak
zachować idealne warunki sterylne, ponieważ w przypadku, gdy dojdzie do zakażenia jakimś
dzikim szczepem, będzie on lepiej przystosowany i wyprze nasz szczep producencki.

IZOLACJA SZCZEPÓW UŻYTECZNYCH PRZEMYSŁOWO

Gdy pobieramy szczep ze środowiska, musimy go sobie wyizolować. Jakie kryteria musi
spełniać ten szczep?

1.

Czy szczep produkuje interesujący nas metabolit?

Musimy zastanowić się, gdzie, w jakim środowisku, będzie największa szansa na

znalezienie organizmu o interesujących nas właściwościach

Często poszukuje się organizmów ekstremofilnych, produkują one enzymy, które są

przystosowane do katalizowania reakcji w warunkach ekstremalnych np. odporne na
bardzo wysokie temperatury, różne zakresy pH, zasolenie, dzięki użyciu takich
enzymów nie musimy zapewniać komórkom cieplarnianych warunków

Aby wyizolować interesujący nas szczep z dużej ilości mikroorganizmów, używamy testów
przesiewowych (screeningowych). Test przesiewowy musi być prosty i tani, aby pozwolić na
szybkie przesiewanie dużej ilości komórek.

Przykład:

Poszukujemy enzymów proteolitycznych

Posiewamy mikroorganizmy na podłoże zawierające białko, zazwyczaj kazeina, białko

mleka

Na podłożu rosną sobie różne szczepy

Po 48h wlewamy na płytkę kwas trójchlorooctowy, powoduje on wytrącanie

(koagulację) białka

W miejscach, gdzie kolonia nie rozkłada białka, otrzymujemy mętny „placek” wokół

kolonii, wokół tych, które rozkładają białko, pojawia się rozjaśnienie

Teraz już można łatwo wyizolować kolonie produkujące enzymy proteolityczne.

Gdy nie mamy testu przesiewowego, można brać pod uwagę grupę taksonomiczną. Izolujemy
daną grupę np. Streptomyces, gdy szukamy jakiegoś antybiotyku, i dopiero w tej grupie
szukamy konkretnego szczepu.

Po przesiewach nadal mamy bardzo dużo organizmów producenckich. Do selekcji używamy
kolejnych kryteriów.

Wymagania żywieniowe – szukamy szczepu, który pożywia się na tanim źródle węgla,

posiewamy komórki na określone podłoża z różnymi źródłami węgla, sprawdzamy, czy
szybko się mnożą i czy produkują nasz związek, odrzucamy organizmy, które wymagają
drogich źródeł węgla, wybieramy te, które wymagają tanich.

Optymalna temperatura wzrostu – zazwyczaj wybieramy te, dla których optimum

temperatury jest powyżej 40°C, w produkcji przemysłowej łatwiej jest podgrzać niż
ochłodzić, izolacja jest bardzo prosta, prowadzimy hodowlę w danej temperaturze,
sprawdzamy, które się szybciej mnożą, produkują więcej metabolitu

Czy organizm będzie można hodować w urządzeniach, które już posiadamy?

Np. jeśli mamy aparaturę tlenową, nie szukamy beztlenowców, można przetestować
efektywność organizmów stosując różne rodzaje mieszania, natleniania, itp

16-11-2005

Wykład 6

TECHNOLOGIE ŚCIEKÓW

I stopień oczyszczania ścieków – oczyszczanie mechaniczne np. kraty

Ś

ciek – wszystko, co płynie, i nie może być ponownie wykorzystane w procesie

technologicznym

- może to być również woda, która była używana do chłodzenia, bo jest podgrzana, wyższa
temperatura zmniejsza rozpuszczalność gazów
- ścieki bytowe i przemysłowe

II stopień oczyszczania ścieków – oczyszczanie biologiczne

Oczyszczanie biologiczne można przeprowadzać, gdy ścieki zawierają substancje mogąca
stanowić pożywkę dla mikroorganizmów, np. ścieki pochodzące z przemysłu spożywczego,
chemicznego

Komory osadu czynnego – reaktory z całkowitym przemieszaniem, ściek przygotowujemy
tak, aby pH było obojętne, musi być odpowiednia ilość pierwiastków podstawowych,
niekiedy nawet dodajemy określone związki, np. z azotem, aby mikroorganizmy mogły się
rozwijać

→

reaktor mieszalnikowy

→

osadnik wtórny – osadza się osad czynny

Zooglea – pałeczka tlenowa, gramujemna, ma otoczkę śluzową, wydziela egzoenzymy, które
rozkładają związki wielkocząsteczkowe

Sorbcja → enzymatyczny rozkład → wchłanianie

Gdy ściek jest za bardzo stężony, mamy za mało zooglei, a więcej S. natans – wskaźnik wód
zanieczyszczonych

Jest to bakteria nitkowata, śluzowata, zmienia właściwości sedymentacyjne osadu czynnego,
bo one flokują, pływają na powierzchni, osad „puchnie” i wypływa z osadnika

III stopień oczyszczania – ze ścieku usunięta jest biomasa, ale pozostaję związki
nierozkładalne przez osad czynny

23-11-2005

Wykład 7

BZT

– biologiczne zapotrzebowanie tlenu

Pozwala

określić

zanieczyszczenie

cieków,

również

wydajność

oczyszczalni

mikrobiologicznych.

Usuwanie związków azotu
W ściekach azot zawarty jest w białku. Jakim procesom podlega białko:
⇒

Rozkład proteolityczny – przy udziale egzogennych proteaz, powstają polipeptydy →

peptydy → aminokwasy
Stopień hydrolizy zależy od charakteru białka, większość enzymów jest specyficzna do
wiązań przy konkretnych aminokwasach, część peptydów jest wbudowana w komórkę

⇒

Dezaminacja aminokwasów – zazwyczaj na drodze tlenowej, powstają ketokwasy,

oddziela się związek azotu, dezaminacji może ulegać również mocznik występujący w
ś

ciekach, za pomocą ureazy ulega rozkładowi do amoniaku

⇒

Amoniak rozpuszcza się w wodzie, powstaje zasada amonowa NH

(OH)

organizmy nitryfikacyjne:

•

Nitrosomonas: NH

→ NO

w warunkach tlenowych (I stopień nitryfikacji)

•

Nitrobacter: NO

→ NO

warunki tlenowe (II stopień nitryfikacji)

Nitrosomonas

i Nitrobacter są chemoautotrofami tzn. uzyskują energię z utleniania związków

nieorganicznych

organizmy denitryfikacyjne – warunki beztlenowe

→ N

Proces ten jest hamowany obecnością tlenu, organizmy denitryfikacyjne są względnymi
beztlenowcami i w warunkach beztlenowych wykorzystują tlen ze związków azotu, proces
ten jest bardzo wydajny

ZŁOŻA BIOLOGICZNE
Jest to kolejna metoda biologicznego oczyszczania ścieków. W kolumnie umieszcza się półki
z porowatym wypełnieniem, aby zwiększyć powierzchnię, nad podłożami krąży „ramię” i
rozdeszcza ścieki.

Podczas omywania przez ścieki na powierzchni wypełnienia tworzy się film biologiczny.
Tlen jest dostarczany od dołu, z powodu efektu „efektu kominowego”. Z powodu działalności
biologicznej powietrze nagrzewa się i idzie do góry, wciągając od dołu chłodniejsze powietrz.
W takich złożach organizmy są immobilizowane:
⇒

Zaletą jest fakt, że w odcieku nie ma mikroorganizmów, nie musimy oddzielać biomasy od

oczyszczonego ścieku. W praktyce nie jest tak łatwo. W złożu, które dłużej pracuje,
następuje odpadanie mikroorganizmów od elementów wypełnienia, dzieje się tak, gdyż
komórki znajdujące się na samej powierzchni wypełnienia obumierają, gdyż zwiększa się
miąższość biomasy, nie dociera do nich tlen ani składniki odżywcze

⇒

Złoża biologiczne mają charakter tłokowy, po drodze zmienia się stężenie składników,

ubywa związków stanowiących pożywkę, przybywa metabolitów, w przypadku dostania
się do złoża jakiejś toksyny, można przyjąć, że całe jej stężenie zatrzyma się na 1-2
górnych półkach

⇒

Wadą jest niższa efektywność – około 75-80% BZT

(komory osadu czynnego – powyżej

90%)

Na złożu biologicznym muchówki składają larwy, które pożerają film biologiczny. Gdy larwy
przeistoczą się w postać dorosłą, a wraz z mini (jako ich część) złoże biologiczne.

Co się dzieje z osadami po oczyszczaniu?

•

Można ich użyć jako nawóz (po przegotowaniu), ale mogą w nim przeżyć larwy, cysty

organizmów pasożytniczych, osad taki może zawierać również związki nierozkładalne
np. metale ciężkie zaabsorbowane na biomasie, można używać w miejscach, gdzie nie ma
upraw użytkowych, tylko np. zieleń rekreacyjna

•

Kompostowanie – w warunkach beztlenowych, rozkładane są związki zawarte w

komórkach, zmniejsza się objętość biomasy

•

Wylewanie na polach irygacyjnych, jest dobry dostęp tlenu, rozwijają się organizmy

najlepiej przystosowane, część biomasy ulatnia się do atmosfery

Wszystkie te metody są jednak dość powolne, oczyszczalnie starają się zmniejszyć objętość
osadów.

BIOTECHNOLOGIA PRZEMYSŁU MLECZARSKIEGO

Podział produktów fermentacji mlekowej:

⇒

Powstałe z działalności bakterii mezofilnych kwasu mlekowego:

•

Twaróg

•

Śmietana

•

Maślanka

•

Zsiadłe mleko

Są to produkty rodzimie dla naszej szerokości geograficznej

⇒

Powstałe po fermentacji szczepami termofilnymi kwasu mlekowego:

•

Jogurt – pochodzi z basenu Morza Czarnego np. Bułgaria

⇒

Powstałe z działalności bakterii kwasu mlekowego przy współdziałaniu innych

mikroorganizmów np. drożdży

•

Kefir

Skąd przemysł mleczarski bierze zaszczepy?

Rozwinęła się branża produkcji szczepionek dla przemysłu mleczarskiego.
Domowym sposobem wykorzystuje się bakterie natywne, występujące naturalnie w mleku.
Mleko musi być niepasteryzowane!

Szczepionki wytwarzane są do konkretnego produktu:
→

dla śmietany – Streptococcus lactis i cremonis

→

dla kefirku – Streptococcus lactis i cremonis, Lactobacillus, drożdże Pluiveromyces

fragilis
→

dla jogurciku – Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus

Często firmy dostosowują szczepionki do składu mleka np. zależą od pory roku.

30-11-2005

Wykład 8

Działalność bakterii mlekowych powoduje zakwaszenie środowiska (powstają kwasy),
wytrąca się kazeina, wytwarza się układ koloidowy i powstają micele. Kazeina, która się
wytrąca, jest białkiem nierozpuszczalnym w wodzie i tworzy się skrzep kazeinowy.

Podpuszczka (renina) – enzym występujący w żołądkach młodych ssaków, rozkłada kazeinę,
początkowo otrzymywano go z żołądków cieląt, jagniąt, teraz można używać enzymu
pochodzenia mikrobiologicznego

Po usunięciu skrzepu pozostaje serwatka, tłuszcz i białko są w skrzepie.
Ze skrzepu białka z tłuszczem powstają sery dojrzewające (żółte), ale nie są kwaśne, gdyż nie
występuje zakwaszenie mleka.

Mikroorganizmy biorą czynny udział w wytwarzaniu serów pleśniowych. Sery te powstają
również z niezakwaszonego mleka. Dojrzewały w grotach, jaskiniach, gdzie na serze
dojrzewały różne grzyby wytwarzające proteazy, lipazy. W tej chwili w produkcji
przemysłowej sztucznie zaszczepia się grzyby na skrzep kazeinowy.
Wszystkie inne produkty mleczne np. twaróg, są to produkty fermentowane (zakwaszenie
mleka)

Sery – oddziela się skrzep od serwatki

Napoje mleczne – skrzep pozostaje w serwatce

•

Metoda zbiornikowa – pasteryzacja, ujednolicenie składu (dodanie mleka w proszku),

umieszcza się w dużym zbiorniku, podaje się zaszczep, następuje inkubacja, mleko
fermentuje, po tym czasie rozlewa się do pojemników

•

Fermentacja w opakowaniach – wyrównanie składu, pasteryzacja, homogenizacja, oddaje

się szczepionkę i rozlewa do opakowań, w opakowaniach następuje fermentacja w
termostatowanych pomieszczeniach

Szczepionki mleczarskie różnią się składem, w zależności od produktu. Hodowane są na
mleku w proszku, jest to hodowla okresowa, zatrzymywana na początku fazy stacjonarnej,
sporządza się szczepionkę

Formy szczepionek:

⇒

Płynne – bezpośrednio po przerwaniu hodowli przewiezione do producenta, jeśli zakład

mleczarski sam produkuje szczepionki przenosi się je bezpośrednio, w praktyce jest to
najmniej przydatna forma, bo nie można jej przechowywać

⇒

Stałe:

•

Liofilizowane – szczepionka sublimowana, suszona itd., hodowlę przeprowadza

się tak samo, po przerwaniu hodowli dodaje się czynnik kriochronny, umieszcza w
liofilizatorze, taka szczepionka może być przechowywana ok. 6 m-cy

•

Suszenie rozpyłowe – zawiesinę przepuszcza się przez małe dysze przy dużym

przepływie powietrza, zawiesina jest w małych kroplach, które szybko
odparowuje, powstaje pył mikroorganizmów, taka szczepionka jest równomierna,
cząstki są równej wielkości (bo w liofilizacji otrzymuje się grudę, którą trzeba
rozdrobić, jest ona niejednolita)

⇒

Koncentraty płynne – szczepionki o dużym stężeniu bakterii, hodowane są na bardzo

bogatym podłożu

SELEKCJA MIKROORGANIZMÓW

Najczęściej izolujemy mikroorganizmy z gleby, która jest bardzo bogata w mikroby. Selekcja
często jest powiązana z ulepszeniami:
→

mutacje genetyczne

→

zmiany w środowisku (manipulacje warunkami hodowli) – doprowadza się do

optymalizacji hodowli, to jest już pułap możliwości, dalej trzeba już wprowadzić zmiany
genetyczne w organizmach

Mutagenizację można przeprowadzić przez:

Promieniowanie UV – śmiertelność organizmów wynosi ok. 90%

Mutagen chemiczny – etylenoimina

Stosuje się na przemian czynnik chemiczny i promieniowanie

Po mutagenizacji prowadzi się hodowlę, otrzymujemy organizmy o zmienionym genotypie.
Często otrzymujemy organizmy zdolne do nadprodukcji (auksotrofy), ale są „upośledzone” w
innym miejscu szlaku metabolicznego. Aby oddzielić auksotrofy od prototrofów musimy
przeprowadzić selekcję.
Wysiewamy mieszankę po mutagenizacji na podłoże minimalne z antybiotykiem, tylko
prototrofy się rozwijają, ale antybiotyk powoduje śmierć tych komórek, auksotrofy nie rosną,
antybiotyk nie działa na te komórki. Hodowla jest przenoszona na podłoża pełne, auksotrofy,
które ostały się działaniu antybiotyków, mogą się rozwijać, jako antybiotyku najczęściej
używa się penicylinę – czynnik zabijający rosnące komórki. Po hodowli można wysiać
auksotrofy na podłożę minimalne, one oczywiście nie wyrosną, ale pozwala to upewnić się,
ż

e w hodowli nie ma już prototrofów

Jak ustalamy wymagania żywieniowe auksotrofów?

•

Wysianie na podłoże minimalne z hydrolizatem kazeiny (źródło aminokwasów), jeśli

nasze auksotrofy rosną, to wiemy, że wymagają aminokwasów, sprawdzamy jakich

•

Podłoże minimalme z witaminami – tak samo

•

Podłoża z hydrolizatami RNA (mogą być drożdżowe), jeśli auksotrofy rosną, to znaczy,

e należy im dostarczyć zasady, lub całe nukleotydy

14-12-2005

Wykład 9

Selekcja mutantów indukcyjnych z nadprodukcją enzymów o znaczeniu przemysłowym

Podział enzymów:
⇒

anaboliczne (biosyntezy)

⇒

kataboliczne (rozkładu)

enzymy biosyntezy:

regulowane za pomocą sprzężenia zwrotnego
mutanty zdolne do ich nadprodukcji nie produkują represora lub nie jest on przez nie
rozpoznawany

enzymy kataboliczne:

ich produkcja może być kontrolowana przez trzy mechanizmy:

1.indukcję – polega na tym, że mikroorganizm produkuje enzym tylko w obecności

induktora, najczęściej substratu
2. sprzężenie zwrotne – synteza enzymu jest kontrolowana przez produkty reakcji
rozkładu albo przez analogi tych związków
3. represję kataboliczną – synteza enzymu jest hamowana, gdy w środowisku jest
dostępne łatwo przyswajalne źródło węgla

Aby kontrolować produkcję enzymu można manipulować składem podłoża:
- enzym indukcyjny – w podłożu powinien być induktor
- nie może być represora ani łatwo przyswajalnego źródła węgla, jednak efektywniejsze jest
izolowanie mutantów z nadprodukcją enzymu
- poszukuje się mutantów, które zamieniają enzym indukcyjny na konstytutywny

•

hodowla w chemostacie w warunkach, w których induktor jest czynnikiem

ograniczającym o stężeniu poniżej indukcji
np. izolacja Escherichia coli z B-galaktozydazą jako enzymem konstytutywnym,
induktorem była laktoza o niskim stężeniu, które nie gwarantowało indukcji, przeżyć
mogły tylko te organizmy, które produkowały enzym konstytutywny

•

przenoszenie populacji mikroorganizmów z podłoża bez induktora na podłoże z

induktorem, lag-faza organizmów z enzymem indukowanym

•

wykorzystanie podłoża z zasadniczym źródłem węgla jako substratem, który jest złym

induktorem, przeżywają organizmy, dla których to źródło węgla nie jest induktorem

•

stosowanie substratów chromogenowych (substrat, który w wyniku reakcji zmienia

barwę) na podłożu stałym, w wyniku reakcji enzym powoduje zmianę koloru substratu,
substrat chromogenowy nie może być induktorem
np. E. Coli na podłożu z glicerolem, wyrosły kolonie spryskiwano
nitrofenylogalaktozydem, kolonie, które produkowały B-galaktozydazę barwiły się na
ż

ółto (nitrofenylogalaktozyd jest substratem dla galaktozydazy, odczepia się nitrofenol)

- izolacja mutantów produkujących enzym w obecności represora (niewrażliwych na
sprzężenie zwrotne)

•

głównie Bacillusy produkujące proteazy

•

aminokwasy są represorami, ale także hamują sporulację

•

izoluję się szczepy zdolne do sporulacji w obecności aminokwasów

- izolacja mutantów odpornych na represję kataboliczną:

•

poszukiwanie rewertantów wśród mutantów, które utraciły zdolność syntezy danego

enzymu

•

hodowla w chmostacie mieszaniny po mutagenizacji w obecności substratu dla danego

enzymu i represora katabolicznego (np. laktoza jako substrat, glukoza jako represor),
nastąpi dominacja organizmów, które mogą wykorzystywać oba źródła węgla

Selekcja mikroorganizmów z nadprodukcją metabolitów wtórnych
- trudna, bo nie do końca są poznane mechanizmy produkcji tych metabolitów
- metody izolacji bazują na eksperymentach
- wykorzystuje się izolację mutantów auksotroficznych, wśród których poszukuje się
organizmów z nadprodukcją metabolitów wtórnych np. antybiotyków

Ulepszanie szczepów
- hybrydyzacja (krzyżowanie szczepów) – wykorzystywana po mutagenizacji, manipulując na
zmianę mutagenizacją i składem podłoża można otrzymać organizmy o maksymalnej
wydajności, krzyżując szczepy z różnych linii otrzymujemy nowe kombinacje genów
- konstruowanie sztucznych kombinacji genów metodami inżynierii genetycznej
- można uzyskać organizmy, które efektywniej przekształcają substrat w produkt, organizmy
o zmienionych wymaganiach żywieniowych lub zmienionej morfologii wzrostu
- w wyniku manipulacji genetycznych mogą powstawać słabe szczepy, które będą wypierane
przez szczepy dzikie, natomiast po hybrydyzacji powstają szczepy silniejsze
- hybrydyzacja występuje naturalnie w środowisku np. w komórkach somatycznych grzybów
- fuzja protoplastów (osobniki pozbawione ściany komórkowej, która jest barierą dla
hybrydyzacji), w wyniku hapliodyzacji dochodzi do podziału cech i wytworzenia naturalnych
szczepów o korzystnych cechach (wymagania żywieniowe, morfologia wzrostu, efektywność
przekształcania substratu.

11-01-2005

Wykład 10

IMMOBILIZACJA
- unieruchomienie, ograniczenie ruchliwości katalizatora (enzymy, komórki, organella)
- enzymy trzeba wyizolować i oczyścić

Po co się to robi?
⇒

Jest to opłacalne, gdyż rozwiązuje problemy produkcji ciągłej

⇒

Może być większe upakowanie katalizatora w reaktorze

⇒

Omijamy problem usunięcia katalizatora z produktu

⇒

Większa stabilność, trwalsza struktura białkowa

Wady:
⇒

Większe koszty inwestycyjne

⇒

Szybkość reakcji wolniejsza – ograniczenia dyfuzji

⇒

Część katalizatora może ulec dezaktywacji

Dyfuzja – proces wolny, szybkość transportu wywołana gradientem stężeń

1.

Fizyczne metody immobilizacji

•

Sorpcja (ad-, ab-) – katalizator jest związany z powierzchnią jakiegoś nośnika

oddziaływaniami:

Elektrostatycznymi

Oddziaływaniami Van der Waalsa

Hydrofobowymi

•

Ograniczony ruch w przestrzeni komórek, ale nie unieruchamiamy na żadnym nośniku

– w odpływie jest membrana półprzepuszczalna, która nie zatrzymuje produktu, a
zatrzymuje katalizator, mankamentem jest niedoskonałość membran, bardzo szybko
ulegają zatkaniu, co sprawia, że są mało wydajne
Jak zwiększyć wydajność:

Zwiększenie powierzchni membrany

Mieszanie, żeby oderwać cząstki osadzone na membranie

Zwinięta membrana – jest porowata, pory są asymetryczne – rozszerzają się na zewnątrz, z
takich kapilar tworzy się tzw. moduły

Moduł membranowy – rura zamknięta z każdej strony dnami sitowymi, które dają dostęp do
ś

wiatła kapilar, takie moduły służą też do hodowli tkankowych, mikrorurki pełnią rolę naczyń

krwionośnych, które dostarczają związki odżywcze, a odbierają metabolity

•

Mikrokapsułkowanie – zamyka się komórki w niewielkich przestrzeniach za pomocą

jakiegoś polimeru np. membrany z nylonu (poliamidy), taka membrana ma odpowiednie
pory zapewniające kontakt z otoczeniem, aby pobierać związki odżywcze i oddawać
metabolity, takie mikrokapsułki można wykorzystywać jako sztuczne organy

•

Unieruchamianie w żelach – komórki są zawieszone w roztworze wodnym, wkraplamy

polimer, który w tych warunkach polimeryzują, np. agaroza – polimeryzuje w obecności
jonów wapniowych, otrzymujemy komórki tkwiące w żelu – „pułapkowanie” w sieci
polimerowej, mankamentem tej metody jest to, że dyfuzja substratów i produktów jest
utrudniona

Chemiczne metody immobilizacji

Cechy nośnika:

⇒

Trwały mechanicznie, chemicznie i biologicznie, tzn. nie może ulec sprasowaniu (np. w

kolumnie), nie zmienia właściwości chemicznych, odporny na zjedzenie

⇒

Posiada odpowiednio rozwiniętą powierzchnię, żeby był większy stopień upakowania

⇒

Posiada grupy funkcyjne, aby umożliwić tworzenie wiązań z katalizatorem

Nośniki syntetyczne:

ceramiczne lub szklane mikrokulki – drogie!

materiały polimerowe: polistyren, poliamid, mogą być mikrokulki, pierścionki, dyski (jak

czerwone krwinki)

Chemiczne wiązania są zazwyczaj trwalsze niż fizyczne, ale immobilizacja taka jest bardziej
skomplikowana.

Nośniki naturalne:

agarozowe

celulozowe

Łatwo przeprowadzić z nimi reakcje wiązania chemicznego, są tańsze niż nośniki
syntetyczne i łatwo dostępne, ale z drugiej strony są nietrwałe – podatne no rozkład
biologiczny (mikroorganizmy go zaatakują i zjedzą☺)

Immobilizacja poprzez wiązania jonowe – wykorzystuje się rożnego rodzaju

jonowymieniacze, doprowadza się do wytworzenia wiązań jonowych między
katalizatorem a nośnikiem, są mniej trwałe niż wiązania chemiczne, ich trwałość zależy
od warunków w reaktorze: pH, siła jonowa

18-01-2006

Wykład 11

Zastosowanie komórek immobilizowanych w przemyśle:

1.

Produkcja aminokwasów – koniec lat 70-tych a Japonii, technologia rozdziału mieszanin

racemicznych przy pomocy immobilizowanych komórek
Podczas produkcji powstaje racemat, zawierający formy L i D, potrzebna nam jest tylko
forma L, jako występująca naturalnie. Chemiczne metody rozdzielania są bardzo trudne.
Immobilizowane komórki E. Coli w kolumnie jonowymiennej związane wiązaniami
jonowymi w odpowiednim pH. Przez kolumnę przepuszczano racemat N-
acylo(L,D)aminokwasów. Komórki były źródłem acylazy, która odszczepiała grupę
acylową tylko od formy D. Okres półtrwania (czas, po którym aktywność enzymu spadła
o połowę) wynosił 62h, czas przebywania – 0,5h. W ten sposób produkowano lizynę,
kwas aspartylowy

Przemysł cukrowy – w burakach są różne cukry np. rafinoza, która przeszkadza w

krystalizacji sacharozy. Grzyby w postaci suszonej grzybni są źródłem enzymu rafinazy.
Grzyby są immobilizowane, przepuszcza się sok buraczany, usuwana jest rafinoza.
Immobilizacja polega na tym, że komórki są zbite w jedną masę.

Immobilizacja laktazy – niektóre niemowlęta mają wrodzoną wadę – nie rozkładają

laktozy, cukru występującego w mleku. Do produkcji mleka bez laktozy wykorzystuje się
drożdże immobilizowane we włóknach celulozowych (octan celulozy). Podczas
polimeryzacji komórki drożdży były pułapkowane we włókienku. Drożdże były źródłem

laktazy, musiały być zmodyfikowane, bo normalnie drożdże nie produkują laktazy.
Mleko filtrowano przez te rurki, w tym czasie laktoza była rozkładana.

W tych procesach enzymy pochodziły z martwych komórek. Nie trzeba ich karmić, nie
namnażają się, więc łatwiej jest operować takim reaktorem.
Ż

ywe komórki immobilizowane nastręczają dużo trudności m.in. dostarczanie tlenu, wzrost

(rozsadzałyby rurki). Na granulkach rozrastające się komórki szybko by zatkały kolumnę.
Stosując żywe immobilizowane komórki trzeba je utrzymywać na stałym poziomie, nie
dopuszczając do ich rozrostu, tzn. ściśle kontrolować ilość dostarczanego źródła węgla. Jeśli
zastosuje się martwe komórki, to po wyczerpaniu się enzymu jest koniec reakcji, trzeb je
wyrzucić.

Produkcja antybiotyków – m. in. penicyliny, komórki są immobilizowane na Cefadeksie

(cefadex?), okres półtrwania wynosi 100 dni

Produkcja akrylamidu – immobilizowana hydrataza nitrylowa z Rhodococcus

immobilizowanego na żelu

TYPY HODOWLI

Hodowla na podłożach ciekłych

→

hodowla wgłębna – mikroorganizmy rosną w całej objętości podłożą – ten typ

przeważa
→

hodowla powierzchniowa – na powierzchni pożywki tworzy się kożuch z

mikroorganizmów
→

hodowla z unieruchomionym materiałem biologicznym

Hodowle wgłębne są teraz najpopularniejsze:
⇒

Są dobre systemy napowietrzania i jest wszędzie dostępny tlen

⇒

Dobre systemy mieszania, np. łagodne mieszanie w przypadku wrażliwych mechanicznie

komórek

⇒

Nowe szczepy, które mogą żyć w całej objętości

Hodowla na podłożach stałych

Stosowane głównie dla grzybów: strzępkowce, promieniowce. Są to hodowle bardzo
proste, Całe pomieszczenie jest termostatowane (odpowiednia wilgotność), na paletach z
podłożem rozpyla się spory lub strzępki grzybów
Podłoża: ziarna zbóż, pokruszone pieczywo, wysłodki – pozostałość po produkcji cukru z

buraków, otręby

Hodowle takie są bardzo łatwe, otrzymuje się produkty o wysokim stężeniu, są duże
wydajności, wykorzystuje się surowce odpadowe (tanie podłoże). Problemem może być
nierównomierna temperatura. Mikroorganizmy produkują ciepło, które trzeba jakoś
odprowadzić, żeby się mikroby nie przegrzały, dlatego warstwa podłoża musi być
możliwie najcieńsza.

25-01-2006

Wykład 12

Szybkość wzrostu:

max

Gdzie K

jest to stała zużywania substratu, jest miarą powinowactwa mikroorganizmów do

substratu, im większe powinowactwo, tym niższa K

Produktywność hodowli okresowych:

Gdzie dp/dt to szybkość tworzenia produktu, Q

– specyficzna szybkość tworzenia produktu,

x – biomasa

Wraz ze wzrostem szybkości wzrostu, wzrasta szybkość tworzenia produktu.
Specyficzna szybkość tworzenia produktu może, ale nie musi, być związana ze specyficzną
szybkością wzrostu
Przy hodowlach okresowych tworzenie metabolitów wtórnych polega na tym, że staramy się
skracać fazę wzrostu wykładniczego. Dla metabolitów pierwotnych staramy się wydłużać
fazę wykładniczą.

Hodowla okresowa

Zalety:

Nie wymagają skomplikowanego oprzyrządowania – tania

Łatwo utrzymać (łatwiej niż w ciągłych) jałowość hodowli

Odnawialność inokulum – odzyskuje się komórki

Wady:

Niska produktywność – dosyć długi czas jałowy, sama hodowla trwa krótko, ale

na czas ogólny składa się czas hodowli i czas jałowy: t

= t

+ t

Stosunek t

jest bardzo niekorzystny np. 1, produktywność niższa niż w hodowli

ciągłej

Hodowle okresowe pracują z niejednakową szybkością, gdyż zmienia się

stężenie substratu

Nie ma możliwości regulacji stężenia substratu

Hodowla półokresowa – okresowa ze stałym dostarczaniem substratu, jest dopływ substratu,
nie ma odpływu, zmienia się objętość reaktora, w takiej hodowli możemy zmieniać stężenie
substratu i utrzymywać je na stałym poziomie, natężenie dopływu pożywki zwiększa się,
gdyż przyrasta biomasa, dozowanie może być skokowe (częściej) lub ciągłe, może też być
okresowy odpływ, kiedy objętość reaktora dojdzie do jakiejś wartości maksymalnej

Zalety:

Duża elastyczność hodowli – można zmieniać różne parametry

Można kontrolować poziom substratu

Bardzo prosta jest automatyzacja tzn. jakiś czujnik stężenia połączony z pompą

tłoczącą substrat, jeśli jest sygnał od czujnika, że jest za niski poziom substratu,
włącza się pompa

Wady:

Sterylność pożywki – może dochodzić do zakażenia hodowli

Często następuje degeneracja mikroorganizmów – mogą powrócić do cech

rodzicielskich i wypierać komórki zmutowane → mniejsza produktywność

Hodowla ciągła – w reaktorach przepływowych – jest ciągłe zasilanie i ciągły odpływ,
stosowana tam, gdzie potrzebna jest bardzo ścisła kontrola stężenia substratu, zwłaszcza gdy
wysoki poziom substratu hamuje produktywność komórek.
Hodowle te nadają się najlepiej do otrzymywania biomasy i metabolitów pierwotnych, gorzej
z produkcją metabolitów wtórnych.
Nie nadają się do niej organizmy o niedużej szybkości wzrostu, są wypierane przez szybko
rosnące komórki, ciągle nam wypływają z reaktora, więc muszą się szybko mnożyć, aby ich
ilość w reaktorze była wystarczająca

Zalety:

Wysoka produktywność

Można łatwo zautomatyzować

Można łatwo kontrolować i regulować na bieżąco parametry hodowli: stężenie

substratu, pH

Wady:

Wysokie koszty inwestycyjne

Są bardzo wrażliwe na zakażenie – przez dopływ tlenu, pożywki, czynników

stabilizujących pH, trudno zachować sterylność hodowli

METODY BEZTLENOWE

Przeważnie produkuje się z wykorzystaniem organizmów tlenowych, produkcja beztlenowa
jest trudniejsza

Zastosowanie metod beztlenowych:

oczyszczanie ścieków – fermentacja osadów ściekowych → produkcja biogazów

fermentacja – ze związków wielkocząsteczkowych powstają niskocząteczkowe

kwasy organiczne, zakwasza się środowisko i warunki są beztlenowe

fermentacja metanowa – powstaje metan i wydziela się wodór w warunkach

beztlenowych

biogaz jest dobrym paliwem, które jest używane zazwyczaj na miejscu przy oczyszczalni
ś

cieków, przekształcana w energię elektryczną, która jest zużywana przez oczyszczalnię

na własne potrzeby

produkcja etanolu – w gorzelniach w warunkach beztlenowych

fermentacja acetonowo-butanolowa – Clostridium acetobutyricum – bezwzględny

beztlenowiec, ale wzrost tej bakterii jest zahamowany już przy 2,5% stężeniu tych
rozpuszczalników – trzeba je odprowadzać z reaktora

KONIEC☺