W.Duszkiewicz-Reinhard, R.Grzybowski, E.Sobczak „Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej.”

W.J.H.Kunicki-Goldfinger „Życie bakterii.”

Badanie czystości wody i powietrza

Atmosfera jako ośrodek rozprzestrzeniania się bakterii. Metody liczenia drobnoustrojów

Woda to pierwotne środowisko bytowania drobnoustrojów. Jest to zespół mikronisz ekologicznych, charakteryzujący się określonymi warunkami wzrostu dla drobnoustrojów (stopień żyzności, dostępność substratów odżywczych, temperatura). Drobnoustroje występujące w powietrzu rzadko pochodzą z gleby. Najczęściej rozsiewane są przez chorych, mogą też być rozprzestrzeniane przez wiatr, np. z wysypisk śmieci. Powietrze jest ich wtórnym środowiskiem, nie zapewniającym im dobrych warunków bytowania. Często drobnoustroje przebywają w nim czasowo. W środowiskach naturalnych oprócz mikroflory autochtonicznej, występują również drobnoustroje allochtoniczne, w tym także chorobotwórcze, doprowadzone tam wraz z odpadami stałymi lub ściekami. Odpady stałe, zwłaszcza pochodzące z dużych aglomeracji miejskich, poddaje się utylizacji, a ścieki przemysłowe i komunalne oczyszczaniu w oczyszczalniach lokalnych lub zbiorczych (grupowych). Biodeterioracja obniżenie sprawności biologicznej śmieci, jak również oczyszczanie biologiczne ścieków odbywa się przy wydatnym udziale drobnoustrojów. W ocenie surowców, półproduktów, produktów oraz w ocenie prawidłowości prowadzonych procesów technologicznych w przemyśle spożywczym niezbędna jest znajomość zawartości mikroflory w środowisku, czyli ocena stopnia zakażenia. Duża zawartość mikroflory niepożądanej może być oznaką zepsucia i złego stanu sanitarnego, np. podczas produkcji wędlin, lub też może wskazywać na prawidłowy przebieg procesu, np. duża liczba drożdży szlachetnych w fermentującym moszczu owocowym. Sposoby oznaczania różnych drobnoustrojów w poszczególnych produktach oznaczają normy. Podają one w jaki sposób pobierać próbki do oznaczeń, w jaki sposób przygotowywać je do analizy i na jakich podłożach je analizować. Pobrana próbka powinna być reprezentatywna dla całej partii badanego materiału. Drobnoustroje są rozmieszczone w środowisku przypadkowo, w sposób nieregularny. Pobierając próbkę nie mamy pewności czy znajdują się w niej wszystkie obecne w całym środowisku, w wyniku niedokładności oznaczeń i przy małej liczbie powtórzeń błąd w uzyskanym wyniku może być duży. Zakłada się iż błąd oznaczeń nie powinien być większy niż 10-15% w praktyce laboratoryjnej i nie większy niż 3-5% w badaniach naukowych. Liczbę drobnoustrojów podaje się w przeliczeniu na jednostkę masy (zwykle na 1 gram) lub na jednostkę objętości (zwykle 1 cm³). Wyróżnia się trzy grupy metod oznaczania drobnoustrojów:

1. bezpośredniego liczenia (mikroskopowe).

2. pośredniego liczenia (hodowlane)

3. wskaźnikowe.

Metody bezpośredniego liczenia:

b. Metody bezpośredniego liczenia

Metody te polegają na bezpośrednim liczeniu drobnoustrojów pod mikrosko­pem. Różnice pomiędzy poszczególnymi mikroskopowymi metodami liczenia sprowadzają się do różnych sposobów przeliczania liczby komórek widzianych w polu widzenia mikroskopu na jednostkę masy lub objętości badanego materiału.

• Liczenie przy użyciu komór. Komory do liczenia drobnoustrojów pod mi­kroskopem mają postać szklanych płytek z wyciętym wgłębieniem, podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni. Używane są komory Thoma (hemocytometr), Howarda, Biirkera, Fuch Rosenthala i inne. Różnią się one wymiarami powierzchni, na których liczy się drobno­ustroje. Dane dotyczące powierzchni i głębokości podane są na komorach. W komorach można głównie liczyć tylko większe komórki drobnoustrojów, takie jak drożdże, zarodniki i strzępki grzybów. Ograniczenia te wynikają po pierw­sze stąd, że grubość i głębokość komory nie pozwalają na użycie obiektywów o du­żej sile powiększenia, a więc tym samym o małej odległości roboczej, i po drugie - przy dużej głębokości komory (100 mikrometrów = 0,1 mm) małe drobnoustroje, np. bakterie o średnicy 5 mikrometrów (firn), mogą układać się w wielu płaszczy­znach i przy użyciu silniejszych obiektywów o małej głębi ostrości część komórek położona nad i pod płaszczyzną pola widzenia będzie niewidoczna. Komora Thoma jest to grube szkiełko przedmiotowe z wyciętymi wgłębieniami o głębokości 0,1 mm (100 (μm). Wgłębienia te widoczne są gołym okiem po obydwu stronach środkowego kanalika jako równomierne krzy­że, powstałe z przecięcia linii wyznaczających regularne, kwadratowe i prostokątne powierzchnie. Bok kwadratu wynosi 1/20 mm (50 μm). Powierzchnia kwadracika wynosi więc 1/400 mm² (2500 μm²). W każdej siatce znajduje się 400 kwadraci­ków. Po przykryciu komory szkiełkiem przykrywkowym nad każdym kwadraci­kiem powstaje prostopadłościan o objętości 1/400 mm² x 0,1 mm = 1/4000 mm³ (2500 μm² x 100 μm = 25 000 μm³). Co piąty kwadrat w obu kierunkach podzielo­ny jest na pół dodatkową linią, w wyniku czego część kwadratów ma powierzchnię o połowę mniejszą, a cała komora podzielona jest w ten sposób na 16 dużych kwa­dratów, z których każdy składa się z 16 małych kwadracików. Na przecięciu dodat­kowych linii powstają maleńkie kwadraciki o czterokrotnie mniejszej powierzchni równej l/1600 mm². Na powierzchni komory Thoma wyżłobione są trzy kanaliki tworzące literę H, dwa poprzeczne i jeden środkowy - łączący je. Mają one za zadanie zatrzymywać nadmiar płynu naniesionego na komorę. Oznaczanie liczby drobnoustrojów przy użyciu komory Thoma wykonuje się następująco. Zawiesinę komórek drożdży mających tendencję do zlepiania się roz­cieńcza się, biorąc 3 objętości zawiesiny i l objętość kwasu siarkowego rozcień­czonego wodą w stosunku 1:10, wytrząsa się kilka minut, przenosi szybko do komory Thoma, przykrywa szkiełkiem przykrywkowym i przystępuje do liczenia. Po ustawieniu oświetlenia, należy znaleźć siatkę komory najpierw przy obiektywie 10x, a następnie przy obiektywie 40x. Jeśli stwierdzi się zbyt duże zagęszczenie drobnoustrojów, to należy próbę rozcieńczyć ilościowo, np. 10-krotnie, i powtó­rzyć oznaczenie. Oblicza się średnią liczbę drobnoustrojów z około 40 małych kwadracików (o powierzchni 1/400 mm²). W sumie należy policzyć około 700 komórek, by błąd nie przekroczył 10%. Komórki rozmieszczone są nierównomiernie, w jed­nych kwadracikach może być ich kilka, a w innych - kilkanaście.

Przy średniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a) i rozcieńczeniu (n), zawartość komórek (L) w l cm³ wynosi:

L = 4 • 10⁶ • a • n

Komora Bürkera ma, podobnie jak komora Thoma, głębokość 0,1 mm, natomiast podzielona jest na większe kwadraciki. Bok podstawowego kwadracika wynosi 0,2 mm, czyli powierzchnia wynosi 0,04 mm², a objętość pro­stopadłościanu pod szkiełkiem przykrywkowym 0,004 mm³.

• Liczenie metodą Breeda. Na znanej powierzchni szkiełka przedmioto­wego dokładnie odtłuszczonego rozprowadza się znaną objętość zawiesiny pobra­ną pipetką Breeda (0,01 cm³ ) lub oczkiem Burriego (0,001 cm³ ). Po wykonaniu rozmazu, utrwaleniu i zabarwieniu preparatu liczy się pod mikroskopem średnią liczbę komórek w trzech preparatach przygotowanych z tej samej zawiesiny, a w każdym preparacie oblicza się średnią z 20 przypadkowo wybranych pól wi­dzenia. Z otrzymanych wyników oblicza się średnią arytmetyczną liczby komórek w polu widzenia (a). Mikrometrem okularowym lub komorą Thoma mierzy się promień pola widzenia (r) danego układu optycznego i oblicza się powierzchnię pola widzenia (∏r²). Znając powierzchnię rozmazu preparatu na szkiełku przed­miotowym (A), oblicza się zawartość mikroflory (L) w objętości zawiesiny nanie­sionej na szkiełko:

L = A / ∏r² · a

Uwzględniając rozcieńczenie i mnożnik do przeliczenia pobranej do rozmazu objętości na l cm³ (100 dla pipetki Breeda i 1000 dla oczka Burriego), oblicza się zawartość mikroflory w l cm³. Aby błąd w tej metodzie nie przekroczył 10%, na­leży policzyć około 150 komórek.

• Liczenie drobnoustrojów w preparacie mokrym. Kroplę zawiesiny umieszcza się pod szkiełkiem przykrywkowym i liczy średnią liczbę komórek z 20 pól widzenia. Zakłada się, że grubość preparatu wynosi 0,01 mm. Oblicza się powierzchnię pola widzenia mikroskopu (∏r²), jak podano wyżej. Mnożąc powie­rzchnię pola widzenia przez grubość preparatu, oblicza się objętość walca, w któ­rym obliczono średnią liczbę komórek (a).

Zawartość drobnoustrojów w l cm³ oblicza się ze wzoru:

L = 1000 / 0,01 · ∏r² · a · n gdzie:

1000 - przeliczenie na 1 cm³,

a - średnia zawartość komórek w polu widzenia,

n -rozcieńczenie,

r - promień pola widzenia,

Modyfikacją tej metody jest sposób podany przez Majchrzaka. Pobiera się 1 cm zawiesiny do pipety i powoli wypuszcza krople, licząc, ile kropli mieści się w 1 cm . Jedną kroplę umieszcza się pod szkiełkiem przykrywkowym o znanej po­wierzchni. Oblicza się średnią liczbę komórek z 20 pól widzenia i uwzględniając rozcieńczenia, oblicza się zawartość drobnoustrojów w 1 cm³ według wzoru:

L = a · p · b ·n / ∏r² lub L = p / ∏r² · a · b ·n

gdzie:

a - średnia liczba komórek z 20 pól widzenia,

b - liczba kropli w 1 cm ,

p - powierzchnia szkiełka przykrywkowego,

n - rozcieńczenie.

c. Pośrednie (hodowlane) metody liczenia drobnoustrojów

W metodach hodowlanych nie liczy się komórek drobnoustrojów, lecz ich po­pulacje po wyhodowaniu na podłożu płynnym (metoda rozcieńczeń) lub na podło­żu stałym (metoda płytkowa).

METODA ROZCIEŃCZEŃ polega na rozcieńczeniu badanej zawiesiny tak, żeby w 1 cm³ znajdowała się teoretycznie 1 komórka. Zawiesiną tą szczepi się kilkadziesiąt probówek z jałowym, płynnym podłożem i po inkubacji na podstawie stosunku liczby probówek jałowych do zakażonych, matematycznie oblicza się zawartość drobnoustrojów w 1 cm . Dokładność metody zależy od przygotowania właściwych rozcieńczeń i od liczby zaszczepionych probówek.

METODA PŁYTKOWA została wprowadzona przez R. Kocha w 1881 roku. Jest to w miarę prosta, dokładna i szeroko stosowana metoda, gdyż oprócz liczenia znalazła zastosowanie do izolowania czystych kultur i obserwacji morfologicznych kolonii drobnoustrojów. Zasada metody polega na wysiewie odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny drobnoustrojów na podłoże stałe, inkubacji i liczeniu wyrosłych kolonii. Zakłada się, że komórki występują pojedynczo i że z każdej komórki wyrośnie jedna kolonia. Pierwszym i bardzo ważnym etapem oznaczenia jest przygotowanie właściwego rozcieńczenia zawiesiny. Najlepsze jest takie rozcieńczenie żeby w l cm³ znajdowało się 30-300 komórek, gdyż ta liczba kolonii jest najła­twiejsza do policzenia na płytce. Mniejsza liczba kolonii zwiększa błąd oznaczenia, a większa - utrudnia ich policzenie.

Wielkość rozcieńczenia można ustalić orientacyjnie metodami mikroskopowy­mi. Wstępnie można przyjąć, że jeśli w polu widzenia obiektywu 60x znajduje się jedna komórka, to w 1 cm³ znajduje się 200 tyś. drobnoustrojów. Dla większej pewności uzyskania płytek z odpowiednimi rozcieńczeniami posiewa się dodatko­wo płytki z rozcieńczenia większego i mniejszego co najmniej w dwóch powtórze­niach. Zwykle przygotowuje się równoległe serie rozcieńczeń z dwóch odrębnych próbek analizowanego produktu. Rozcieńczenia przygotowuje się przy użyciu jało­wego roztworu Ringera lub roztworu fizjologicznego, przygotowanego w porcjach po 9 cm³ w buteleczkach o pojemności około 20 cm³ i po 90 cm³ w buteleczkach o pojemności około 200 cm³. Nie należy używać wody destylowanej do rozcień­czeń, gdyż powoduje ona plazmoptyzę komórek. Buteleczki przed rozcieńczaniem należy opisać, podając rodzaj próby, rozcieńczenie oraz nazwisko wykonującego oznaczenie. Buteleczki nie oznakowane (szczególnie bez podanego rozcieńczenia) łatwo można poprzestawiać w czasie pracy i w następstwie uzyskać niedorzeczne wyniki. 10 cm³ badanej próby przenosi się do 90 cm³ lub 1 cm³ do 9 cm³ rozcień­czalnika (drugi sposób jest mniej dokładny) i miesza się dokładnie obracając kilka minut między dłońmi. Z otrzymanego 10-krotnego (l0^-1) rozcieńczenia przygoto­wuje się w analogiczny sposób następne dziesiętne rozcieńczenia, np. 10^-2, 10^-3, 10^-4 itd,, zachowując jak najdalej idącą jałowość. Jeśli do posiewów potrzebne są tylko duże rozcieńczenia (przy wysokim stopniu zakażenia próby), to pierwsze roz­cieńczenia mogą być 100-krotne. Przygotowanie rozcieńczeń jest bardzo ważnym elementem oznaczenia i dlatego trzeba wykonać je bardzo starannie, zwracając szczególną uwagę na:

- ostrożne przeniesienie (bez strat) próbki do rozcieńczalnika i dokładne opróżnienie pipety;

- dokładne wymieszanie próbki przed pobraniem i po rozcieńczeniu (ostroż­nie, by nie zamoczyć korka);

- posianie rozcieńczeń na płytki nie później niż 15 minut po rozcieńczeniu;

- wykonanie rozcieńczenia inną pipetą; jeśli używa się tej samej pipety, należy po wymieszaniu próbki przepłukać ją 2-3 razy rozcieńczoną zawiesiną;

- pipety zużyte umieścić w płynie odkażającym.

Posiewy. Z przygotowanych rozcieńczeń posiewa się jałowo na płytki po 1 cm³ zawiesiny. Przed przystąpieniem do posiewów należy opisać płytki, tzn. odnotować na wieczku rodzaj próby, podłoże, rozcieńczenie, datę posiewu oraz imię i nazwisko wykonującego oznaczenie. Posiewy na płytki można wykonywać równolegle z rozcieńczeniami, tzn. najpierw przenosi się 1 cm³ rozcieńczonej zawiesiny do kolejnej buteleczki, a następnie tą samą pipetą przenosi się 1 cm³ na płytkę. Jeśli zawiesinę posiewa się na płytki, to po zakończeniu rozcieńczeń można jedną pipetą zrobić wszystkie posiewy, zaczynają jednak od największych rozcieńczeń. Po posianiu zawiesiny na płytki, nie później niż po 15 minutach, wy­lewa się na płytki podłoże rozpuszczone i zestudzone. Podłoże żelatynowe można zestudzić do 35°C, podłoże agarowe - do 45-50°C (przy niższej temperaturze agar krzepnie, a przy wyższej można zniszczyć część mikroflory). Wylane podłoże na­leży natychmiast dokładnie wymieszać z posianą zawiesiną, poruszając ostrożnie płytkę ruchem kolistym po powierzchni stołu tak, aby nie zamoczyć brzegów płyt­ki i wieczka (może to spowodować przyklejenie wieczka do denka i zakażenie). Jeśli płytki są zimne i zachodzi obawa zbyt szybkiego krzepnięcia agaru, można denka płytek lekko ogrzać nad palnikiem. Wylane płytki po zakrzepnięciu inkubuje się w warunkach najkorzystniejszych dla spodziewanych drobnoustrojów. Rodzaj zalecanych podłóż i warunki hodowli dla poszczególnych produktów spo­żywczych podają odpowiednie normy. Płytki agarowe inkubuje się do góry dnem, a płytki z żelatyną normalnie.

W celu sprawdzenia jałowości użytych materiałów można równolegle wylać płytki zaszczepione 1 cm³ samego rozcieńczalnika i płytki z samym podłożem.

• Odczytanie wyników. Po inkubacji liczy się kolonie wyrosłe na płytkach. Do obliczeń bierze się płytki, na których liczba kolonii wynosi 15-300 (PN-ISO--4833). Oblicza się średnią arytmetyczną z płytek równoległych. Jeśli ostateczne wyniki (w przeliczeniu na 1 g lub 1 cm³) z sąsiednich rozcieńczeń nie różnią się więcej niż o 10%, to oblicza się średnią arytmetyczną tych wyników. Przy braku ko­relacji między wynikami różnych rozcieńczeń za podstawę obliczeń przyjmuje się wyniki z większego rozcieńczenia. Liczone kolonie należy zaznaczać na denku płyt­ki dermatografem, aby umknąć ponownego policzenia tej samej kolonii. Do liczenia kolonii można użyć płytki Wolffhugla lub specjal­nego aparatu (mikroaditora) zaopatrzonego w lu­pę i podświetlenie z barwnymi filtrami. Przy gęściejszym wzroście można liczyć ko­lonie, podkładając pod płytkę specjalnie przygo­towaną podkładkę podzieloną na kwadraciki o znanej powierzchni, np. l cm² . Liczy się liczbę kolonii na powierzchni kilkunastu kwadracików i przelicza na powierzchnię całej płytki. W przy­padku bardzo dużego zagęszczenia kolonii o ma­łych wymiarach (gdy nie ma płytek z większymi rozcieńczeniami) można liczyć kolonie pod mi­kroskopem przy obiektywie 10x. Liczy się śred­nią liczbę kolonii z 25-50 pól widzenia, oblicza promień pola widzenia, promień powierzchni płytki i uwzględniając rozcieńczenia, oblicza za­wartość drobnoustrojów w l g lub w l cm³ bada­nej próby, posługując się wzorem:

L = (R² / r²) · a · n

gdzie:

R - promień płytki,

r - promień pola widzenia,

a - średnia liczba kolonii w polu widzenia,

n - rozcieńczenia.

d. Metody wskaźnikowe:

Wskaźnikowe metody liczenia drobnoustrojów informują o ogólnym stopniu zakażenia środowiska i o aktywności mikroflory. Metodami tymi określa się obec­ność niektórych grup drobnoustrojów występujących nawet w niewielkich ilo­ściach, ale wskazujących na stan sanitarny surowca lub produktu, a jednocześnie trudnych do hodowania metodami płytkowymi. Do wskaźnikowych metod należą: oznaczanie miana coli, Bacillus mesentericus, miana enterokoków, wykrywanie obecności beztlenowców oraz próby reduktazowe. Metody te będą omawiane przy analizie poszczególnych produktów spo­żywczych. Ponadto ilość drobnoustrojów można określać przez:

- pomiar objętości odwirowanego osadu drobnoustrojów (stosowany głównie do drożdży i pleśni);

- pomiar masy odwirowanego osadu drobnoustrojów;

- oznaczanie zawartości azotu w biomasie;

- pomiar światła rozproszonego przez zawiesinę drobnoustrojów (metoda nefelometryczna);

- pomiar światła zaabsorbowanego przez zawiesinę drobnoustrojów (metoda turbidymetryczna).

e. Ocena metod liczenia

Oznaczając zawartość drobnoustrojów w tym samym środowisku różnymi me­todami, można otrzymać nieporównywalne wyniki. Dotyczy to różnic między mikroskopowymi i hodowlanymi metodami liczenia. Na rozbieżności wpływają m.in. następujące przyczyny:

1) w metodzie mikroskopowej liczy się wszystkie komórki, w tym również pojedyncze komórki w łańcuszkach czy dwoinkach, które na płytkach wyrastają jako jedna kolonia;

2) w metodzie płytkowej wyrastają w postaci kolonii tylko:

a) żywe komórki (liczone pod mikroskopem),

b) komórki, którym odpowiada podłoże i warunki hodowli, takie jak temperatura, dostęp tlenu, pH.

Wybierając metodę liczenia drobnoustrojów w danym środowisku, należy kie­rować się celem, który chcemy osiągnąć. Metody mikroskopowe pozwalają szybko ocenić liczbę komórek, nie dając odpowiedzi na temat ich żywotności i jakości, na­tomiast metody hodowlane pozwalają określić zawartość mikroflory żywej, zdolnej do rozwoju w danych warunkach.

Metody oznaczania czystości wód, Mikroflora wody i powietrza:

2. Mikrobiologia wody

Woda jest naturalnym środowiskiem bytowania wielu organizmów żywych, w tym również drobnoustrojów. Drobnoustroje spełniają w wodzie rolę szczególną. W ekosystemie wodnym można wyróżnić wśród czynników biotycznych, czyli organizmów żywych, trzy główne grupy:

• Producenci, czyli organizmy samożywne, wykorzystujące substancje nie­organiczne do budowy związków organicznych. Należą tu rośliny zielone, bakterie fotosyntetyzujące i chemosyntetyzujące. Producenci warunkują życie wszystkich innych organizmów różnożywnych.

• Konsumenci to organizmy zwierzęce żywiące się gotowymi substancjami organicznymi w postaci żywych lub martwych organizmów.

• Reducenci to bakterie różnożywne oraz grzyby wodne. Większość z nich jest saprofitami i żywi się ciałami producentów, konsumentów i innych reducentów oraz organicznymi produktami metabolizmu wszystkich organizmów.

Drobnoustroje należą więc do grupy producentów wytwarzających związki organiczne i do grupy reducentów rozkładających związki organiczne do substancji prostych.

W wodach lądowych znaleźć można przedstawicieli prawie wszystkich grup drobnoustrojów. Oprócz form typowo wodnych występują drobnoustroje bytujące normalnie w glebie, powietrzu, przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt i inne. Liczba, jakość i rozwój drobnoustrojów w wodzie zależy od warunków przyrodni­czych, klimatycznych, meteorologicznych, rodzaju dna, pory roku, pory doby oraz charakteru, jakości i głębokości wody. Drobnoustroje występujące w wodzie moż­na podzielić na dwie grupy:

1. Drobnoustroje autochtoniczne, czyli tubylcze, dla których woda jest natu­ralnym środowiskiem bytowania i rozwoju.

2. Drobnoustroje allochtoniczne, czyli naniesione, do których zalicza się:

-drobnoustroje pochodzące z powietrza i gleby;

-drobnoustroje przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt przedostające się
wody wraz z odchodami bezpośrednio lub za pośrednictwem ścieków komunalnych;

-drobnoustroje pochodzące ze ścieków przemysłowych (drożdżowni, browa­rów, zakładów mięsnych i mleczarskich).

Mikroflorę autochtoniczną wód stanowią przede wszystkim bakterie autotroficzne, foto- i chemosyntetyzujące. Należą do nich bakterie siarkowe z rodzajów Beggiatoa, Thiothrix, Thioploca, Thiobacillus, Thiorhodaceae i Chlorobium. Mi­kroorganizmy siarkowe mają zdolność wykorzystywania siarczanów, siarczków, tiosiarczków i siarki elementarnej w swoich procesach życiowych. Z rozkładu związków siarkowych czerpią potrzebną im do życia energię i częściowo odkładają siarkę w cytoplazmie komórkowej jako materiał zapasowy. Na przykład, Thioba­cillus thiooxidans utlenia siarkę do kwasu siarkowego w myśl reakcji:

S^O + 1 1/2O₂ + H₂OH₂SO₄

Thiobacillus thioparus rozkłada tiosiarczany z wydzieleniem siarki:

5Na₂S₂O₃ + 4O₂ + H₂O-5Na₂S0₄ + H₂S0₄ + 4S

Do autotrofów należą również bakterie żelaziste z rodzajów Leptothrix, Gallionella, Crenothrix, Clonothrix. Tworzą one, podobnie jak bakterie siarkowe, dłu­gie nitki w pochewkach przesyconych wodorotlenkiem żelaza. Mogą powodować zatykanie i korozję przewodów wodnych.

Ponadto do mikroflory autochtonicznej wód należą bakterie m.in. z rodzajów Pseudomonas, Achromobacter bakteria lipolityczna- lipidy, Spirillum, Spirochaeta, Vibrio oraz grzyby: Mucor, Leptomitus, Saprolegnia pleśnie i inne.

Ze względu na ich znaczenie dla zdrowia i gospodarki człowieka mikroorga­nizmy występujące w wodzie można podzielić następująco:

a) saprofityczne, nieszkodliwe dla ludzi i zwierząt; zalicza się do tej grupy autotrofy i heterotrofy wspomniane wyżej,

b) patogenne, czyli chorobotwórcze,

c) szkodliwe w określonych gałęziach przemysłu.

Bakterie patogenne należą do drobnoustrojów allochtonicznych i dostają się do wody z przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. W wodzie nie rozmnażają się, lecz są przenoszone na następnego żywiciela. Drogą wodną przenoszona jest cho­lera wywoływana przez przecinkowca cholery (Vibrio cholerae). Bakterie te prze­żywają w wodach powierzchniowych do kilku tygodni, a w wodzie wodociągowej kilka dni.

Dur brzuszny wywoływany jest przez pałeczkę duru brzusznego (Salmonella typhi), czerwonka przez pałeczki czerwonki (Shigella flexneri i S. sonnei), tularemia wywoływana jest przez Pasteurella tularensis.

Drogą wodną może być przenoszona również brucelloza (Brucella abortus), żółtaczka zakaźna (Leptospira icterohaemorrhagiae), gorączka błotna (Leptospira grippotyphosa). Ponadto woda przenosi wirusy, np.: wirus Polio. Wykrycie drobnoustrojów patogennych pochodzenia jelitowego jest praco­chłonne i trudne m.in. ze względu na wymagania żywieniowe patogenów oraz ich małą ilość w porównaniu z innymi drobnoustrojami. Dlatego wykrywanie zanie­czyszczeń kałowych w wodzie prowadzi się pośrednio przez badanie obecności in­nych bakterii występujących w dużych ilościach w przewodzie pokarmowym, ła­twych w hodowli i przeważnie nieszkodliwych w stosunku do ludzi. Bakterie te na­leżą do grupy pałeczek okrężnicy, z których najważniejsze gatunki to Escherichia coli i Enterobacter aerogenes. Stwierdzenie zawartości bakterii z grupy coli powy­żej normy świadczy o fekalnym zanieczyszczeniu wody, a tym samym o możliwo­ści występowania bakterii chorobotwórczych. Ilościowo obecność coli określa się tzw. mianem coli.

Miano Coli, oznaczanie miana Coli dla ścieków, wód powierzchniowych i wody pitnej. Indeks Coli

Miano coli jest to najmniejsza ilość badanej próby w ml lub w g, w której stwierdza się jeszcze obecność pałeczki z grupy coli. Miano coli wyrażane jest licz­bą niemianowaną. Gdy miano coli wynosi np. 10, znaczy to, że w 10 cm lub 10 g znajduje się co najmniej jedna komórka z grupy pałeczki okrężnicy. Gdy miano coli wynosi 0,1 (10^-1), oznacza to, że jedna komórka z grupy okrężnicy znajduje się w 0,1 cm³, czyli 10 komórek w 1 cm³. Wartość miana coli jest więc odwrotnie proporcjonalna do stopnia zakażenia wody.

Zanieczyszczenie można również wyrazić indeksem coli. Indeks coli jest to liczba pałeczek okrężnicy w 1 dm³ wody. Między mianem coli i indeksem coli występuje zależność:

miano coli =1000 / indeks coli

Woda pitna w myśl ustawy (DzU nr 35 z dnia 4 maja 1990 r.) powinna chara­kteryzować się określonymi parametrami. Woda z wodociągów sieciowych powin­na mieć następujące parametry:

• miano coli nie mniejsze niż 100,

• liczba bakterii na agarze odżywczym po 24 h w temp. 37° nie większa niż 20,

• liczba bakterii na agarze odżywczym po 72 h w temp. 20° nie większa niż 100.

Woda produkcyjna stosowana w zakładach przemysłu spożywczego powinna odpowiadać pod względem stanu sanitarnego wodzie pitnej. Jakość mikrobiologi­czna wody ma szczególne znaczenie tam, gdzie woda jest jednym z głównych su­rowców (np. w winiarstwie, piwowarstwie). Zakażenia wniesione z wodą mogą poważnie zakłócić prawidłowość procesów fermentacyjnych. Również woda uży­wana do mycia urządzeń, opakowań i przewodów nie powinna zakażać powierzch­ni, z którymi się styka. Dlatego stan sanitarny wody ma bardzo duże znaczenie w technologii żywności.

Miano coli- dla wód powierzchniowych i ścieków- badamy 1 cm³. Pobieramy 1 cm³ ścieku rozcieńczamy go (10^-1 do 10^-5)- im brudniejsza woda tym więcej rozcieńczeń, rozcieńczenia posiewamy na pożywkę Eijkmana z rurkami Durhama (do oznaczania bakterii z grupy coli, zawiera ona laktozę fermentowaną przez E.coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter freundii, barwnik występujący w tej pożywce- czerwień chlorofenolowa w środowisku kwaśnym wytworzonym podczas fermentacji laktozy zmienia barwę na pomarańczową, żółtą, lub cytrynową), płynną pożywkę inkubujemy w 37^oC przez 24-48h, po 24h odczytujemy wyniki po raz pierwszy, po 48h dokonujemy ostatecznego odczytu. Ostatnia probówka w której doszło do: zmiany zabarwienia na wyżej wymienione, obecności gazu w rurce Durhama, oraz zmętnienia pożywki jest naszym szukanym mianem coli. Indeks coli to liczba komórek zawarta w 1 cm³. Jeżeli miano coli wynosi np. 10^-4 to indeks coli: 1 komórka-----0,0001 cm³ (10^-4)

x--------1 cm³

x = indeks coli

1 cm³≤ woda bardzo czysta

1-0,1 woda czysta

0,1-0,01 woda średnio zanieczyszczona

0,01> woda bardzo brudna

Miano coli dla wód wodociągowych nie może być mniejsze niż 100 (jest to najmniejsza objętość wody w której jest 1 komórka badanego drobnoustroju), dla wód studziennych nie może być mniejsze niż 50; zawsze badamy 100+1 cm³, 50+ 1 cm³. Woda studzienna -tabela odczytów.

Innymi wskaźnikami zanieczyszczenia wody są:

paciorkowce kałowe- są to bakterie nie wrażliwe na chlor, oraz toksyny takie jak azydek sodu----- do badania tych drobnoustrojów wykorzystuje się pożywki selektywne. Poza tym drobnoustroje te dobrze rosną w zakresie temperatur 10-45^oC (np. E.coli), przy pH 9,6, 65% NaCl- są osmotolerancyjne, odporne na obniżone napięcie powierzchniowe (40% żółci). Wyodrębnia się je dzięki:

-metodzie filtrów membranowych,

-metodzie probówkowej.

Woda ze stawu nie musi tu być rozcieńczana, natomiast ścieki tak.

Metoda filtracyjna:

Filtrujemy wodę w warunkach aseptycznych (jałowych i w podciśnieniu), Jałową pensetą przenosimy filtr na pożywkę i odciskamy górną stroną (tą gdzie znajdują się drobnoustroje). Filtry mają pory o mniejszej średnicy niż powierzchnia bakterii. Inkubujemy w 37^oC przez 48h. Liczymy wyrosłe kolonie (drobne, wypukłe, różowo-czerwone) i stosujemy wzór

x= a·100/V

a-ilość wyrosłych kolonii

v-objętość przesączonej próbki

x=liczba paciorkowców kałowych w 100 cm³

Stosujemy tu pożywkę płynna podwójnie stężoną. System posiewu zależy od stopnia zanieczyszczenia próbki.

W przypadku wody pitnej i wody z pływalni w obiegu zamkniętym posiewamy:

1×50 cm³, 5×10 cm³, 5×1 cm³

W przypadku wody z rzek, stawów, jezior i ścieków posiewamy:

3×10 cm³, 3×1 cm³, 3×0,1 cm³

Inkubujemy w 37^oC, przez 48h i sprawdzamy liczbę prób pozytywnych (odczytujemy z tabeli NPL- najbardziej prawdopodobna liczba paciorkowców kałowych)- jest to badanie wstępne. Badaniem potwierdzającym jest posianie prób na podłoże z fioletem inkubacja w 37^oC, przez 48h, niebieski osad oznacza obecność paciorkowców kałowych.

O zanieczyszczeniu wód mówią również Clostridium, posiewamy określoną objętość w zależności od stopnia zanieczyszczenia próby. Bakterie te redukują siarczyny do siarczków i zmieniają barwę pożywki na czarny, lub szary, smolisty.

b. Samooczyszczanie wody

Z biologicznego punktu widzenia zanieczyszczeniami są czynniki działające szkodliwie na organizmy ludzi i zwierząt w przypadku korzystania z wody do ce­lów konsumpcyjnych. Czynnikami tymi mogą być: nadmierne stężenie soli, sub­stancji organicznych, zmieniona temperatura wody, radioaktywność, mętność i bar­wa, a także obecność bakterii i wirusów chorobotwórczych. Samooczyszczanie jest naturalnym procesem usuwania zanieczyszczeń chemi­cznych przy udziale czynników biologicznych i fizykochemicznych. Zanieczysz­czenia po rozcieńczeniu wodą odbieralnika, po sedymentacji i adsorpcji zawiesin ulegają mineralizacji przy udziale mikroorganizmów wodnych, takich jak bakterie, promieniowce, grzyby, pierwotniaki, sinice i wiciowce. Przy wystarczającej zawar­tości tlenu w wodzie, w wyniku mineralizacji otrzymuje się wodę przejrzystą i po­zbawioną zapachu. Przy braku wolnego tlenu proces mineralizacji prowadzą ba­kterie beztlenowe, a produktami rozkładu zanieczyszczeń są: kwasy organiczne, aminy, amoniak, metan, siarkowodór, indol, skatol i inne związki, które nadają wodzie przykry zapach (indol, skatol) lub mają właściwości trujące (amoniak, siar­kowodór). Woda uzyskana drogą oczyszczania beztlenowego jest nadal mętna i cuchnąca. Poza czynnikami biotycznymi, czyli organizmami żywymi, wpływ na samo­oczyszczanie wody mają również czynniki abiotyczne, takie jak: zawartość tlenu, temperatura wody, odczyn środowiska, obecność substancji toksycznych i radio­aktywnych. Zawartość tlenu związana jest z oddychaniem drobnoustrojów. Przy dużym zanieczyszczeniu może dojść do całkowitego wyczerpania tlenu. Ilość tlenu (wyra­żona w miligramach na litr wody), która zostaje zużyta przez heterotrofy na mine­ralizację zanieczyszczeń nosi nazwę biochemicznego zapotrzebowania tlenu (BZT). W praktyce oznacza się zwykle BZT₅, czyli biochemiczne zapotrzebowa­nie tlenu po 5 dniach.

c. Metody mikrobiologicznej analizy wody

• Pobieranie próbek wody. Miejsce poboru wody zależy od rodzaju zbiornika. W jeziorach próby powierzchniowe pobiera się zwykle na głębokości 10-15 cm od lustra wody, a próby przydenne w odległości 20-30 cm od dna. W stawach próby pobiera się w pobliżu miejsca wpływu wody, na środku i przy ujściu. W celu pobrania prób z kranu wodociągowego lub rury wylotowej należy końcówkę zmyć tamponem umoczonym w 70-procentowym spirytusie lub denatu­racie, opalić palnikiem i przez 10 minut zostawić kran otwarty, aby spłynęły pierw­sze partie wody, a następnie pobrać próby, podstawiając pod kran przeznaczone do tego naczynie.

Do pobierania prób przypowierzchniowych używa się jałowych butelek z ciemnego szkła z doszlifowanym korkiem lub kolbek z korkami z waty. Naczynia napełnia się wodą do połowy. Na naczyniu należy podać miejsce i czas pobrania oby, nazwę zbiornika lub urządzenia, z którego pobrano próbę oraz nazwisko pobierającego. Do pobierania prób z głębszych warstw wody lub z dna służą specjalne urządzenia, tzw. czerpaki, jak np. przyrząd Klut-Olszewskiego lub Ruttera. Analizę mikrobiologiczną należy wykonać jak najszybciej po pobraniu próby (do 2 godzin). Jeśli nie jest to możliwe, to próbki wód czystych przechowuje się w temperaturze 1-10°C do 12 godzin, a próbki wód zanieczyszczonych - do 6 godzin. Przechowywanie próbek nawet w chłodni powoduje zmiany w składzie ilościowym i jakościowym mikroflory m.in. ze względu na różne tempo rozmnażania drobnoustrojów w warunkach chłodni oraz ze względu na działalność bakte­riofagów.

Wykonanie ćwiczenia

• Oznaczanie pośrednie ogólnej liczby drobnoustrojów w wodzie.

Ogólną liczbę drobnoustrojów w wodzie oznacza się na agarze odżywczym i na żelatynie odżywczej. Próbki wody przed posianiem na płytki należy odpowiednio rozcieńczyć, zależnie od spodziewanego zakażenia. Najbardziej czytelne są płytki, na których liczba kolonii mieści się w granicach 30-300. Płytki do posiewu należy opisać, podając imię i nazwisko wykonującego oznaczenie, rodzaj wody, Rozcieńczenie, rodzaj podłoża i datę posiewu.

Wodę wodociągową powiewa się bezpośrednio i po rozcieńczeniu w stosunku 1:10 (10^-1). Wodę silnie zakażoną trzeba rozcieńczyć bardziej, np. w stosunku 1:1000 (10^-3) i więcej. Posiewy wykonuje się z trzech kolejnych rozcieńczeń, tzn. właściwego, założonego jako optymalne, oraz mniejszego i większego. Wszystkie próby posiewa się przynajmniej na dwie rów­noległe płytki. Połowę posiadanych płytek zalewa się upłynnionym i zestudzonym do 45-50°C agarem odżywczym, a połowę żelatyną odżywczą. Po zalaniu płytki płynne podłoże należy dokładnie wymieszać z posianą próbką wody, poruszając płytkę kolistym ruchem po powierzchni stołu, uważając, by nie zamoczyć podło­żem brzegów i wieczka płytki, po czym odstawić płytkę do zakrzepnięcia. Zestalone płytki z agarem odżywczym inkubuje się odwrócone do góry dnem przez 24 godziny w temperaturze 37°C i przez 72 godziny w temperaturze 20°C. Po inkubacji oblicza się kolonie wyrosłe na płytkach i ocenia jakość wody. Mikroskopowy sposób liczenia kolonii można stosować tylko przy równo­miernym rozmieszczeniu kolonii na płytce.

• Oznaczanie bezpośrednie ogólnej liczby drobnoustrojów w wodzie. W rozcieńczonych zawiesinach wodnych drobnoustrojów można liczyć w sposób bezpośredni przy użyciu filtrów membranowych. Określoną objętość wody sączy się przez filtr, a następnie po zabarwieniu liczy pod mikroskopem. Można również filtr umieścić na podłożu hodowlanym i po inkubacji liczyć kolonie.

Z pobranej próbki wody wykonać odpowiednie rozcieńczenia, posiać na płytki i po inkubacji obliczyć zawartość mikroflory w wodzie. Ocenić stan sanitarny wo­dy i wynik wpisać do zestawienia:

wyniki mikrobiologicznego badania wody
rodzaj wody	ogólna liczba drobnoustrojów w 1 cm^3 wody		miano coli	indol	ocena wody
		na agarze odżywczym				na żelatynie odżywczej

• Oznaczanie miana coli wody. Oznaczanie ilościowe bakterii z grupy coli (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter) prowadzi się metodą wskaźnikową, oznaczając miano coli. W oznaczeniu wykorzystuje się cechy fizjo­logiczne tych bakterii. Bakterie z grupy coli są nie przetrwalnikującymi, względnymi beztlenowcami o optymalnej temperaturze wzrostu 37°C. Fermentują cukry, w tym laktozę, z wy­tworzeniem kwasów i gazów. Tryptofan redukują do indolu. Do wykrywania bakterii z grupy coli wykorzystuje się podłoża wybiórcze, tj. takie, które hamują wzrost innych drobnoustrojów mogących zniekształcić wy­nik. Dodaje się w tym celu do podłoża barwniki, takie jak zieleń brylantowa, fiolet goryczkowy i tryptoflawina, hamujące wzrost bakterii gramdodatnich. Stosowany bywa również dodatek żółci wołowej jako składnika selektywnego. Składnikiem różnicującym jest laktoza, fermentowana tylko przez nieliczne drobnoustroje. Do oznaczania miana coli w wodzie używa się podłoża Eijkmana. Zawie­ra ono, oprócz laktozy, wskaźnik (czerwień obojętną lub purpurę bromokrezolową). Podłoże przygotowuje się w probówkach zawierających wewnątrz małe, od­wrócone do góry dnem probóweczki, tzw. rurki Durhama . Podczas wyjaławiania rurki Durhama napełniają się podłożem. Wodę wodociągową, której miano powinno być większe niż 50, posiewa się systemem 50 cm³ i 5 x 10 cm³ lub 5 x 10 cm³ i l cm³. Wykonuje się to w ten sposób, że do 5 probówek lub buteleczek za­wierających po 10 cm³ podwójnie stężonego podłoża Eijkmana wprowadza się po 10cm³ wody wodocią­gowej z kolejnych rozcieńczeń. Wodę powierzchniową posiewa się bezpośrednio i z kolejnych rozcieńczeń od dziesięciu do minus pierwszej do dziesięciu do minus szóstej itd., zależnie od spodziewanego zakażenia. Za­szczepione próby umieszcza się w termostacie o tem­peraturze 37°C i inkubuje przez 48 godzin. Obecność gazu w rurce Durhama w ilości nie mniejszej niż 1/10 objętości oraz jednoczesna zmiana barwy podło­ża pod wpływem wytworzonych kwasów (obniżenie pH) z czerwonej (czerwień obojętna) na żółtą lub z fioletowej (purpura bromokrezolowa) na żółtą wska­zują na obecność bakterii z grupy coli. W przypadku wątpliwości co do obecności E. coli wykonuje się posiewy na podłoże Endo oraz próby bioche­miczne, m.in. na wytwarzanie indolu. Z otrzymanej próbki wody wykonać rozcieńczenia. Posiać na podłoże Eijkma­na. Zrobić preparat mikroskopowy badanej wody. Po inkubacji określić miano coli. Wyniki podać w formie zestawienia. Ocenić badaną wodę.

Oznaczanie paciorkowców kałowych metodą probówkową i metodą filtrów membranowych

1. WSTĘP

1.1. Przedmiot normy. Przedmiotem normy są następujące metody oznaczania paciorkowców kałowych w wodzie i ściekach:

a) metoda filtrów membranowych (FM),

b) metoda probówkowa.

1.2. Zakres stosowania metod. Metodę filtrów mem­branowych oznaczania paciorkowców kałowych stosuje się do wszystkich wód, z wyjątkiem wód o dużej zawar­tości zawiesiny. Metoda FM może być również stoso­wana do oznaczania paciorkowców kałowych w ście­kach, ponieważ znaczne ich rozcieńczenie potrzebne do uzyskania optymalnej liczby kolonii na filtrze membra­nowym prowadzi do znacznego rozcieńczenia zawartej w ściekach zawiesiny, która zwykle ogranicza stoso­wanie metody FM. Metoda ta nie nadaje się do ścieków chlorowanych. Metodę probówkową oznaczania paciorkowców ka­łowych stosuje się do wszystkich wód i ścieków, a szcze­gólnie do badania wód mętnych o małej liczbie ozna­czanych bakterii oraz ścieków chlorowanych.

1.3. Określenia. Paciorkowce kałowe jest to grupa bakterii kulistych lub owalnych występujących w posta­ci komórek pojedynczych, dwoinek lub krótkich łań­cuszków, obejmująca następujące gatunki:

Streptococcus faecalis,

Streptococcus faecalis subsp. liguefaciens

Streptococcus faecalis subsp. zymogenes

Streptococcus faecium,

Streptococcus bovis.

Streptococcus equinus.

Paciorkowce te i ewentualnie Streptococcus avium powszechnie występują w kale ludzi i zwierząt ciepło-krwistych. Stwierdzenie więc obecności paciorkowców kałowych w badanej próbce świadczy o jej kontakcie z zanieczyszczeniami typu kałowego. Oznaczanie tych bakterii pozwala określić stopień skażenia kałowego próbki podobnie jak oznaczanie bakterii grupy coli. Bakterie te na ogól charakteryzują się dłuższą przeżywalnością w wodzie oraz większą opornością na dzia­łanie chloru niż bakterie grupy coli. Do najważniejszych cech paciorkowców kałowych należą: zdolność wzrostu w temperaturze 45 °C, w obecności 40 % żółci oraz w obecności azydku sodo­wego, jak również w temperaturze 10 °C (z wyjątkiem S. bovis i S. eąuinus) przy pH 9,6, w obecności 6,5 % chlorku sodowego. Paciorkowce są Gram-dodatnie i wykazują ujemny test na katalazę.

2. METODY BADAŃ

2.1. Oznaczanie bakterii metodą filtrów membranowych.

2.1.1. Zasada metody. Oznaczanie paciorkowców ka­łowych tą metodą polega na przesączeniu określonej objętości próbki przez filtr membranowy. Zatrzymane na filtrze membranowym bakterie rozwijają się po umieszczeniu filtru na specjalnej pożywce, tworząc cha­rakterystyczne kolonie zabarwione na kolor czerwony i różowy. W zasadzie wszystkie czerwone i różowo zabarwione kolonie, które wyrosną na zastosowanej pożywce należą do paciorkowców kałowych.

2.1.2. Aparatura i przyrządy

a) Aparat filtracyjny firmy Sartorius, z lejkiem po­jemności 500 cm³ typu SM 16201 oraz z lejkiem po­jemności 25 cm³ lub odpowiedni produkcji krajowej

b) Butelki pojemności 250 cm³.

c) Cieplarka umożliwiająca utrzymanie temperatu­ry 37 °C.

d) Filtry membranowe o średnicy około 50 mm i średnicy porów 0,45 μm, najbardziej z kratkowanym nadrukiem.

e) Lupa powiększająca pięciokrotnie lub lupa binokularowa.

f) Pinceta o spłaszczonych końcach.

g) Pipety wielomiarowe, pojemności l, 10, 50 cm³,

h) Płytki Petriego o średnicy 60 mm i o średnicy 90-100 mm.

2.1.3. Odczynniki i roztwory

a) Agar do celów bakteriologicznych.

b) Azydek. sodowy (NaN₃) cz.d.a. (silna trucizna).

c) Chlorek trójfenylotetrazoliowy (TTC) cz.d.a., roz­twór 1-procentowy przygotowany w sposób jałowy na jałowej wodzie destylowanej. Roztwór należy przygoto­wywać bezpośrednio przed użyciem.

d) Fosforan potasowy -dwuzasadowy (K₂HPO₄) cz.d.a.

e) Glukoza cz.d.a.

f) Pepton trypton firmy Difco, lub inny, równoważny

g) Woda destylowana — wg BN-71/6191-95.

h) Wyciąg drożdżowy firmy Difco lub inny, równo­ważny.

2.1.4. Pożywka Slanetsa i Bartleya (S8) i jej przygotowanie

Skład:

Pepton 20 g.

Wyciąg drożdżowy 5 g.

Fosforan potasowy dwuzasadowy- źródło fosforu 4 g.

Glukoza - substrat oddechowy 2 g.

Azydek sodowy 0,4 g.

Agar 10 g

Woda destylowana do 1 dm³.

Przygotowanie. Składniki roz­puścić przez gotowanie w wodzie destylowanej w poda­nej kolejności i roztwór dopełnić do 1 cm³ wodą desty­lowana. pH roztworu nastawić tak, aby po sterylizacji wynosiło 7.1±0,1 w temperaturze pokojowej. Wlać pożywkę do kolb stożkowych lub butelek pojemności 250 cm³ po 10 cm³, a następnie jałowić w autoklawie przez 20 min w temperaturze 117 °C. Przed wykonaniem posiewów po rozpuszczeniu pożywki i ochłodzeniu do temperatury 50 - 60 °C, na każde 100 cm³ pożywki dodać l cm³ poprzednio przygotowa­nego roztworu TTC wg 2.1.3c) i rozlać na płytki Petrie­go o średnicy 60 mm warstwą grubości 3-4 mm.

2.1.5. Przygotowanie próbki do badań — wg ark. 06 p. 7 niniejszej normy.

2.1.6. Wykonanie oznaczania. Dolna część aparatu filtracyjnego osadzoną w korku gumowym umieścić w szyjce kolby próżniowej połączonej wężem z pompą próżniową. Przy zamkniętym kurku aparatu nałożyć za pomocą opalonej pincety jałowy filtr mambranowy (błyszczącą lub kratkowaną stroną do góry) na poro-watą wkładkę aparatu, umocować górną część aparatu, zwracając uwagę na to, aby filtr w tym czasie nie uległ pofałdowaniu, ponieważ jest to zwykle przyczyną prze­ciekania próbki. Zależnie od objętości sączonej próbki stosować mniejszy lub większy lejek. Badaną objętość próbki wlać do lejka i otworzyć kurek aparatu. Po przefiltrowaniu zamknąć kurek aparatu, spłukać lejek około 20 cm³ płynu do rozcieńczeń, przefiltrować i zamknąć kurek. Zdjąć lejek, uchwycić go szczypcami do tygli, opalić w płomieniu w ciągu około 20 s i duży lejek umieścić w pierścieniu statywu, metalowego, a ma­ły lejek na dnie jałowej płytki Petriego o średnicy 90-100 mm. Następnie jałową pincetą przenieść filtr membranowy z porowatej wkładki aparatu filtracyjne­go na pożywkę SB i wstawić go do cieplarki o temperaturze 37 °C na 48 h. W tym czasie na pożywce wyrastają charakterystycz­nie zabarwione kolonie bakterii koloru czerwonego, czerwonego z ciemniejszym środkiem lub różowego. Ze względu na niewielkie rozmiary kolonii, średnicy 0,2 do 1 mm, zaleca się liczyć je pod lupą wg 2.1.2e). Liczba wyrosłych kolonii paciorkowców kałowych na filtrze membranowym w zasadzie nie powinna być większa niż 100 i nie mniejsza niż 20, dlatego zaleca się wykonać dwa lub więcej różnych rozcieńczeń prób­ki, aby spełnić ten warunek. Praktycznie wszystkie kolonie rosnące na podłożu SB można zaliczyć do paciorkowców kałowych. Z tego względu badanie można zakończyć na tym etapie.

2.1.7. Obliczanie wyniku oznaczania. Liczbę pacior­kowców kałowych (X) obliczyć wg wzoru

x= (a · 100)/V

w którym:

a — liczba obliczonych kolonii na pożywce SB

V — objętość przesączonej próbki, cm³. Wynik należy podawać w następujący sposób: Liczba paciorkowców kałowych ... w 100 cm³ próbki.

2.2. Oznaczanie bakterii metodą probówkową

2.2.1. Zasada metody.

Oznaczanie paciorkowców ka­łowych tą metodą polega na posianiu kilku wybranych odpowiednio objętości próbki na pożywce płynnej, w zależności od stopnia zanieczyszczenia próbki. Metoda obejmuje badanie wstępne, w którym na podstawie zmętnienia pożywki i zmiany barwy określa się obecność bakterii w badanej próbce, oraz badanie potwierdzające określające przynależność tych bakterii do paciorkowców kałowych, po których wynik badania odczytuje się z tablic.

2.2.2. Aparatura i przyrządy

a) Butelki pojemności 100 cm³.

b) Cieplarka umożliwiająca utrzymanie temperatu­ry 37 °C.

c) Ezy bakteriologiczne o średnicy uszka 3 mm.

d) Pipety bakteriologiczne wg Pasteura.

e) Pipety wielomiarowe, pojemności l, 10 i 50 cm'.

f) Probówki bakteriologiczne o wymiarach: 18X180 mm — do rozcieńczeń i stężonej pożywki, 16X160 mm — do pożywek płynnych. 10x100 mm — do pożywek potwierdzających.

2.2.3. Odczynniki i roztwory

a) Azydek sodowy (NaN₃) cz.d.a. (silna trucizna).

b) Chlorek sodowy cz.d.a.

ć) Fosforan potasowy jednozasadowy (KH₂PO₄) cz.d.a.

d) Fosforan potasowy dwuzasadowy (K₂HPO4) cz.d.a.

e) Fiolet etylowy, roztwór wodny 0,083-procentowy; w kolbie pomiarowej pojemności 100 cm³ rozpuścić w wodzie destylowanej 0,083 g fioletu etylowego, dopeł­nić do kreski wodą destylowaną i wymieszać.

f) Glukoza cz.d.a.

g) Pepton trypton firmy Difco lub inny, równo­ważny.

h) Purpura bromokrezolowa — wskaźnik, roztwór 1-procentowy w 50-procentowym roztworze alkoholu
etylowego cz.d.a.
i) Woda destylowana wg BN-7l/6lbt-95.

2.2.4. Pożywki i ich przygotowanie

2.2.4.1. Pożywka z azydkiem sodowym i purpurą bro­mokrezolową (APB):

a) Skład

Pepton 20 g,

Glukoza 5 g,

Chlorek sodowy 5 g.

Fosforan potasowy dwuzasadowy 2,7 g.

Fosforan potasowy jednozasadowy 2,7 g.

Azydek sodowy 0,25 g.

Purpura bromokrezolowa wg 2.2.3h) 2 cm³,

Woda destylowana do 1 dm³.

b) Przygotowanie. Składniki podane w poz. a) roz­puścić przez gotowanie w wodzie destylowanej w po­danej kolejności i roztwór dopełnić do 1 dm³ wodą destylowaną.

pH roztworu nastawić tak. aby po sterylizacji wynosiło 7,1 ±0,1 w temperaturze pokojowej. Pożywkę rozlać do probówek po 10 cm³, a następnie jałowic w autoklawie przez 20 min w temperaturze 117^oC.

2.2.4.2.Pożywka z azydkiem sodowym i purpurą bromokrezolową (APB), podwójnie stężona:

a) Skład. Podwójne ilości składników wg 2.2.4.la), 7. tym że woda destylowana do 1 dm³.

b) Przygotowanie. Składniki podane w poz. a) roz­puścić przez gotowanie w wodzie destylowanej w poda­nej kolejności i roztwór dopełnić do 1 dm³ wodą desty­lowaną. pH roztworu nastawić tak, aby po sterylizacji wynosiło 7,1 ±0,1 w temperaturze pokojowej. Rozlać do probówek o wymiarach 18X180 mm po 10 cm³ i do butelek po 50 cm³. Jałowic w autoklawie w tempera­turze 117 °C przez 20 min.

2.2.4.3. Pożywka z azydkiem sodowym i fioletem ety­lowym (AFE):

a)

Skład

Pepton 20 g

Glukoza 5 g

Chlorek sodowy 5 g

Fosforan potasowy dwuzasadowy 2.7 g

Fosforan potasowy jednozasadowy 2.7 g

Azydek sodowy 0.4 g.

Fiolet etylowy wg 2.2.3e) 1 cm³

Woda destylowana do 1 dm³.

b) Przygotowanie. Składniki podane w poz. a) roz­puścić przez gotowanie w wodzie destylowanej w poda­nej kolejności i roztwór dopełnić do 1 dm³ wodą desty­lowaną. pH roztworu nastawić tak, aby po sterylizacji wynosiło 7,1 ±0,1 w temperaturze pokojowej. Rozlać do probówek o wymiarach 10X100 mm po 2 cm³. Jałowić w autoklawie w temperaturze 117 °C przez 20 min.

2.2.5. Przygotowanie próbki do badań. Próbkę bada­nej wody lub ścieków należy pobierać wg odpowied­niego arkusza wymienionego w PN-74/C-04620.00. W zależności od rodzaju próbki i stopnia jej zanieczyszcze­nia badanymi bakteriami posiewa się. różne objętości próbki. W przypadku wody do picia oraz wody z pły­walni o obiegu zamkniętym, należy posiewać wodą nie rozcieńczoną.

Przy posiewie ścieków i wód powierzchniowych sto­suje się dziesięciokrotne rozcieńczenie. Zaleca się posiewanie następujących objętości próbki:

— uzdatniona woda do picia oraz woda z pływalni o obiegu zamkniętym:

5 x 50 cm³; 5 x 10 cm³; 5 x 1 cm³ lub 1 x 50 cm³; 5 x 10 cm³;.5x1cm³

— wody powierzchniowe oraz ścieki:

3 x 10 cm³; 3 x 1 cm³; 3 x 0,1 cm³ lub ich dalsze dziesięciokrotne rozcieńczenia.

Rozcieńczenia do posiewów przygotowywać v spo­sób podany w ark. 00 p. 3 niniejszej normy.

2.2.6. Wykonanie oznaczania

2.2.6.1. Badanie wstępne. Wybrane objętości próbki posiać za pomocą jałowej pipety odpowiedniej po­jemności na pożywkę z azydkiem sodowym i purpurą bromokrezolową wg 2.2.4.1 i 2.2.4.2. Posiewy inkubować w cieplarce w temperaturze 37 °C przez 24 - 48 h. Za wynik dodatni badania wstępnego przyjmuje się zmętnienie pożywki i zmianę barwy z czerwonej na żółtą (o różnej intensywności).

2.2.6.2. Badania potwierdzające. Ze wszystkich do­datnich hodowli w probówkach z pożywką APB z ba­dania wstępnego wykonać przesiew na pożywkę AFE w następujący sposób: zawiesinę bakterii pobraną trzy­krotnie za pomocą ezy lub pipety wg 2.2.2d) z dna probówki przenieść w sposób jałowy do pożywki AFE, a następnie prowadzić hodowlę w temperaturze 37 °C przez 48 h, odczytując po raz pierwszy wynik po 24 h. Paciorkowce kałowe rozwijając się tworzą na dnie pro­bówki niebieski osad bakterii.

2.2.7. Obliczanie wyniku oznaczania. W zależności od zastosowanego systemu posiewu odczytać z odpowied­niej tablicy najbardziej prawdopodobną liczbę pacior­kowców kałowych (NPL) w 100 crn³ próbki, na podsta­wie dodatnich wyników badania wstępnego badania potwierdzającego.

Metody oznaczania czystości powietrza:

Oznaczanie liczby bakterii w powietrzu metodą sedymentacyjną i filtracyjną

3. Mikroflora powietrza

a. Wprowadzenie

Powietrze nie jest środowiskiem sprzyjającym rozwojowi drobnoustrojów, jakkolwiek mikroflora stale jest w nim obecna, przedostając się do powietrza z gle­by, powierzchni roślin i od zwierząt. Na ogół przyjmuje się, że drobnoustroje nie rozmnażają się w powietrzu, lecz są tylko przenoszone prądami powietrznymi z miejsca na miejsce. Jednak według niektórych autorów drobnoustroje mogą od­żywiać się substancjami organicznymi rozpuszczonymi w kropelkach mgły wodnej zawieszonej w powietrzu i rozmnażać się. Skład ilościowy i jakościowy mikroflory powietrza zależy od wielu czynni­ków. Nad miastami znajduje się więcej mikroflory niż nad lasami i polami. Nad glebami uprawnymi powietrze zawiera więcej drobnoustrojów niż nad pustyniami. Najmniej zakażone jest powietrze nad górami, morzami, oceanami i lasami. Powie­trze przed deszczem zawiera więcej komórek drobnoustrojów niż po deszczu. Zawartość drobnoustrojów w powietrzu zmienia się wraz z wysokością. Na ulicach miasta znajduje się kilka do kilkuset tysięcy komórek drobnoustrojów w l litrze powietrza. Na wysokości 500 m nad miastem stwierdzono już tylko 2-3 komórki w litrze, a na wysokości 2000 m powietrze zawierało średnio 0,5 komórki w litrze. Duży wpływ na stopień zakażenia powietrza drobnoustrojami ma pora roku. Najwięcej drobnoustrojów stwierdza się w miesiącach: czerwiec-sierpień, najmniej w miesiącach grudzień-styczeń. W miesiącach zimowych mikroflora jest uwięzio­na w lodzie, zamarzniętej glebie i przykryta jest śniegiem, w związku z czym mniej przedostaje się jej do powietrza. Liczba drobnoustrojów w pomieszczeniach, szczególnie o dużym zagęszczeniu ludzi i sprzętów, jest wielokrotnie większa niż w powietrzu w miejscach odkry­tych. W pomieszczeniach znajduje się szczególnie dużo drobnoustrojów chorobo­twórczych wydzielanych przez ludzi ze śliną, przy kichaniu i kaszlu. W zakładach przemysłowych stopień zakażenia powietrza zależy od stanu sanitarnego pomiesz­czeń produkcyjnych, sprzętów, kanałów, higieny osobistej personelu oraz od stanu mikrobiologicznego surowców, półproduktów i produktów.

Wielu badaczy stwierdzało w powietrzu do 100 różnych gatunków drobno­ustrojów, w przeważającej większości saprofitycznych. Drobnoustroje chorobo­twórcze spotyka się głównie tylko w otoczeniu człowieka. Z bakterii najczęściej spotyka się Micrococcus i Sarcina, które na podłożach hodowlanych rosną w po­staci barwnych (żółtych, białych, pomarańczowych) kolonii, pałeczki z rodzaju Achromobacter oraz tlenowce przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus. Zwykle w po­wietrzu spotyka się zarodniki grzybów i drożdże. Z drożdży najczęściej występują rodzaje Rhodotorula i Torulopsis, a z pleśni rodzaje: Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Cladosporium. Zdolność do przetrwania mikroorganizmów w powietrzu zależy od ich wrażli­wości na wysuszenie. Mycobacterium tuberculosis (prątek gruźlicy), Bacillus anthracis (laseczka wąglika), Pseudomonas aeruginosa - syn. Pseudomonas pyocyanea (pałeczka ropy błękitnej), a także liczne gronkowce są odporne na wysuszenie i giną w powietrzu powoli. Odwrotnie natomiast Neisseria meningitidis (dwoinka zapalenia opon mózgowych), Vibrio cholerae (przecinkowiec cholery) czy Yersinia pestis (pałeczka dżumy) - giną w podobnych warunkach stosunkowo szybko. Powietrze ma zdolność samooczyszczania. Podstawowym mechanizmem samo­oczyszczania powietrza jest osiadanie zawiesiny bakteryjnej pod wpływem sił gra­witacyjnych. Szybkość osiadania zawiesiny zależy od wielkości komórek drobno­ustrojów lub ich aglomeratów. Dlatego mieszanie i zawartość wilgoci w powietrzu jest ważnym czynnikiem w samooczyszczaniu. W powietrzu będącym w ruchu ist­nieje większe prawdopodobieństwo zderzenia się komórek bakteryjnych, łączenia z kropelkami pary wodnej i tworzenia dużych aglomeratów, co ułatwia ich osiadanie. Wpływ wielkości kropli na szybkość osiadania ilustruje poniższe zestawienie:

średnica kropli w μm	szybkość osiadania w cm
1	0,003
5	0,076
10	0,305
' 50	7,6
100	30,5
500	760,0

Jak łatwo obliczyć, komórka o średnicy 5 mikrometrów opada w spokojnym powietrzu w czasie 1 minuty o prawie 5 cm.

Innym czynnikiem wpływającym na naturalne oczyszczanie powietrza jest promieniowanie ultrafioletowe. Skuteczność działania promieniowania ultrafioleto­wego na drobnoustroje jest odwrotnie proporcjonalna do zapylenia powietrza, dla­tego m.in. powietrze nad lasami czy na dużych wysokościach zawiera mniej drob­noustrojów niż w zapylonych ośrodkach miejskich. Powietrze w przemyśle fermentacyjnym i spożywczym jest z jednej strony na­turalnym środowiskiem niezbędnym do życia, a z drugiej strony jest czynnikiem zakażającym przez bezpośrednie stykanie się z surowcem, półproduktem czy pro­duktem, jak np. w czasie studzenia brzeczki na aparatach ociekowych. W tych przypadkach czystość mikrobiologiczna powietrza ma szczególne znaczenie. Po­wietrze w pewnych procesach, takich jak np. produkcja drożdży lub produkcja antybiotyków w warunkach tlenowych jest w pewnym sensie surowcem, który, po­dobnie jak inne surowce, musi podlegać wyjałowieniu przed wprowadzeniem do fermentora. Jałowe powietrze potrzebne w procesach fermentacyjnych otrzymuje się, sto­sując specjalne metody wyjaławiania. Omówione zostaną najważniejsze z nich.

1. Ogrzewanie powietrza przez sprężanie go do wysokich ciśnień.

2. Działanie promieniami ultrafioletowymi, ultradźwiękami, wysokoenerge­tycznym promieniowaniem katodowym i promieniowaniem gamma. Promienie ultrafioletowe mają zastosowanie przy wyjaławianiu powietrza w salach operacyj­nych, w pomieszczeniach, gdzie produkuje się szczepionki i w komorach jałowych, tzw. boksach lub szafkach Hansena.

3. Odpylanie elektrostatyczne.

4. Rozpylanie substancji bakteriobójczych (fenol, tlenek etylenu, sole metali ciężkich). Ten sposób może okazać się nieprzydatny, gdy rozpylone substancje bę­dą działały szkodliwie w procesie, w którym wyjałowione powietrze ma być wyko­rzystane.

5. Filtracja mechaniczna, czyli zastosowanie filtrów włóknistych. Jest to spo­sób stosowany najczęściej. Dawniej używano tylko włókien bawełnianych. Obec­nie częściej stosuje się włókna szklane jako powodujące mniejszy spadek ciśnienia powietrza oraz odporniejsze na zawilgocenie lub spalanie. W Japonii stosuje się fil­try wypełnione włóknami szklanymi o średnicy 19 μm, a w USA używane są włókna o średnicy około 5 μm. Ponieważ powietrze tłoczone przez filtry jest uprzednio sprężane, ten system wyjaławiania jest połączeniem wyjaławiania ciepl­nego i filtracji mechanicznej. Poza filtracją przez włókna szklane lub łącznie z nią stosuje się filtrację powietrza przez roztwory kwasów i ługów.

6. Rozpylanie wody lub użycie pary po zakończeniu pracy w pomieszczeniach fabrycznych.

b. Oznaczanie stopnia skażenia powietrza

Najważniejszym i najtrudniejszym momentem przy oznaczaniu mikroflory po­wietrza jest pobieranie próbek. W tym zakresie wykonano najwięcej prac. Głównie wyróżnia się dwie grupy metod pobierania prób:

1) osiadanie zawiesin drobnoustrojów,

2) filtracja powietrza przez filtry.

• Osiadanie zawiesin drobnoustrojów. W tej grupie metod wyróżnia się:
a) osiadanie drobnoustrojów pod wpływem naturalnych sił grawitacji (metoda
sedymentacyjna Kocha-1881 rok i jej modyfikacje),

b) wymuszone osiadanie drobnoustrojów na powierzchni podłoża hodowlane­go przez nadanie powietrzu energii kinetycznej (np. aparat Korotowa),

c) osadzanie zawiesin drobnoustrojów siłami elektrostatycznymi,

d) osadzanie zawiesin drobnoustrojów parą lub rozpyloną cieczą (np. przy­rząd Reczmienskiego).

• Filtracja powietrza przez filtry. W tej grupie metod wyróżnia się sposo­by zależnie od rodzaju użytego filtru:

a) filtracja powietrza przez filtry stałe nierozpuszczalne,

b) filtracja powietrza przez filtry stałe rozpuszczalne,

c) filtracja powietrza przez ciecze w odpowiednich przyrządach.

Jak łatwo zauważyć, metody wyjaławiania powietrza i metody oznaczania mi­kroflory powietrza mają wiele wspólnych cech.

Najstarszą i jednocześnie najprostszą metodą badania stopnia zakażenia po­wietrza jest metoda sedymentacyjna Kocha, oparta na spontanicznym osiadaniu pyłków i kropelek niosących mikroorganizmy pod wpływem sił grawitacji. Omeliański stwierdził, że w czasie 5 minut na płytce o powierzchni 100 cm² osiada tyle drobnoustrojów, ile znajduje się w 10 dm³ powietrza. Ta zależność jest wykorzy­stywana do ilościowych oznaczeń mikroflory w powietrzu.

Metoda Kocha ma kilka wad, m.in. to, że na płytce osiadają nie tylko drobno­ustroje znajdujące się w powietrzu nad płytką, ale również drobnoustroje z warstw sąsiednich naniesione prądami powietrznymi. Na płytkach osiadają przede wszy­stkim drobnoustroje skupione w większych aglomeratach, a tylko niewielki procent komórek bardzo rozproszonych. Przy użyciu metody filtracji aparatem Korotowa stwierdzono, że wyniki uzyskane metodą Kocha są trzykrotnie zaniżone. Pomimo tych niedokładności przy zapewnieniu stałych parametrów pomiaru, takich jak wielkość płytek, czas pomiaru, metoda Kocha pozwala uzyskać w prosty sposób w miarę dokładne i porównywalne wyniki.

c. Wykonanie ćwiczenia

• Technika wykonania oznaczenia metodą sedymentacyjną Kocha.

W celu pobrania prób powietrza z danego miejsca należy przygotować dwie płytki z agarem odżywczym i dwie płytki z agarem brzeczkowym. Na wieczku płytek napisać imię i nazwisko wykonującego oznaczenie, datę, rodzaj podłoża i miejsce pobrania próby. Po wylaniu i zastygnięciu płytek zawinąć je w papier jałowy i przenieść na miejsce pobrania próby. W czasie pobierania próby powietrze po­winno być spokojne, dlatego należy unikać przeciągów, a po przyjściu na miejsce należy powoli wyjąć płytki z papieru i odczekać aż uspokoi się ruch powietrza spowodowany przejściem badającego. Położyć płytki na jałowym papierze w pozy­cji poziomej, zdjąć wieczko płytki i położyć obok na jałowym papierze wierzchem do góry i zależnie od przewidywanego zakażenia powietrza eksponować płytki 5, 10 lub 15 minut. Płytki zamknąć wieczkami, zawinąć w papier i przenieść do ter­mostatu, ustawiając je dnem do góry. Płytki z agarem odżywczym inkubuje się 48 godzin w temperaturze 37°C, a płytki z agarem brzeczkowym 48 godzin w tem­peraturze 26°C. Po inkubacji liczy się kolonie wyrosłe na płytkach, zakładając, że z każdej komórki wyrosła jedna kolonia i oblicza się liczbę drobnoustrojów (x) w 10 dm³ powietrza według następującego wzoru:

x = a · 100 / b ·c

gdzie:

a - średnia arytmetyczna z liczby kolonii wyrosłych na dwóch płytkach z tym

samym podłożem,

b - powierzchnia płytki [cm² ],

c - współczynnik czasu ekspozycji płytki; dla 5 minut - c = l, dla 10 minut -

c = 2 i dla 15 minut - c = 3,
100 - przeliczenie powierzchni płytki na 100 cm².

Pobrać próby powietrza z pracowni, z różnych miejsc budynku i otoczenia. Wyniki podać w formie zestawienia:

metoda i miejsce wykonania oznaczenia	liczba kolonii wyrosłych na płytkach (średnia z dwóch płytek)
		agar odżywczy				agar brzeczkowy
		bakterie	drożdże	pleśnie	razem	bakterie	drożdże	pleśnie	razem

Powietrze uznaje się za bardzo czyste, jeśli liczba drobnoustrojów w 10 dm nie jest większa od 10, natomiast gdy przekracza 100 - powietrze jest za bardzo zanieczyszczone.

• Wykonanie oznaczenia mikroflory powietrza metodą filtracyjną (aspirometryczną). Zastosowanie filtrów płynnych do chwytania mikroflory powietrza zaproponował L. Pasteur. Metoda filtracyjna polega na przepuszczeniu określonej objętości powietrza przez znaną objętość jałowego roztworu znajdującego się w specjalnym aparacie, zwanym aspiratorem. W zakażonej w ten sposób cieczy wykonuje się posiewy i oblicza zawartość drobnoustrojów w powietrzu. Przykład prostego w użyciu aspiratora stanowi przyrząd Diakonowa-Szafira. Przyrząd ten składa się z cylindrycznego naczynia szkla­nego o pojemności około 120 cm³, na którego dnie umieszczone są perełki szklane. Do przyrządu nalewa się określoną objętość cieczy absorpcyjnej, np. 20 cm³ (bulion, woda peptonowa, płyn fizjologiczny lub woda), wystarczającą do zakrycia perełek. Wyloty rurek zamyka się korkami z waty i zakrywa kapturkami z pergaminu lub z folii aluminiowej i całość sterylizuje się w autoklawie. W celu wykonania oznaczenia do koń­cówki 2 podłącza się pompę zasysającą połączoną szeregowo z rotametrem i prze­pompowuje się przez przyrząd 100 dm³ powietrza z prędkością 8-12 dm³/min. Z zakażonego w ten sposób płynu wyko­nuje się posiewy po 0,1 lub 1,0 cm³ na 2 płytki z agarem odżywczym i na 2 płyt­ki z agarem brzeczkowym. Inkubację pro­wadzi się tak samo, jak w metodzie sedy­mentacyjnej.

Uwzględniając objętość powietrza przepompowanego, objętość płynu w aspiratorze, objętość płynu wysianego na płytki i liczbę kolonii wyrosłych na płyt­kach, oblicza się zawartość drobnoustro­jów w powietrzu.

Oznaczyć mikroflorę pracowni. Wyni­ki podać w formie zestawienia, tak jak dla metody Kocha.

- Badanie skuteczności działania filtrów. Podłączając do aspiratora filtry w miejscu wlotu powietrza, można ocenić ich skuteczność w zakresie zatrzymywa­nia mikroflory powietrza. Płytki po inkubacji należy zanalizować i wyniki wpisać do zestawienia, jak w poprzednich dwóch oznaczeniach.

Z uzyskanych danych wyciągnąć wnioski ze szczególnym uwzględnieniem:

- oceny stopnia zakażenia powietrza;

- porównania ilościowego wzrostu wymienionych w zestawieniu grup drob­noustrojów na dwóch różnych podłożach;

- porównania wyników dwóch metod oznaczania

Metody badania powietrza:

- metoda sedymentacyjna- przygotowujemy agar odżywczy na bakterie inkubujemy w 37^oC przez 48h, pożywkę saburo na grzyby 20^oC przez 48h. Eksponujemy na działanie powietrza, liczymy kolonie. Stosujemy wzór

x = a·100/ b·c

x- liczba drobnoustrojów w pożywce które wyrosłyby na 100 cm²

b- wielkość pożywki 63,5 cm³ (∏r²)

c- 5 min (1), 10 min (2), 15 min. (3)

x:

0-10 powietrze bardzo czyste

10-50 powietrze czyste

50-100 powietrze średnio zanieczyszczone

>100 powietrze bardzo zanieczyszczone

Metoda filtracji - filtrowanie przez zbuforowany jałowy roztwór, rozcieńczenie prób, posiać na agar po 100 μl i 100μl na pożywkę saburo. Inkubować przez 48h.

zastosować wzór:

x = a · r

1. liczba wyrosłych kolonii

r- rozcieńczenie próbki

Oznaczanie przetrwalnikujących bakterii beztlenowych redukujących siarczany metodą hodowli na pożywce płynnej

Siarkowe bakterie, grupa mikroorganizmów autotroficznych (samożywność), które czerpią energię potrzebną do syntezy związków organicznych (asymilacji dwutlenku węgla) z utleniania różnych związków siarki, np. siarkowodoru:

2H₂S + O₂ = 2H₂O + S₂ + energia.

Powstająca wolna siarka jest wydzielana na zewnątrz lub gromadzi się wewnątrz komórek.

Siarkowe bakterie występują pospolicie na całej kuli ziemskiej, ich działalność przyczyniła się do powstania złóż siarki. Bakterie redukujące siarczany (Clostridium) są wskaźnikami mikrobiologicznymi, oprócz bakterii Coli i paciorkowców kałowych. Są one wskaźnikiem sanitarnym (wody wodociągowej oraz np. wody z kąpielisk). Do ich badania używana jest metoda pożywki płynnej.

Praktyczne wykorzystanie drobnoustrojów w życiu człowieka: oczyszczanie ścieków, przemysł mleczarski (jogurty, mleko, sery), produkcja leków- antybiotyków, naturalna flora organizmu człowieka, produkcja kiszonek.

1

---