WYKŁAD 1, 16.02.2012

Wykład organizacyjny

Biotechnologia jest interdyscyplinarną dziedziną nauki, obejmującą różne kierunki technicznego wykorzystania materiałów i procesów biologicznych.

Zgodnie z definicją UE, biotechnologia jest dziedziną integrującą biochemię, mikrobiologię, biologię molekularną, genetykę i chemię w celu praktycznego, użytkowego wykorzystania kultur mikroorganizmów, tkanek lub elementów ich struktury.

IUPAC określa biotechnologię jako zastosowanie biochemii, biologii molekularnej, mikrobiologii i inżynierii chemicznej w procesach przemysłowych i ochronie środowiska.

Wspólną cechą tych definicji jest:

• interdyscyplinarny charakter biotechnologii

• przemysłowe zastosowanie mikroorganizmów, enzymów lub kultur tkankowych

Interdyscyplinarny charakter biotechnologii powoduje, że może ona być opisywana z różnych punktów widzenia - najczęściej z punktu widzenia biochemika lub mikrobiologa. W takich przypadkach główny nacisk położony jest na wyjaśnienie przemian biochemicznych zachodzących w komórkach i fizjologicznych uwarunkowań procesów technologicznych.

Termin „technologia” ma dwojakie znaczenie:

• oznacza metodę wytwarzania określonego produktu

• oznacza naukę o metodach wytwarzania określonego produktu

EKOLOGIA, BIOLOGIA KOMÓRKI, MIKROBIOLOGIA, GENETYKA, BIOCHEMIA, BIOLOGIA MOLEKULARNA, CHEMIA, INŻYNIERIA, MATEMATYKA, INFORMATYKA, FIZYKA, EKONOMIA

↓

BIOTECHNOLOGIA

↓

OCHRONA ZDROWIA, OCHRONA ŚRODOWISKA, ROLNICTWO, PRZEMYSŁ SPOŻYWCZY, PRZEMYSŁ CHEMICZNY, SUROWCE, NOŚNIKI ENERGII, ANALITYKA, INNE ZASTOSOWANA

Biotechnologia zielona → rolnictwo, produkcja żywności

Biotechnologia czerwona → medycyna, farmacja

Biotechnologia szara → ochrona środowiska, bioremediacja

Biotechnologia biała → zastosowania przemysłowe, wykorzystanie enzymów

Biotechnologia niebieska → technologie wodne, wykorzystanie organizmów wodnych

Biotechnologia fioletowa → ustawodawstwo związanie z biotechnologią

Główne zalety biotechnologii:

• przetwarzanie surowców odnawialnych - cukrowce (skrobia, sacharoza, celuloza) stanowią około 1% biomasy (10¹⁴-10¹⁵kg); obecnie cukrowce i ich pochodne (np. melasa) są głównymi surowcami w procesach biotechnologicznych; szacuje się, że w niedalekiej przyszłości można liczyć na przynajmniej 10-krotne zwiększenie biotechnologicznego wykorzystania surowców roślinnych, pod warunkiem opracowania efektywnej metody przetwarzania celulozy, lignin i hemiceluloz (biopolimery ulegają bardzo powolnej biodegradacji)

• duża różnorodność bioprocesów i otrzymywanych bioproduktów

• selektywne otrzymywanie enancjomerów biologicznie czynnych

• łagodne warunki przebiegu bioprocesów

• niska energochłonność bioprocesów

• duży stopień bezpieczeństwa

• mniejsze niż w przypadku procesów chemicznych zanieczyszczenia środowiska; łatwiejsze do neutralizacji ewentualne skażenia

Biotechnologia dzieli się na:

• biotechnologię tradycyjną - wykorzystuje do procesów chemicznych naturalne enzymy, szczepy drobnoustrojów i komórki organizmów wyższych nie zawierające obcego materiału genetycznego

• biotechnologię nowoczesną - stosowane są szczepy drobnoustrojów lub linie komórkowe skonstruowane metodami inżynierii genetycznej, względnie enzymy zmodyfikowane technikami inżynierii białka; nowoczesne metody i rozwiązania biotechnologiczne obejmują również:

• rekombinacje genetyczne in vitro i klonowanie genów

• fuzje komórek (protoplastów)

• inżynierię białka

• techniki hodowli in vitro komórek organizmów wyższych

• technologie immobilizacji enzymów

• biokatalizę w układach niewodnych

• komputerowe modelowanie i sterowanie bioprocesami

• technikę ciągłych procesów biotechnologicznych

• nowoczesne techniki izolacji i oczyszczania bioproduktów

Najważniejsze wydarzenia w historii biotechnologii:

1. Wyjaśnienie przez Ludwika Pasteura (1857) roli drożdży w fermentacji alkoholowej.

2. Wprowadzenie do praktyk przemysłowych i medycznych czystych kultur bakteryjnych, grzybów mikroskopijnych (pleśni) i drożdży.

3. Uruchomienie produkcji drożdży piekarniczych w warunkach napowietrzonych hodowli wgłębnych (1880), wprowadzenie czystych kultur drożdży do piwowarstwa (1883).

4. Wykorzystanie wyciągu z pleśni Aspergillu oryzae do scukrzania zacierów skrobiowych.

5. Uruchomienie przemysłowej produkcji amylazy pleśniowej TAKA-DIASTAZA w USA (1894).

6. Opracowanie techniki złoża zraszanego z mikroflorą degradującą składniki wód ściekowych.

7. Wykorzystanie bakterii do oczyszczania ścieków w Manchesterze (1914).

8. Opracowanie mikrobiologicznych metod syntezy butanolu i acetonu na drodze fermentacji acetonowo-butanolowej przez Clostridium (1918).

9. Opracowanie metod beztlenowej degradacji zanieczyszczeń ściekowych.

10. Uruchomienie przemysłowej produkcji etanolu z hydrolizatów drewna.

11. Uruchomienie wielkoprzemysłowej produkcji penicyliny pod koniec II Wojny Światowej, co przyczyniło się do opracowania w następnych latach wielu procesów produkcji innych antybiotyków.

12. Opracowanie metod biotransformacji mikrobiologicznej różnych steroidów.

13. Wprowadzenie do praktyki przemysłowej technologii immobilizowanych enzymów.

14. Konstruowanie nowych genotypów metodami inżynierii genetycznej.

15. Dalszy postęp w konstruowaniu bioreaktorów i prowadzeniu bioprocesów.

WYKŁAD 2, 23/02/2012

Prawie każdy proces biotechnologiczny można przedstawić w ogólnym zarysie jako kombinację kolejnych operacji:

• wybór mikroorganizmów do danego procesu

• przygotowanie pożywki

• hodowla mikroorganizmów, wytwarzanie produktu

• wydzielanie i oczyszczanie produktu

Realizacja każdego procesu biotechnologicznego wymaga harmonijnego zgrania wszystkich tych elementów składowych - należy przy tym pamiętać, że głównym kryterium efektywnego prowadzenia procesu biotechnologicznego jest ekonomika produkcji. Oznacza to, że nie wystarczy otrzymać wymagany produkt, lecz że należy wytwarzać go w taki sposób, aby produkcja przynosiła zysk.

Udział różnych dyscyplin w rozwoju procesów biotechnologicznych

Operacje	Dyscypliny
Wybór mikroorganizmów	Systematyka Genetyka Fizjologia Biochemia
Przygotowanie podłoża	Fizjologia Chemia Inżynieria bioprocesowa
Hodowla mikroorganizmów	Fizjologia Inżynieria bioprocesowa
Wydzielanie produktów	Chemia Inżynieria bioprocesowa

Praktyka przemysłowa pokazuje, że wiedza z zakresu chemii, biochemii i mikrobiologii jest niewystarczająca do rozwiązania problemów przemysłu fermentacyjnego, spożywczego i farmaceutycznego. Reakcja biochemiczna stanowi zasadniczy, ale tylko jeden etap procesu produkcyjnego. Znacznie więcej problemów stwarza przygotowanie surowców, prowadzenie procesu oraz izolacja produktu.

Generalnie, przemysł biotechnologiczny uszeregowany jest w sposób branżowy, np.

• produkcja etanolu

• produkcja kwasu cytrynowego

• produkcja lizyny lub metioniny

• produkcja penicylin (i ogólnie antybiotyków)

• produkcja drożdży paszowych i piekarniczych

W różnych nitkach technologicznych występują takie same operacje jednostkowe oraz procesy podstawowe, np.

• fermentacja tlenowa lub beztlenowa

• sedymentacja, wirowanie

• odparowywanie, zatężanie

• filtracja, krystalizacja, suszenie

Pomimo, że liczba bioprocesów i otrzymywanych produktów jest bardzo duża, liczba procesów podstawowych jest niewielka.

Celem inżynierii bioprocesowej jest stworzenie matematycznego opisu procesów podstawowych i operacji jednostkowych:

• aby można było przewidzieć ich przebieg

• w dowolnej skali

• bez konieczności wykonywania doświadczeń pomocniczych

Umożliwia to budowę instalacji przemysłowej bez konieczności prowadzenia kosztownych prób w skali półtechnicznej i technicznej.

Obszar tematyczny inżynierii bioprocesowej:

• przenoszenie pędu - operacje dynamiczne, zachodzące pod działaniem siły

• przenoszenie masy - operacje dyfuzyjne, zachodzące pod wpływem różnicy stężeń jako siły napędowej

• inżynieria reakcji chemicznych i biochemicznych

• bioreaktory

Oczekiwania biotechnologii wobec inżynierii bioprocesowej:

• tworzenie modeli matematycznych oddziaływań biologicznych

• procesy rozdzielania (izolacji) złożonych i wrażliwych produktów

• projektowanie bioreaktorów

Ogólny schemat pełnego procesu biotechnologicznego:

PRZYGOTOWANIE SUROWCÓW (SUBSTRATÓW)	up-stream processing
↓
BIOPRZEMIANA	bioreaktor
↓
IZOLACJA ORAZ OCZYSZCZANIE PRODUKTU	down-stream processing

1929r - Fleming uzyskał penicylinę G w postaci rozcieńczonego, zanieczyszczonego, niestabilnego preparatu.

1940-1943r - produkcja i oczyszczanie penicyliny metodą wymrażania pary wodnej ze stratą >60% produktu w kolejnych etapach

1943r - firma SHELL opracowała technologię zbliżoną do obecnej - zwiększona wydajność do 85%

Podstawy logistyczne procesu biotechnologicznego:

DOSTAWY
↓	dostarczenie i magazynowanie surowców
UP-STREAM PROCESSING
↓	dejonizacja, pasteryzacja, mieszanie
FERMENTACJA
↓
DOWN-STREAM PROCESSING
↓	wytrącanie, dejonizacja, chromatografia, odparowywanie, filtracja, krystalizacja, suszenie pakowanie, magazynowanie, dostawa
KLIENT

Surowce
Materiały używane w procesach fermentacyjnych:

• woda, powietrze

• cukry (jako główne źródło węgla)

• źródła azotu (głównie amoniak)

• sole mineralne

• czynniki wzrostowe (witaminy, aminokwasy)

Źródła węgla i energii stosowane w procesach fermentacji mogą być sklasyfikowane jako:

• nieoczyszczone (surowe)

• częściowo oczyszczone

• oczyszczone (rafinowane)

Surowe substraty są tańsze niż substraty oczyszczone lub częściowo oczyszczone, lecz zawierają różne zanieczyszczenia, które będą musiały być usunięte na dalszych etapach obróbki (down-stream lub up-stream). Występujące zanieczyszczenia mogą nawet powodować zahamowanie procesu fermentacji. Surówka może także charakteryzować się zmienną jakością, co może wpływać na jakość końcowego produktu.

Przykłady stosowanych substratów:

Surówka	Olej palmowy Mączka rybna, mączka sojowa Melasa Namok kukurydziany Woda odpadowa
Substraty częściowo oczyszczone	Syropy glukozowe, syropy fruktozowe Oleje roślinne Skrobia
Substraty oczyszczone (rafinowane)	Media do hodowli komórek Hydrolizaty białkowe Glukoza (proszek) Sacharoza (krystaliczna)

Pepton - hydrolizat białkowy powstały przez trawienie białka pepsyną.

Trypton - hydrolizat białkowy powstały przez trawienie białka trypsyną.

Niektóre różnice pomiędzy procesem chemicznym i biochemicznym (różnice odnoszą się do procesu biochemicznego):

• bardziej złożone mieszaniny reagujące (skład, fazy)

• przyrost stężenia biomasy reagenta jako wynik reakcji biochemicznej

• zdolność mikroorganizmów do syntezy katalizatorów (enzymów) swoich własnych reakcji

• łagodne warunki temperaturowe reakcji

• zasadniczo reakcje przebiegają w fazie wodnej

• stosowane jest niskie stężenie substratu i produktu w mieszaninie reakcyjnej

Kluczowe składniki w projektowaniu bioreakcji:

• termodynamika - zmiany równowagi reakcji, ciepło dostarczane lub wyzwalane, równowaga fazowa

• kinetyka - szybkości reakcji biochemicznych, kinetyka wymiany masy

• stechiometria - ilościowe przekształcenia biochemiczne

• równowaga - bilans masowy i energetyczny

• parametry fizyczne - przepływ materiału, mieszanie w reaktorze

Skala laboratoryjna	Eksperymenty na małą skalę Badanie kinetyki i wydajności Hodowle wytrząsane lub małe bioreaktory Wstępny szacunek kosztów
Skala półtechniczna (pilotowa)	Bioreaktor 100-1000L Badanie kinetyki i wymiany mas Ocena kosztów i zysków (ocena ekonomiczna) Badania nad zwiększeniem skali Badania nad izolacją produktu
Skala przemysłowa	Produkcja komercyjna Bioreaktor 1000-1000000L Rozwiązywanie problemów technicznych Wprowadzanie ulepszeń Optymalizacja procesu Zapewnienie jakości

WYKŁAD 3, 1/03/2012

Główne typy komórek stosowanych w procesach fermentacyjnych

Typy komórek	Przykład
Komórki zwierzęce	CHO - komórki jajnika chomika chińskiego komórki HYBRIDOMA (do produkcji przeciwciał monoklonalnych komórki owadzie
Grzyby	Penicillum sp. Aspergillus sp.
Drożdże	Saccharomyces sp. Saccharomycopsis sp. Kluyveromyces sp. Pichia sp. Candida sp.
Bakterie	Escherichia coli Bacillus sp. Pseudomonas sp. Streptomyces sp.

Porównanie niektórych właściwości organizmów/komórek stosowanych w procesie biokatalizy

	BAKTERIE	DROŻDŻE	GRZYBY	KOMÓRKI ZWIERZĘCE
szybkość wzrostu	+++++	+++	++	+
łatwość manipulacji genetycznych	+++++	+++	++	++
fałdowanie białek	-	++	++	++++
glikozylacja białek	-	?	?	++++
odporność mechaniczna	++++	++++	++++	+

Chociaż przedstawione porównanie jest bardzo dużym uogólnieniem, to z tabeli tej wynika, że komórki bakteryjne pomimo szybkiego wzrostu i łatwości manipulacji genetycznej, nie posiadają dwóch bardzo ważnych cech: właściwego fałdowania obcych białek (rekombinowanych) oraz ich glikozylacji (generalnie zdolności do modyfikacji potranslacyjnych). Z tych powodów szereg firm farmaceutycznych coraz powszechniej wykorzystuje komórki zwierzęce do produkcji białek zwierzęcych (ludzkich) dla celów terapeutycznych (w tym np. enzymów do leczenia niektórych genetycznie uwarunkowanych schorzeń genetycznych).

Główne produkty procesu biochemicznego

TYP PRODUKTU	TYPOWY STOSOWANY MIKROORGANIZM	WIELKOŚĆ RYNKU ŚWIATOWEGO (ton/rok)
związki organiczne	Saccharomyces cerevisiae	2 x 10^7
biomasa	drożdże	5 x 10^5
kwasy organiczne	Aspergillus niger	3 x 10^5
aminokwasy	Brevibacterium flavum	3 x 10^5
transformacje mikrobiologiczne	Rhizopus arrhizus	4 x 10^4
antybiotyki	Penicillum chrysogenum	4 x 10^4
enzymy	Aspergillus niger	1,4 x 10^3

Transformacje mikrobiologiczne - np. transformacje steroidów (zmiana podstawników, stereoizomeria).

Rodzaje procesów przemysłowych

PROCES	CZYNNIK KATALITYCZNY	PRZYKŁADY
BIOSYNTEZY	drobnoustroje	biosynteza aminokwasów, antybiotyków, polisacharydów produkcja preparatów paszowych
		komórki zwierzęce	produkcja szczepionek i przeciwciał monoklonalnych
		komórki roślinne	biosynteza terpenów, estrów i alkaloidów
		enzymy	biosynteza makrolidów, dekstranu, akrylamidu
	BIOTRANS- FORMACJE	drobnoustroje	biotransformacje steroidów otrzymywanie kwasu octowego i innych kwasów, sorbozy
		enzymy	konwersja glukozy do fruktozy, fumaranu do jabłczanu transformacje steroidów
HYDROLIZA	enzymy	hydroliza białek, oligosacharydów i polisacharydów hydroliza enancjomerów

Bilansowanie wzrostu mikroorganizmów

Ilościowe ujęcie procesu technologicznego jest podstawowym narzędziem w każdej dyscyplinie inżynierskiej. Modele matematyczne są szeroko stosowane w projektowaniu, optymalizacji i sterowaniu procesami inżynierii chemicznej. Opisy ilościowe obejmują bilanse masowe i energetyczne oraz opisy kinetyki danego procesu. Zestawienie bilansów masowego i energetycznego jest podstawową czynnością przy projektowaniu procesu technologicznego. Zasady bilansowania procesów (przemian) chemicznych są znane (stechiometria reakcji) i zasadniczo nie sprawiają trudności.

Przemiany biochemiczne różnią się od przemian chemicznych tym, że główny składnik przemian biochemicznych - mikroorganizmy - cechuje zmienność typowa dla organizmów żywych, zaś reakcje przebiegające wewnątrz komórek są bardziej złożone. Z tych powodów bezpośrednie zastosowanie reguł stechiometrycznych do przemian biochemicznych nie jest możliwe.

Trudności, jakie stwarza ilościowe ujęcie przemian biochemicznych ilustruje podany niżej przykład.

Reakcję utleniania węgla można opisać prostym równaniem:

C + O₂ → CO₂ + Q (Δ_h⁰ = -397,7kJ/mol)

Zgodnie z powyższym równaniem stechiometrycznym, podczas spalania 1kg węgla powinniśmy otrzymać 3,67kg CO₂ oraz 32,8MJ energii.

W rzeczywistości bezpośrednie wykorzystanie tego równania nie jest możliwe, gdyż węgiel kamienny, obok pierwiastka węgla (około 60%), zawiera również inne składniki, zarówno palne (siarka), jak i niepalne. Skład węgla kamiennego jest zmienny. Spalanie węgla kamiennego można przedstawić w sposób ogólny na schemacie:

WĘGIEL KAMIENNY

+

POWIETRZE

→

GAZY SPALINOWE

+

ŻUŻEL

+

Q

Ilość wydzielanego ciepła zależy od rodzaju spalanego węgla. Wynosi przeciętnie
16-22MJ/kg węgla. Ilość i skład gazów spalinowych zależą również od składu spalanego węgla.

Zatem do sporządzenia bilansu spalania węgla kamiennego niezbędne są dane o jego składzie i stopniu przekształcenia składników węgla w gazy spalinowe. Bilans taki będzie prawdziwy dla konkretnego surowca oraz warunków spalania. Z praktycznego punktu widzenia możliwe jest sporządzenie takiego bilansu dla pewnych przeciętnych danych dotyczących składu węgla i stopnia konwersji. Przy takim podejściu nie uwzględnia się wszystkich przemian zachodzących podczas spalania, nie przeprowadza się również bilansowania wszystkich pierwiastków występujących w węglu kamiennym.

W przypadku bilansowaniu procesów biochemicznych stopień napotykanych trudności jest znacznie większy, ponieważ:

• skład elementarny mikroorganizmów jest zmienny

• zmienny jest stopień przetworzenia substratów w produkty

Wzrost mikroorganizmów jest zjawiskiem bardzo złożonym. Komórki do wzrostu potrzebują szeregu substancji. Wewnątrz komórki zachodzi szereg przemian biochemicznych, w wyniku których powstają produkty i wytwarzana jest niezbędna energia.

Typowe substraty w układach biologicznych (źródła pierwiastków):

źródła węgla	glukoza, aminokwasy
źródła azotu	NH4Cl, (NH4)2SO4, aminokwasy, białka
źródła tlenu	powietrze
źródła wodoru	związki organiczne
źródła fosforu	fosforan nieorganiczny PO4^3-

Typowe produkty w systemach biologicznych to biomasa, produkty reakcji i metabolity.

Ustalenie struktury chemicznej i podanie wzoru produktu i metabolitu jest proste. Lecz jaki wzór chemiczny przypisać można komórce (biomasie)? Z uwagi na złożoność i różnorodność procesów biochemicznych zachodzących w komórce, nie jest możliwe uwzględnienie wszystkich relacji stechiometrycznych i kinetycznych tych przemian.

Generalnie, punktem wyjścia jest oparcie się o znane szlaki metaboliczne. Można zauważyć, że makroskopowe przedstawienie procesu nie uwzględnia wszystkich elementów danej przemiany. Dobrym przykładem może być produkcja etanolu przez drożdże S. cerevisiae oraz X. mobilis.

W przypadku drożdży, makroskopowo równanie wygląda w ten sposób:

C₆H₁₂O₆ → 2C₂H₅OH + 2CO₂

Biochemicznie, reakcja netto:

C₆H₁₂O₆ + 2ADP + 2P_i → 2C₂H₅OH + 2CO₂ + 2ATP + 4H₂O +Q

W przypadku X. mobilis zapis makroskopowy jest identyczny, jak u drożdży, ale zapis biochemiczny netto jest inny:

C₆H₁₂O₆ + ADP + P_i → 2C₂H₅OH + 2CO₂ + ATP + 2H₂O +Q

Z uwagi na wspomnianą złożoność procesu wzrostu mikroorganizmów, wszelkie opisy ilościowe muszą ograniczać się do wybrania istotnych zależności występujących podczas rozwoju populacji mikroorganizmów. Modelowanie procesów biologicznych jest zatem trudniejsze od modelowania procesów chemicznych. Podstawowa metoda ilościowego ujęcia procesu wzrostu mikroorganizmów polega na poszukiwaniu takich wielkości charakteryzujących mikroorganizmy oraz procesy ich namnażania, których wartości są względnie stałe. Umożliwia to konstruowanie modeli uogólniających. Zależności takie, średnie wartości parametrów, służyć mogą do obliczeń szacunkowych procesu wzrostu mikroorganizmów.

Skład biomasy mikroorganizmów

Podanie zawartości wszystkich pierwiastków tworzących biomasę jest trudne - w praktyce ogranicza się do czterech podstawowych pierwiastków: C, H, O, N. Ponieważ stanowią one około 95% całości suchej masy, zatem sporządzenie bilansu dla tych pierwiastków jest wystarczająco dobrym przybliżeniem. Jedynie w wyjątkowych przypadkach uwzględnia się siarkę i fosfor.

Dla celów bilansu elementarnego, skład biomasy mikroorganizmów można przedstawić w postaci analogicznej do wzoru stechiometrycznego związku chemicznego:

C_δH_aO_bN_c

δ = 0 lub 1 (węgla nie ma w związku lub w nim jest)

Dla E. coli:

C: 50% suchej masy

H: 8% suchej masy

O: 20% suchej masy

N: 14% suchej masy

Na tej podstawie wyliczono średni wzór dla biomasy:

CH_1,8O_0,5N_0,2

Ilość substancji odpowiadająca temu wzorowi nazywana jest węglomolem (C-mol), a zatem węglomol to taka ilość substancji, która zawiera 1 mol węgla.

Zgodnie z tą definicją wzory i masy węglomola podanych substancji są następujące:

etanol → C₂H₅OH → CH₃O_0,5 → 23g/C-mol

glukoza → C₆H₁₂O₆ → CH₂O → 30g/C-mol

Dla związków nie zawierających węgla (δ=0) wzór nie ulegnie zmianie, a węglomol jest równy molowi tego związku.

W przypadku biomasy należy ustalić strukturę węglomola w oparciu o dane analizy elementarnej. Doświadczalnie wykazano, że współczynniki stechiometryczne zmieniają się w podanych niżej przedziałach:

H: 1,5-2,0

O: 0,43-0,56

N: 0,10-0,25

Jako średnią wartość przyjmujemy wzór:

CH_1,8O_0,5N_0,2

Skład elementarny wybranych mikroorganizmów

MIKROORGANIZM	WĘGLOMOL
Saccharomyces cerevisiae	CH1,83O0,54N0,1
Candida utilis	CH1,83O0,50N0,17
Klebsiella aerogenes	CH1,87O0,56N0,20
Aerobacter aerogenes	CH1,83O0,55N0,25

Znając wzór węglomola biomasy można wyliczyć zapotrzebowanie na substraty podczas jej produkcji.

Stechiometria pewnej reakcji:

C₆H₁₂O₆ + aO₂ + bNH₃ → cCH_1,66O_0,5N_0,18 + dCO₂ + eH₂O

Bilans pierwiastkowy:

węgiel	6	=	c + d
wodór	12 + 3b	=	1,66c + 2e
tlen	6 + 2a	=	0,5c + 2d + e
azot	b	=	0,18c

Mamy układ czterech równań z pięcioma niewiadomymi. Konieczna jest znajomość parametru, który pozwoli na wyeliminowanie jednej niewiadomej (aby rozwiązać układ równań). Często do tego celu używa się tzw. iloraz oddechowy RQ, określający stosunek uwalnianego CO₂ do ilości wykorzystywanego O₂.

W omawianym przypadku:

RQ = ^d/_a = 1,02

RQ pozwala na wyeliminowanie jednej wartości (d lub a) i rozwiązanie układu równań opisującego bilans pierwiastków. Znając współczynniki stechiometryczne i masę węglomola biomasy można łatwo obliczyć wydajność tworzenia biomasy w przeliczeniu na zużycie substratu i tlenu.

WYKŁAD 4, 8/03/2012

Oznaczanie zawartości biomasy jest jedną z podstawowych czynności analitycznych podczas bioprocesu. Znajomość zmian stężeń biomasy jest niezbędne do wyznaczenia kinetyki wzrostu mikroorganizmów i przyrostu produktu podczas hodowli i obliczania wydajności.

Biomasa - masa mikroorganizmów rosnących na pożywce; może odnosić się do dwóch pojęć:

• mokra biomasa - masa mikroorganizmów oddzielonych od pożywki poprzez wirowanie lub filtrację; jest to zatem łączna masa mikroorganizmów i wody zawartej w przestrzeni pomiędzy komórkami

• sucha biomasa - masa mikroorganizmów oddzielonych od pożywki i wysuszonych w temperaturze 105ºC do stałej wagi

105ºC - temperatura, w której pozbywa się wody krystalizacyjnej. Wyższa temperatura mogłaby zniszczyć związki organiczne.

Metody oznaczania biomasy mikroorganizmów hodowanych w ciekłych podłożach:

• bezpośrednie, polegające na wagowym oznaczeniu masy drobnoustrojów oddzielonych od pożywki - dające wartość mokrej biomasy

• pośrednie:

• metoda turbidymetryczna - polega na pomiarze zmętnienia zawartości komórek w pożywce; metoda ta może być wykorzystywana tylko w określonym zakresie stężeń; dokładność pomiaru zależy również od właściwego przygotowania próby (konieczne jest wyeliminowanie składników pożywki, które wpływają na pomiar)

• metody chemiczne - polegają na oznaczeniu stężenia określonego składnika komórki; przyjmując, że jego zawartość jest wartością stałą; najczęściej oznacza się zawartość ATP (np. metody luminescencyjne z lucyferazą)

W ciągu doby organizm ludzki jest w stanie wyprodukować około 45kg ATP.

Technika filtracji membranowej obejmuje:

• zawiesina fermentacyjna jest filtrowana przez wysuszony, wytarowany filtr membranowy (standardowo sączek z octanu celulozy)

• filtr jest przemywany celem usunięcia rozpuszczalnych składników medium

• filtr jest suszony i ważony

sucha masa (g/dm³) = ^{(masa membrany po filtracji - masa membrany przed filtracją)}/_{objętość próby}

Technika wirowania obejmuje:

• wirowanie zawiesiny fermentacyjnej w wysuszonych, zważonych probówkach przy najwyższych obrotach

• usunięcie supernatantu, przemycie osadu i ponowne wirowanie

• wysuszenie osadu w probówce i jej zważenie

sucha masa (g/dm³) = ^{(masa probówki po filtracji - masa probówki przed filtracją)}/_{objętość próby}

Wzrost mikroorganizmów jest wysoce złożoną przemianą, w której z surowców podłoża hodowlanego wytwarzana jest biomasa oraz produkty metabolizmu.

Bilans ogranicza się w zasadzie do czterech podstawowych pierwiastków (C, H, O, N). W rzeczywistości w pożywce może występować kilka substancji pełniących identyczne funkcje (np. stanowiących źródło węgla). Do celów bilansowych można je zastąpić jednym substratem o odpowiednio dobranym składzie (w sensie chemicznym). W takim ujęciu ogólny schemat rozpatrywanego procesu można przedstawić następująco:

S_S + S_N + O₂ → X + P + CO₂ + H₂O + Q

S_S - źródło węgla

S_N - źródło azotu

X - biomasa

P - produktu metabolizmu

Q - ciepło

ν_S CH_aSO_bSN_cS + ν_N C_δNH_aNO_bNN_cN + ν_O O₂ → ν_X CH_aXO_bXN_cX + ν_P CH_aPO_bPN_cP + ν_C CO₂ + ν_w H₂O

C:	νS + νNδN	=	νX + νP + νC
H:	νSaS + νNaN	=	νXaX + νPaP + 2νW
O:	νSbS + νNbN + 2νO	=	νXbX + νPbP + 2νC + νW
N:	νScS + νNcN	=	νXcX + νPcP

W tym układzie równań występuje 7 niewiadomych współczynników bilansowych, układ nie ma zatem rozwiązania. Niezbędne więc są 3 równania dodatkowe, wiążące ze sobą współczynniki bilansowe.

Przemianę ogólną można opisać równaniem:

CH_iO_j + a NH₃ + b O₂ → c CH_kO_lN_m + d CH_nO_oN_p + e H₂O + f CO₂ + Q

c, d, f - ułamki ilości węgla przekształconego w biomasę, produkty metabolizmu i CO₂

Bilans pierwiastków prowadzi do następującego układu równań:

C:	1	=	c + d + f
H:	i + 3a	=	ck + dn + 2e
O:	j + 2b	=	cl + do + e + 2f
N:	a	=	cm + dp

Otrzymano 4 równania i znacznie więcej niewiadomych, co uniemożliwia rozwiązanie równania. Problem jest znacznie prostszy, jeżeli znamy wartości poszczególnych współczynników.

Rozważmy wzrost drożdży Saccharomyces cerevisiae. Przyjmując, że skład biomasy drożdży jest następujący C₆H₁₀O₃N i rosną one na glukozie, wykorzystując ją jako źródło węgla, można napisać następujące równanie:

C₆H₁₂O₆ + b O₂ + c NH₃ → d C₆H₁₀O₃N + e H₂O + f CO₂

C₆H₁₂O₆ → 2 C₂H₅OH + 2 CO₂

Uwzględniając tu fakt, że glukoza jest również przekształcana w etanol. Jeżeli oznaczymy przez `E' ułamek ilości glukozy przekształconej w etanol, to w biomasę przekształcone będzie `1-E' glukozy. Jeśli zatem pierwsze równanie pomnożymy przez `1-E', a drugie przez `E' i dodamy je stronami, otrzymamy równanie:

C₆H₁₂O₆ + (1-E) b O₂ + (1-E) c NH₃ → (1-E) d C₆H₁₀O₃N + [(1-E) + 2E] CO₂ + (1-E) e H₂O + 2E C₂H₆O

C:	6	=	6(1-E)d + (1-E)f + 2E + 4E
H:	12 + 3(1-E)c	=	10(1-E)d + 2(1-E)e + 12E
O:	6 + 2(1-E)b	=	3(1-E)d + 2(1-E)f + 4E + (1-E)e + 2E
N:	(1-E)c	=	(1-E)d

Doświadczalnie można wyznaczyć kilka wartości i pozbyć się współczynników b, f i c lub d.

Współczynniki wydajności określają ilość powstającej biomasy lub produktu z określonej ilości substratu.

1. wyrażone w węglomolach

• współczynnik wydajności biomasy względem substratu (c-mol/c-mol)

y_X/S = ν_X/ν_S

• współczynnik wydajności produktu względem substratu (c-mol/c-mol)

y_P/S = ν_P/ν_S

2. współczynniki masowe (g_X/g_S, g_P/g_S)

Y_X/S = Δm_X/-Δm_S = y_X/S ∙ (M_{C, X}/M_{C, S})

Współczynnik wydajności wzrostu drożdży na glukozie

Wydajność masowa: Y_X/S = 0,5g/g

c-mol glukozy: 30g/c-mol

c-mol biomasy: 25,9g/c-mol

y_X/S = Y_X/S ∙ (M_C,S/M_C,X) = 0,5 ∙ 30/25,9 = 0,58 c-mol/c-mol

W przedstawionej metodzie bilansowania wzrostu podstawową rolę odgrywa założenie, że skład biomasy mikroorganizmów jest stały w warunkach wzrostu ustalonego.

Można zatem przyjąć, że relacje pomiędzy ilością zużywanego substratu i ilością powstającej biomasy są również stałe. Relacje te opisuje współczynnik wydajności biomasy względem substratu. W praktyce stosuje się masowy współczynnik wydajności:

Y_X/S = y_{X/S ∙} (σ_S/σ_X)

gdzie σ oznacza zawartość węgla w danym związku.

σ_glukoza = 6C/C₆H₁₂O₆ = 72/180 = 0,40

σ_biomasa = 12/24,6 = 0,49

WYKŁAD 5, 15/03/2012

Współczynnik wydajności biomasy jest zależny od:

• rodzaju substratu

• rodzaju medium (pożywki) i warunków wzrostu (wydajność jest wyższa w optymalnych warunkach pH, składu pożywki i natlenienia)

Zasada Finka

Podczas wzrostu drożdży około 1/3 węgla z substratu wydzielana jest w postaci CO₂, natomiast 2/3 jest wbudowywane w biomasę. Zgodnie z tą zasadą wartość współczynnika
y_X/S = 0,67. Wartość ta jest zbliżona do średnich wartości tego współczynnika wydajności w przypadku wzrostu na węglowodanach. Nie jest to jednak reguła ogólna i obserwuje się różnice w wartości tego współczynnika w odniesieniu do różnych substratów metabolizowanych przez ten sam mikroorganizm.

Współczynnik wydajności biomasy:

• wyznaczony eksperymentalnie

• wielkość tego współczynnika różni się w zależności od organizmu, warunków wzrostu lub substratu

Teoretyczna wydajność produktu

Znajomość teoretycznej maksymalnej wydajności, z jaką surowiec jest przekształcany w produkt jest ważnym parametrem w projektowaniu bioprocesu i jego doskonaleniu. Zwrot zainwestowanych środków w udoskonalenie produkcji jest wyższy, jeśli wyjściowa wydajność była znacząco niższa od teoretycznego maksimum niż wtedy, gdy wydajność jest bliska maksimum.

Przykład

Obliczyć teoretyczną maksymalną wydajność produkcji fenyloalaniny z glukozy dla E. coli rosnącej na pożywce z glukozą i amoniakiem.

Przebieg szlaku metabolicznego:

GLUKOZA → → → → → FENYLOALANINA

W uproszczeniu przebieg reakcji jest następujący:

1 GLUKOZA → 2 PEP (fosfoenolopirogronian)

1 GLUKOZA → 1 E4P (erytrozo-4-fosforan)

1 PEP + 1 E4P → „INTERMEDIAT A“

INTERMEDIAT A + 1 PEP → FENYLOALANINA

Sumarycznie:

2 GLUKOZA → FENYLOALANINA

2 ∙ 180g 165g

Y_P/S = 165/360 = 0,458g Phe/ g glukozy

Można wyróżnić następujące sytuacje:

1. Produkty są wytwarzane bezpośrednio z substratów w sposób energetycznie uprzywilejowany, tzn. następuje wytworzenie energii chemicznej netto.

1 mol glukozy → 2 mole etanolu + 2 mole ATP

Teoretyczna maksymalna wydajność wynosi:

Y_P/S = 96/180 = 0,51 kg etanolu/kg glukozy

Rzeczywista wydajność jest niższa, gdyż część glukozy jest przekształcana w biomasę i na pokrycie energetycznego zapotrzebowania komórek. Podstawą obliczeń jest sumaryczne równanie glikolizy.

2. Produkcja glutaminianu z glukozy przez Corynebacterium glutamicum przebiegające w następującym szlaku metabolicznym:

GLUKOZA + 2 ADP + 2 P_i → 2 PIROGRONIAN + 2 ATP

PIROGRONIAN + NAD⁺ → ACETYLO-CoA + CO₂ + NADH/H⁺

PIROGRONIAN + CO₂ + ATP + H₂O → SZCZAWIOOCTAN + ADP + P_i

ACETYLO-CoA + SZCZAWIOOCTAN + NAD⁺ → α-KETOGLUTARAN + CO₂ + NADH/H⁺

α-KETOGLUTARAN + NADPH/H⁺ + NH₃ → GLUTAMINIAN + NADP⁺ + H₂O

Sumarycznie:

GLUKOZA + NH₃ + ADP + P_i + NADPH/H⁺ + 2 NAD⁺ →

→ GLUTAMINIAN + CO₂ + ATP + 2 NADH/H⁺ + NADP⁺

Zatem reakcja jest energetycznie możliwa (powstaje 1 mol ATP i 2 mole NADH/H⁺); maksymalna teoretyczna konwersja (w odniesieniu do węgla) wynosi:

5 c-moli Glu/6 c-moli glukozy

Y_P/S = 143/180 = 0,79g Glu/g glukozy

3. Wytwarzanie produktu wymaga nakładu energii (pochodzącej z katabolizmu substratu) i można proces ten opisać równaniem ogólnym:

a C_αH_βO_γN_δ + b C_αH_βO_γN_δ + c ATP → C_αH_βO_γN_δ + c ADP + c P_i

Energia jest generowana w wyniku katabolizmu substratu.

C_αH_βO_γN_δ + b O₂ + d ADP + d P_i → c CO₂ + d ATP

Maksymalna wydajność jest kombinacją dwóch reakcji, w których produkcja/zużycie ATP wynosi 0. W obliczeniach, dla uproszczenia, przyjmuje się, że NADH/H⁺ jest równoważnikiem 3 ATP. We wszystkich obliczeniach zakłada się również, że ΔG₀ dla każdej reakcji jest ujemna.

Przykład obliczania wydajności biomasy

Komórki zarodka sosny Douglasa hodowano w bioreaktorze. Po okresie wstępnego wzrostu komórki potraktowano regulatorami wzrostu, powodując powstanie zarodków (identycznych klonów), które tworzyły następnie „syntetyczne nasiona”.

Medium wyjściowe zawierało 200kg glukozy i 25kg amoniaku na 1m³.

Do 0,95m³ medium dodano 0,05m³ komórek, inicjując hodowlę. Po dwóch tygodniach nastąpiło całkowite zużycie glukozy.

Otrzymano 0,35m³ biomasy.

Stężenie amoniaku obniżyło się do 0,001kg/m³.

Specyficzna gęstość mokrej biomasy była równa 1020kg/m³, a zawartość H₂O wynosiła 90%.

Obliczyć Y_X/glukoza i Y_X/amoniak. Wyrazić biomasę jako suchą masę.

1. Obliczyć suchą masę biomasy.

X_wstępna: 0,05m³ ∙ 1020kg/m³ ∙ 10% = 5,1kg

X_końcowa: 0,35m³ ∙ 1020kg/m³ ∙ 10% = 35,7kg

Przyrost biomasy: 35,7kg - 5,1kg = 32,6kg

2. Obliczyć wydajność biomasy.

Y_X/glukoza = ^{[przyrost biomasy]}/_{[ilość przekształconej glukozy]} = 32,6/(0,95∙200) = 0,16kg biomasy/kg glukozy

Y_X/amoniak = 32,6/(0,95∙25) = 1,29kg biomasy/kg amoniaku

Masę końcową amoniaku można pominąć, ze względu na bardzo niskie stężenie.

Bilanse pierwiastków można uogólniać, wprowadzając pojęcie stopnia redukcji. Jest to liczba moli wolnych elektronów w przeliczeniu na 1 mol węgla. Elektrony te mogą być przekazywane na tlen w procesie utlenienia.

Liczba elektronów obliczana jest addytywnie.

C - dawca 4 elektronów (+4)

H - dawca 1 elektronu (+1)

O - akceptor 2 elektronów (-2)

N - akceptor 3 elektronów (-3)

Bilans tlenu

W przypadku bilansu tlenu w procesie wzrostu mikroorganizmów korzystamy ze stopnia redukcji.

Rozważmy całkowite utlenienie substratu o wzorze ogólnym:

C_δH_aO_bN_c

Jak obliczyć ilość tlenu niezbędną do utlenienia tego substratu?

Równanie reakcji jest następujące:

C_δH_aO_bN_c + n O₂ → δ CO₂ + ½ a H₂O + ½ c N₂

Bilans elementarny dla tlenu jest następujący:

b + 2n = 2δ + ½ a

n = ¼ (4δ + a - 2b)

Γ = 4δ + a - 2b

Γ (bezwzględny stopień redukcji) - liczba elektronów przeniesionych na tlen przy jego całkowitej redukcji.

γ_i = Γ_i - c_i/c_N ∙ Γ_N

γ_i (względny stopień redukcji) - zależny od związku, który jest źródłem azotu; dla soli amonowych Γ_N = 3, zatem:

γ_i = 4 + a_i - 2b_i - 3c_i

Przyjmując za punkt wyjścia równanie stechiometryczne reakcji:

ν_S CH_aSO_bSN_cS + ν_N C_δNH_aNO_bNN_cN + ν_O O₂ → ν_X CH_aXO_bXN_cX + ν_P CH_aPO_bPN_cP + ν_C CO₂ + ν_w H₂O

Można w oparciu o współczynnik bilansowy rozwinąć równanie bilansowe względem ν_O:

ν_O = ¼ (ν_SΓ_S + ν_NΓ_N - ν_XΓ_X - ν_PΓ_P)

Znajomość współczynników wydajnośći biomasy z substratu i współczynnika wydajności produktu umożliwia wyznaczenie ilości zużywanego azotu:

ν_N/ν_X = 1/c_N ∙ (c_X - c_S/y_X/S - c_P ∙ y_P/X)

Pozwala to wyeliminować z równania ν_N. Równanie przyjmuje postać:

ν_O = ¼ (ν_Sγ_S - ν_Xγ_X - ν_Pγ_P)

Wprowadzenie pojęcia względnego stopnia redukcji oznacza przyjęcie za stan odniesienia stopień redukcji związku stanowiącego źródło azotu. Jeżeli uwzględnimy definicję względnej wydajności biomasy y_X/S, to można wyznaczyć współczynnik zużycia tlenu.

Dla glutaminianu C₅H₉O₄N:

Γ_X = 4 + 1,8 - 2 ∙ 0,5 - 3 ∙ 0,2 = 4,2

Γ_N = 4 ∙ 5 + 9 - 2 ∙ 4 - 3 = 18

γ_X = Γ_X - c_X/c_N ∙ Γ_N = 4,2 - 1/5 ∙ 18 = 0,6

y_O/X = ν_O/ν_X = ¼ (γ_S/y_X/S - γ_X - y_P/Sγ_P)

Jeżeli ν_P = 0 (czyli nie powstaje produkt metabolizmu):

y_O/X = ¼ (γ_S/y_X/S - γ_X)

W przypadku wzrostu drożdży na glukozie:

y_O/X = ¼ (4/0,52 - 4,2) = 0,87 mola tlenu/g suchej masy = 1,07g tlenu/g s.m.

Wartość współczynnika y_O/X jest wartością nieujemną, zatem:

y_X/S < γ_S/γ_X - y_P/S ∙ γ_P/γ_X

To równanie podaje ograniczenie bilansowe, wynikające z bilansu tlenu. Z bilansu węgla wynika kolejne ograniczenie:

y_X/S < 1 - y_P/S

Zatem dla prostego wzrostu (y_P/S = 0) będą występowały dwa zakresy limitowania współczynnika wydajności biomasy z substratu:

• dla γ_S < γ_X ograniczenie wynika z bilansu tlenu

• dla γ_S > γ_X ograniczenie wynika z bilansu węgla

WYKŁAD 6, 22/03/2012

Zależności między współczynnikiem wydajności biomasy z substratu y_X/S i stopniem redukcji substratu γ_S wyznaczono doświadczalnie, otrzymując wartości:

γ_S < 4,67 → y_X/S = 0,13γ_S

γ_S > 4,67 → y_X/S = 0,60

Wykres zależności teoretycznej, przy założeniu, że z substratu powstaje wyłącznie biomasa.

Wartości te umożliwiają przybliżone obliczenie asymilacji tlenu. Na podstawie tych wartości, dla przeciętnego składu biomasy:

dla γ_S ≤ 4,67

y_O/X = ν_O/ν_X = 0,87 mola tlenu/c-mol biomasy

dla γ_S ≥ 4,67

Y_O/X = 0,417γ_S - 1,05 mola tlenu/kg biomasy

Należy pamiętać, że współczynniki wydajności dla tego samego substratu mogą być różne dla różnych mikroorganizmów. Znajomość ograniczeń pozwala na optymalny dobór składu pożywki.

Zależność współczynnika wydajności biomasy od stopnia redukcji substratu:

Zależność współczynnika zużycia tlenu od stopnia redukcji substratu:

Przeciętne wartości współczynnika wydajności (uśrednione dla wszystkich mikroorganizmów):

	yX/S (c-mol/c-mol)	YO/X (mol/kg)	YO/X (MJ/kg)
GLUKOZA	0,54	32,0	14,7
GLICEROL	0,61	34,5	15,9
METAN	0,59	93,6	43,1
ETANOL	0,57	63,3	29,1

Współczynniki wydajności wzrostu różnych mikroorganizmów na glukozie w warunkach tlenowych:

	yX/S (c-mol/c-mol)	YO/X (mol/kg)	YO/X (MJ/kg)
Candida utilis	0,60-0,66	18,2-23,8	8,7-11,4
Saccharomyces cerevisiae	0,65	19,1	9,0
Trichoderma viridae	0,62-0,71	9,2-21,8	4,8-10,5
Eschericha coli	0,52-0,62	21,8-25,9	10,5-12,5
Pseudomonas fluorescens	0,45	45,7	21,5

Rozważmy proste równanie stechiometryczne:

CH_iO_j + a NH₃ + b O₂ → y CH_rO_sN_t + z CH_uO_vN_w + c H₂O + d CO₂

(S) (X) (P)

Stopień redukcji (γ) można zdefiniować następująco:

S:	γS	=	4 + i - 2j
X:	γX	=	4 + r - 2s - 3t
P:	γP	=	4 + u - 2v - 3w

γ_H2O = γ_CO2 = γ_NH3 = 0

Wyprowadzamy zależność:

γ_S - 4b = yγ_X + 2γ_P

b = ¼ (γ_S - yγ_X - 2γ_P)

Warunkiem wyprowadzenia tej zależności jest znajomość:

• wartości stopnia redukcji (γ_i) związków - a więc ich struktura

• ilości wyprodukowanej biomasy (y)

• ilości powstałego produktu (z)

Przykład

Obliczyć ilość butanolu wyprodukowanego ze 100 moli glukozy, zgodnie z równaniem stechiometrycznym

100 C₆H₁₂O₆ + a NH₃ → 13 C_4,46H_16,01O_3,88N_0,86 + x CH₃(CH₂)₃OH + 22 C₃H₆O +
0,4 CH₃(CH₂)₂COOH + 14 CH₃COOH + y CO₂ + 135 H₂ + 0,7 C₂H₅OH

Wartości niezbędne do obliczeń zebrano w tabeli:

ZWIĄZEK	γi	γi ∙ νi
SUBSTRATY
C6H12O6	24	24 ∙ 100 = 2400
NH3	0	a ∙ 0 = 0
PRODUKTY
X (biomasa)	23,51	23,51 ∙ 13 = 305,63
CH3(CH2)3OH	24	x ∙ 24
C3H6O	16	16 ∙ 22 = 352
CH3(CH2)2COOH	20	20 ∙ 0,4 = 5
CH3COOH	8	8 ∙ 14 = 112
CO2	0	y ∙ 0 = 0
H2	2	2 ∙ 135 = 270
C2H5OH	12	12 ∙ 0,7 = 8,4

SUBSTRATY: γ_i ∙ ν_i = 2400

PRODUKTY: γ_i ∙ ν_i = 1053,03 + 24x

2400 = 1053,03 + 24x

x = 56,12

Oznacza to, że ze 100 moli glukozy (18 000g) otrzymujemy 56,12 moli butanolu (4152,88g). Wynik ten otrzymano bez potrzeby wyznaczana współczynników a oraz y.

Jeśli równanie:

γ_S - 4b = yγ_X + zγ_P

podzielimy przez γ_S, otrzymamy:

4b/γ_S + y γ_X/γ_S + z γ_P/γ_S = 1

↑ ↑ ↑

ε + η + ξ_P = 1

ε - ułamek ilości elektronów przekazanych na tlen

η - ułamek ilości elektronów przekazanych do biomasy

ξ - ułamek ilości elektronów przekazanych do produktu

Często skład substratu jest nieznany. W takim przypadku metodę obliczania stopnia redukcji można uzupełnić następującymi, prostymi regułami.

Q_O = 112,968 kJ/mol

Jest to równoważnik energetyczny 1 mola elektronów przekazanych na tlen.

γ_X = 4,29 (w przeliczeniu na 1 gramoatom w biomasie)

σ_X = 0,462g węgla/g suchej biomasy

Dla biomasy o standardowym składzie:

σ_X = 12/24,6 = 0,488g węgla/g suchej masy

Bilans tlenu - iloraz oddechowy RQ

RQ = ν_C/ν_O = [4(1 - y_X/S - y_P/S)] / [γ_S - y_X/Sγ_X - y_P/Sγ_P]

Jeśli nie tworzy się produkt: y_P/S = 0

RQ = [4(1 - y_X/S)] / [γ_S - y_X/Sγ_X]

Iloraz oddechowy dla wzrostu drożdży na:

1. glukozie

C₆H₁₂O₆ + 6O₂ → 6CO₂ + 6H₂O

RQ = [4(1 - 0,6)] / [4 - 0,6 ∙ 4,2] = 1,08

2. etanolu

C₂H₅OH + 3O₂ → 2CO₂ + 3H₂O

RQ = [4(1 - 0,6)] / [6 - 0,6 ∙ 4,2] = 0,49

Przykład

Obliczyć współczynnik wydajności biomasy y_X/S dla drożdży Pichia sp. hodowanych na a) glukozie i b) etanolu, wiedząc, że z 1g substratu powstało odpowiednio a) 0,56g suchej masy i b) 0,61g suchej masy tych drożdży.

c-mol glukozy - 30g

c-mol etanolu - 23g

c-mol biomasy - 25,9g

y_X/S = Y_X/S ∙ M_S/M_X

y_X/glukoza = 0,56 ∙ (30/25,9) = 0,65

y_X/etanol = 0,61 ∙ (23/25,9) = 0,54

Obliczyć współczynnik zużycia tlenu

a. dla drożdży rosnących na glukozie:

y_O/X = ¼ (4/0,65 - 4,2) = 0,488 mola tlenu/c-mol biomasy

Y_O/X = 0,488/25,9 = 0,019 mola tlenu/g suchej masy

b. dla drożdży rosnących na etanolu:

y_O/X = ¼ (6/0,54 - 4,2) = 1,728 mola tlenu/c-mol biomasy

Y_O/X = 1,728/25,9 = 0,067 mola tlenu/g suchej masy

Wzrost mikroorganizmów a generowanie ciepła (termodynamika)

Wzrost mikroorganizmów jest wynikiem szeregu powiązanych ze sobą procesów metabolicznych. Reakcje kataboliczne i anaboliczne są ze sobą sprzężone tak, że energia wyzwalana w tych pierwszych jest wykorzystywana jako siła napędowa w tych drugich. Należy pamiętać, że część energii jest tracona (rozpraszana) w postaci ciepła.

W procesach na dużą skalę konieczne jest odprowadzanie (usuwanie) tego ciepła tak, aby prowadzić hodowlę w temperaturze fizjologicznej.

W małych bioreaktorach ciepło metaboliczne jest łatwo usunąć; w dużych reaktorach
(> 10 000dm³), w których zachodzi szybki wzrost mikroorganizmów, konieczne jest zaprojektowanie efektywnego systemu wymiany ciepła (jego odprowadzania). Temperatura zawartości bioreaktora musi być utrzymywana z dokładnością do 0,5ºC dla zapewnienia fizjologicznych warunków wzrostu.

W warunkach wzrostu, gdy powstaje praktycznie wyłącznie biomasa, a ilość powstającego produktu jest znikoma, reakcję można zapisać równaniem:

C₆H₁₂O₆ + a NH₃ + b O₂ → c CH_1,8O_0,5N_0,2 + e CO₂ + f H₂O

Ponieważ zużycie azotu w porównaniu ze zużyciem węgla jest niewielkie, a ponadto azot nie ulega utlenieniu tak, jak węgiel, równanie uprości się do postaci:

C₆H₁₂O₆ + b O₂ → c CH_1,8O_0,5N_0,2 + e CO₂ + f H₂O

Bilans cieplny ten reakcji będzie następujący (w przeliczeniu na mole zużywanej glukozy):

Q_{(uwalniane ciepło)} = c [(M.cz._X) ∙ (-ΔH_X)] - [(-ΔH_S) ∙ (M.cz._S)]

gdzie (-ΔH_X) i (-ΔH_S) to ciepło spalania 1g biomasy lub substratu.

Q/M.cz._S = c ∙ M.cz._X/M.cz._S ∙ (-ΔH_X) - (-ΔH_S)

Wyrażenie po lewej stronie równania jest ilością ciepła uwalnianego w przeliczeniu na 1g zużywanego substratu. Natomiast stosunek przyrostu biomasy na jednostkę zużywanego substratu (pierwszy człon wyrażenia po prawej stronie równania) jest wydajnością biomasy z substratu.

Równanie przyjmie postać:

Y_Δ/S = (Y_X/S)(-ΔH_X) - (-ΔH_S)

Po podzieleniu równania przez Y_X/S:

Y_Δ/X = (-ΔH_X) - (-ΔH_S)/(Y_X/S)

Podane równania są przydatne do oznaczenia ciepła związanego ze wzrostem biomasy oraz ze zużywanym substratem. Dane eksperymentalne z szeregu doświadczeń wykazują liniową zależność pomiędzy ilością uwalnianego ciepła i ilością zużywanego tlenu.

Ciepło spalania biomasy (przykłady):

	(-ΔHS), kJ/g
Escherichia coli	23,03
Candida lipolytica	21,34
Candida boidinii	20,14
Kluyveromyces fragilis	21,66
Bacillus thuringiensis	22,08

WYKŁAD 7, 29/03/2012

Ustalona doświadczalnie zależność ilości uwalnianego ciepła od ilości zużytego tlenu wynosi (na 1 mol tlenu):

Y_Δ/O2 = 16,21 kJ/g O₂

Zależność ta pozwala wyliczyć ilości generowanego ciepła na podstawie ilości zużytego tlenu. W przypadku, gdy oprócz biomasy powstaje dodatkowy produkt, równanie ulegnie modyfikacji:

Q_{(uwalniane ciepło)} = c [(M.cz._X) ∙ (-ΔH_X)] + d [(M.cz._P) · (-ΔH_P)] - [(-ΔH_S) ∙ (M.cz._S)]

gdzie (-ΔH_P) to ciepło spalania 1 g produktu.

Dzieląc równanie stronami przez M.cz._S otrzymamy:

Y_Δ/S = (Y_X/S)(-ΔH_X) + (Y_P/S)(-ΔH_P) - (-ΔH_S)

Dzieląc z kolei przez Y_S/X, otrzymamy:

Y_Δ/X = - (ΔH_X) + (Y_P/X)( -ΔH_P) - (-ΔH_S)/( Y_S/X)

Y_Δ/S - wydajność cieplna z substratu

Y_Δ/X - wydajność cieplna z biomasy

Generowanie ciepła reakcji - przykłady obliczeń

Wartości ciepła reakcji można wyliczyć z dobrym przybliżeniem, znając:

• stechiometrię reakcji

• wydajność procesu

• ciepło spalania biomasy i substratu

Przykład

Należy obliczyć ciepło reakcji hodowli drożdży na glukozie, jako źródle węgla. Równanie reakcji:

7 CH₂O + 2,33 O₂ → C₄H_6,67O₂ + 3 CO₂ + 3,66 H₂O

M.cz._X = 86,67 g/mol

-ΔH_X = 1,52·10³ kJ/100 g

-ΔH_S = 2,82·10³ kJ/mol

Zużycie glukozy na węglomol drożdży wynosi:

7 · 30 g = 210 g/c-mol glukozy,

co stanowi:

(210 g)/(180 g) = 1,167 mola glukozy/c-mol drożdży

Wydajność produkcji biomasy:

Y_X/S = (ΔX)/(ΔS) = (86,67 g)/(210 g) = 0,41

Zatem masa wyprodukowanych komórek drożdży wynosi:

0,41 · 210 g = 86,1 g

Efekt cieplny obliczamy z zależności:

ΔH_reakcji = 2,82·10³ kJ/mol · (7 M_CH2O)/(M_C6H12O6) - 1,52·10³ kJ/mol · (86,1 g/100 g) =

= 1,98·10³ kJ/210 g glukozy = 1,98·10³ kJ/86,1 g komórek =

= 0,23·10² kJ/g komórek

Jeśli skład substratu jest nieznany, to do obliczania efektu cieplnego reakcji można się posłużyć znajomością stopnia redukcji oraz, wspomnianymi już, prostymi regułami:

Q_O = 112,97 kJ/mol (równowartość energetyczna 1 mola elektronów przekazanych na O₂)

γ_X = 4,29 (w przeliczeniu na gramoatom węgla w biomasie)

σ_X = 0,462 g C/g suchej masy

Przykład

Ze 100 moli glukozy w obecności tlenu i amoniaku otrzymano 2000 g lizyny i 4000 g biomasy. Oblicz efekt cieplny reakcji, wiedząc, że stopień redukcji glukozy wynosi w tym wypadku:

100 · 24 = 2400

Oblicz, jaka część ze stopnia redukcji została przekazana do produktu.

ilość moli lizyny: n_P = 2000/182,65 = 10,96 mola Lys

γ_P = 24+14-4-6+1-1 = 28

n_P · γ_P = 306,88 moli (część elektronów przekazana do produktu)

Oblicz, jaka część ze stopnia redukcji została przekazana do biomasy.

n_X · γ_X = (4000 g · σ_X · γ_X)/12 = 660,7 moli

W rezultacie, stopień redukcji zużyty na efekt cieplny X_Q obliczamy z bilansu:

2400 = X_Q + n_P · γ_P + n_X · γ_X

X_Q = 1432,42 moli

Pozwala to obliczyć efekt cieplny reakcji:

Q = 112,97 kJ/mol · 1432,42 moli = 161820,5 kJ

Kinetyka wzrostu mikroorganizmów

Z punktu widzenia praktyki - podstawowe znaczenie ma obliczenie:

• szybkości namnażania się biomasy drobnoustrojów

• szybkości asymilacji składników odżywczych

• szybkości wydzielania produktów metabolizmu

W obliczeniu tych parametrów korzystamy z bilansów procesów biochemicznych oraz równań kinetycznych opisujących przyrost biomasy. We wszystkich ujęciach kinetycznych rzeczywiste, złożone procesy życiowe komórek oraz rozmnażanie mikroorganizmów ujmowane są w uproszczeniu i generalnie sprowadzają się do przyrostu biomasy.

Biomasa - ogólnie substancje organiczne komórek mikroorganizmów, roślin lub zwierząt. W przypadku inżynierii bioprocesowej termin ten odnosi się najczęściej do masy mikroorganizmów.

Zastosowanie biomasy - jako źródło białka (w postaci paszy lub jako surowiec dla przemysłu spożywczego). Biomasa często określana jest jako „białko jednokomórkowców” - SCP. Początki takiego zastosowania - okres I wojny światowej, lata 30 XX wieku, okres II wojny światowej.

Obecnie przyczyną dużego zainteresowania SCP jest światowy deficyt białka. Na jego pokrycie nie wystarcza już źródeł tradycyjnych (mączka rybna, sojowa). Uruchomienie produkcji SCP dla celów paszowych pozwala na zmniejszenie uzależnienia hodowli zwierząt od importu pasz.

Zalety przemysłu produkcji białek:

• szybszy przyrost biomasy mikroorganizmów w porównaniu z roślinami i zwierzętami

• wyższa zawartość białka w suchej masie biomasy

• szeroki wachlarz utylizowanych surowców, najczęściej odpadowych

• wysoka wydajność, niewielka przestrzeń zajmowana przez instalacje produkcyjne

• niezależność od zmian pogody, klimatu i sezonowości

• możliwość wzbogacania produktu żywnościowego w niezbędne składniki, np. aminokwasy egzogenne (Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Met, Thr), które występują w niedomiarze w produktach roślinnych

• biomasa jest nie tylko źródłem białka, lecz także związków biologicznie czynnych, np. witamin

Porównanie szybkości przyrostu biomasy różnych organizmów:

ORGANIZM	Czas podwojenia biomasy
Bakterie	1 - 7 godzin
Glony	6 - 50 godzin
Trawy	1 - 2 tygodnie
Kura	3 - 4 tygodnie
świnia	4 - 6 tygodni

Zawartość białek w różnych produktach naturalnych:

SUROWIEC	ZAWARTOŚĆ BIAŁKA
Grzyby mikroskopowe	31 - 50%
Mikroalgi	47 - 63%
Drożdże	47 - 53%
Bakterie	72 - 78%
Mleko	22 - 25%
Wołowina	81 - 90%
Jaja	31 - 38%
Ryż	8 - 9%

Surowce do produkcji biomasy:

SUROWIEC	ŹRÓDŁO
C-1 metan	Gaz naturalny, węgiel kamienny, gazyfikacja drewna, proces dygestii
C-1 metanol	Gaz syntezowy
C-2 etanol, kwas octowy	Fermentacja alkoholowa, etylen

Modele wzrostu mikroorganizmów

Wyróżnia się następujące grupy modeli:

• model wzrostu ustalonego oraz model wzrostu nieustalonego; podział ten wynika z uwzględnieniem lub nie warunków ustalonych w przemianach metabolicznych; najczęściej przyjmuje się założenia o ustalonych warunkach wzrostu

• modele ciągłe lub korpuskularne; kryterium podziału jest w tym wypadku uwzględnienie lub nie „ziarnistej struktury biomasy”, tzn. występowanie wydzielania żywych komórek; w ujęciu ciągłym zamiast populacji mikroorganizmów rozpatruje się pewną jednorodność (homogenność), „biofazę”, co pozwala na uniknięcie opisu zjawisk związanych z istnieniem indywidualnych mikroorganizmów

• model strukturalny i niestrukturalny; w tym podziale rozpatrywany jest sposób ujęcia przemian metabolicznych; w modelu niestrukturalnym mikroorganizmy reprezentowane są jednym parametrem - biomasą; wzrost jest rozpatrywany jako przemiana substratu bezpośrednio w biomasę

Najpowszechniej używa się modelu najprostszego - niestrukturalnych, ciągłych modeli wzrostu ustalonego.

Drożdże Saccharomyces cerevisiae:

• dobrze poznany genom

• dobrze zaprojektowane metody genetyczne

• model dla innych eukariontów

• nie produkuje toksyn; organizm GRAS

• około 6000 genów

• zdolność do wydzielania białek

• możliwość modyfikacji potranslacyjnych

Wzrost wykładniczy mikroorganizmów

X - liczba komórek

n - liczba podziałów komórkowych

X = 2ⁿ

dX/dt = αX = μX

α - współczynnik proporcjonalności

μ - szybkość właściwa wzrostu

Można wyznaczyć stosunek stężenia biomasy do czasu poprzez scałkowanie równania w przedziale czasu od t₀ do t₁

1/X dX = μ dt

Jeśli w czasie t₀ stężenie biomasy w reaktorze wyrazimy jako X₀, a w czasie t₁ stężenie biomasy wyrazimy jako X₁, to równanie przyjmie postać:

∫ 1/X dX = μ ∫ dt

Całkując obie strony otrzymujemy:

lnX₁ - lnX₀ = μ (t₁ - t₀)

ln(X₁/X₀) = μ (t₁ - t₀)

Zatem stężenie biomasy po określonym czasie hodowli opisuje równanie:

X₁ = X₀· e^μ(t1-t0)

Czas podwojenia (okres generacji) a szybkość właściwa wzrostu

Czas podwojenia (t_d, t_g, τ_d) jest wyrażeniem stosowanym powszechnie przez mikrobiologów do opisu szybkości wzrostu komórek. Jest to czas potrzebny do podwojenia się liczby komórek; w fazie wykładniczej jest to wartość w przybliżeniu stała. Stosunek między szybkością właściwą wzrostu (μ) i czasem podwojenia (t_d) jest następujący:

X₁ → 2X₁ w czasie t_d = t₂ - t₁

t_d = ln2/μ

Przykład

X₀ = 2 g/dm³

X₁ = 15,96 g/dm³

t = 90 min

μ = (lnX₁ - lnX₀)/Δt

μ = 0,023/min = 1,3847/h

t_d = ln2/μ = 0,69/1,38 = 0,5 h

Zgodnie z modelem wzrostu wykładniczego biomasa będzie ciągle rosła. W rzeczywistości, dostępność pokarmu nie jest nieograniczona i w chwili, gdy następuje jego ograniczenie, szybkość wzrostu komórek obniży się lub nawet wzrost ustanie. Powstające produkty metabolizmu również mogą hamować wzrost. Wzrost wykładniczy nie będzie miał miejsca także w przypadku niedoboru tlenu lub w przypadku nieodpowiedniego mieszania. W tych przypadkach wzrost będzie bardziej ograniczony wymianą mas niż limitowany kinetyką. Ograniczenia w wymianie mas są głównym czynnikiem limitującym wzrost mikroorganizmów w dużych bioreaktorach.

Nie-wykładniczy wzrost ma miejsce również w przypadku, gdy podziały komórkowe nie zachodzą ze stałą szybkością. Takie zjawisko jest powszechne w przypadku grzybów pleśniowych, organizmów wielokomórkowych, niektórych organizmów rozmnażających się przez pączkowanie oraz wielu typów komórek zwierzęcych.

Powszechnie popełnianych błędem przy analizie procesów fermentacyjnych jest przyjęcie zależności logarytmicznych, podczas gdy nie występują one w rzeczywistości.

Przemiana podstawowa

SUBSTRAT → WZROST BIOMASY + PODTRZYMYWANIE FUNKCJI ŻYCIOWYCH

Podtrzymywanie funkcji życiowych
MODEL HERBERTA	MODEL PIRTA
Na przemiany podstawowe zużywana jest część biomasy	Na przemiany podstawowe zużywana jest część substratu
re = μe · CX	re = ms · CS
μe - właściwa szybkość przemian egzogennych	ms - współczynnik przemian podstawowych
rX = YX/S · rS - μe · CX	rS = (1/YX/S) · rX + ms · CS

r_e - szybkość przemiany podstawowej

r_S - szybkość asymilacji substratu

WYKŁAD 8, 5/04/2012

Wzrost komórek/przyrost biomasy:

• pojęcie przemiany podstawowej

• modele Herberta i Pirta

• model Herberta - część biomasy jest zużywana na przemianę podstawową (utrzymanie metabolizmu endogennego); szybkość takiego zużywania biomasy w procesie endogennym jest proporcjonalna do stężenia biomasy

Ponieważ dla opisu procesów zachodzących w bioreaktorze podstawową miarą jest określenie przyrostu biomasy; w tym celu istotny jest opis wzrostu pojedynczych komórek. Analiza taka ma na celu sprawdzenie:

• czy nie występują ograniczenia wzrostu

• czy nie można przewidzieć ogólnego charakteru zależności dla wzrostu populacji mikrobów

Zakładamy, że szybkość asymilacji substratu jest zależna od:

• stężenia tego substratu

• powierzchni komórki

• substratem limitującym jest źródło węgla; należy uwzględnić zużycie części substratu na przemianę podstawową.

dm_K/dt = a_KJ_S - μ_em_K

m_K - masa komórki

a_K - powierzchnia właściwa komórki

J_S - strumień asymilowanego substratu

μ_e - właściwa szybkość metabolizmu endogennego

Zależność pomiędzy masą a powierzchnią komórki wynika z kształtu komórki i sposobu jej wzrostu. W praktyce wyróżniamy dwa przypadki: komórki kuliste i komórki pałeczkowate (walcowate).

Komórki pałeczkowate - średnica jest stała, wzrost następuje przez wydłużanie się powierzchni (a_K). Dla stałego strumienia asymilowanego substratu, właściwa szybkość wzrostu (μ) jest stała w warunkach ustalonych. Nie będą występowały ograniczenia wzrostu pojedynczych komórek, ale też np. grzybni.

μ = 4J_S/d_Xρ_X - μ_e

Komórki kuliste - wzrost poprzez powiększanie średnicy. Właściwa szybkość wzrostu wynosi w tym przypadku:

μ = J_S [(4Π)^1/3 · (3/ρ_X)^2/3] m_K^-1/3 - μ_e

Dla komórek kulistych właściwa szybkość wzrostu maleje wraz ze wzrostem średnicy, graniczną szybkość wzrostu określa równanie:

m_K,gr = (36 · Π · J_S³)/(ρ_X · μ_e³)

co oznacza taką wielkość, dla której strumień substratu asymilowanego przez jej powierzchnię jest zużywany wyłącznie na przemianę podstawową (geometryczne ograniczenie wzrostu).

Czynniki wpływające na wydajność wzrostu mikroorganizmów:

• temperatura

• pH

• dostępność substratu (źródło węgla i azotu)

• zapotrzebowanie na tlen i jego dostarczanie

• szybkość mieszania zawiesiny komórek

• sposób mieszania

Model Monoda - niestrukturalny, ciągły model ustalonego wzrostu w fazie wzrostu wykładniczego.

μ = (μ_max · S)/(K_S + S)

K_S - stała nasycenia (mg/dm³)

μ_max - maksymalna właściwa szybkość wzrostu

Podobieństwa między równaniem Monoda i równaniem Michaelisa-Menten dotyczą kształtu krzywej, postaci funkcji i sposobu wyznaczania parametrów.

Hodowla okresowa

• system zamknięty, dobrze mieszany, o stałej objętości

• dostępność substratu jest czynnikiem limitującym

• wzrost pod koniec fermentacji

• po wejściu komórek w fazę stacjonarną wzrostu należy pamiętać, że także inhibicja przez powstający produkt końcowy prowadzi do zahamowania wzrostu

• w typowych warunkach w fazie logarytmicznej stężenie substratu limitującego jest znacznie wyższe niż K_S

Wyznaczanie K_S

• w hodowlach okresowych jest trudne i obarczone błędem, zwłaszcza, jeśli stosuje się metody bezpośrednie

• teoretycznie lepiej zastosować metodę wyznaczania K_S podobną do wyznaczania wartości K_m (Lineweavera-Burka, Eadie-Hofstee); metody te dają również wynik obciążony błędem w przypadku hodowli okresowych

• wiarygodne wyniki uzyskuje się w przypadku hodowli ciągłych (w chemostacie).

Model Monoda - może służyć do opisu (z pewnym przybliżeniem) większości procesów zachodzących w hodowlach komórkowych. Model ten może być łatwo zmodyfikowany celem opisu bardziej złożonych zjawisk, m.in. do opisu inhibicji (przez produkt końcowy lub nawet przez powstającą biomasę). Należy pamiętać, że szereg substratów w wyższych stężeniach może być toksyczny dla mikrobów (metanol, fenol, aminy).

WYKŁAD 9, 12/04/2012

Równanie Andrewsa:

Równanie Levenspiela:

Pod K_I można podstawić S (jeśli substrat hamuje wzrost biomasy) lub X (jeśli biomasa hamuje wzrost biomasy).

Równanie Monoda:

Istnieją mikroorganizmy, których zapotrzebowanie na substrat jest niskie (rosną lepiej przy niskim stężeniu substratu w pożywce) oraz mikroorganizmy, których zapotrzebowanie na substrat jest wysokie.

Z powodów ekonomicznych dąży się do zwiększenia współczynnika wydajności fermentacji, gdyż prowadzi to do obniżenia zużycia surowców przy zwiększeniu ilości produktów, lecz:

• nie zawsze prowadzi to do zwiększenia zysków

• nie zawsze prowadzi to do zwiększenia produktywności (szybkości tworzenia danego produktu)

W dużych fermentatorach, podczas procesów aerobowych, tlen jest czynnikiem limitującym wzrost. Zwiększenie napowietrzania może zwiększyć współczynnik wydajności. W pewnych sytuacjach zwiększenie napowietrzenia powoduje znaczny wzrost zużycia mocy i wzrost kosztów może przeważać nad zyskami.

Jeśli w zmodyfikowanym procesie zwiększono współczynnik wydajności, lecz szybkość powstawania produktów obniżyła się (wydłużył się czas), produktywność obniżyła się.

Jedynie w wypadku, gdy zwiększeniu współczynnika wydajności Y_X/S lub Y_P/S towarzyszy zwiększenie szybkości tworzenia produktu - całkowita produktywność będzie większa.

Rodzaje współczynników wydajności

W procesach fermentacyjnych używa się zasadniczo dwóch podstawowych współczynników wydajności: Y_X/S i Y_P/S (biomasy z substratu i produktu z substratu).

Współczynnik wydajności biomasy jest stosunkiem średniej masy biomasy do masy wykorzystanego substratu. W hodowli okresowej Y_X/S oblicza się z wyrażenia:

Y_X/S = ΔX/ΔS

Analogicznie wyznacza się współczynnik wydajności produktu Y_P/S:

Y_P/S = ΔP/ΔS

Niekiedy wydajność produktu podaje się w stosunku do biomasy:

Y_P/X = ΔP/ΔX

Ten sposób jest przydatny do oceny ilościowej produkcji wtórnych metabolitów.

Proste matematyczne modele procesów fermentacji

Poznaliśmy już model opisujący tworzenie biomasy równaniem:

dX/dt = (μ_max · S)/(K_S + S) · X

Aby model opisywał cały proces fermentacyjny należy w równaniach uwzględnić wykorzystanie substratu i tworzenie produktu.

Przy założeniu, że powstawanie produktu i biomasy jest bezpośrednio powiązane z wykorzystaniem substratu (jego ubytkiem) poprzez współczynniki wydajności, można napisać:

dX/dt = -Y_X/S · dS/dt

dP/dt = -Y_P/S · dS/dt

Cały proces fermentacyjny/wzrost mikroorganizmów można opisać trzema równaniami:

dX/dt = (μ_max · S)/(K_S + S) · X

dS/dt = -1/Y_X/S · (μ_max · S)/(K_S + S) · X

dP/dt = Y_P/S/Y_X/S · (μ_max · S)/(K_S + S) · X

Ostatnie równanie jest prawdziwe tylko wtedy, gdy przyrost produktu jest proporcjonalny do przyrostu biomasy, czyli przyrost produktu jest powiązany ze wzrostem. W procesie fermentacji często taka zależności nie występuje.

Opisane równania rozwiązuje się zasadniczo metodami numerycznymi, rozwiązując równania różniczkowe.

Znajomość stałych pozwala na wyznaczenie znormalizowanej kinetyki τ(S). Zmienność X, S i P jest opisana układem następujących równań różniczkowych.

τ(S) = S/(K_S + S)

dX/dt = μ_max · τ(S) · X

dS/dt = -1/Y_X/S · μ_max · τ(S) · X

dP/dt = Y_P/S · μ_max · τ(S) · X

W oparciu o model kinetyczny można uzyskać ważną informację - mianowicie określić długość czasu fermentacji (informacji takiej nie uzyska się w oparciu o wyznaczenie współczynnika wydajności). Dzięki temu możliwe jest obliczenie ilości cykli produkcyjnych na jednostkę czasu, a tym samym oszacowanie zysków.

Zalety i wady hodowli okresowych:

• proste, dobrze przetestowane rozwiązania

• łatwość prowadzenia procesu

• względna łatwość zapobiegania zakażeniom

• cykl wzrostu jest mało wydajny (faza zwłoki - lag)

• jeśli pożądany produkt powstaje tylko w określonej fazie wzrostu, pozostałe fazy powodują stratę czasu

• wymagane jest przygotowanie stosunkowo dużej ilości materiału do zaszczepienia (inokulum)

• konieczność mycia i sterylizacji bioreaktora i urządzeń towarzyszących po każdym cyklu produkcyjnym (szarży)

Hodowle ciągłe - chemostat Monoda

Reaktory do hodowli ciągłych na dużą skalę mają największe zastosowanie w oczyszczaniu ścieków:

• nie ma konieczności stosowania czystych kultur, nie ma więc zagrożenia zakażeniem

• wieloletnia praktyka wykazała, że stosowanie takich oczyszczalni nie stwarza zagrożenia dla ludzi ani środowiska

• z ekonomicznego punktu widzenia, biorąc pod uwagę wielkie objętości utylizowanych ścieków jest to jedyne sensowne rozwiązanie

Poza oczyszczaniem ścieków, reaktory do hodowli ciągłych na bardzo dużą skalę są używane do produkcji białka jednokomórkowców (SCP) do celów paszowych. Przykładem może być wielki bioreaktor koncernu ICI (USA) o objętości 1 000 000 dm³, w którym metanol przekształcany jest przez Methylophilus methylotropus w biomasę.

Charakterystyczne parametry:

• szybkość rozcieńczania (D)

• czas przebywania (τ)

D = (szybkość przepływu, dm³/h) / (objętość reaktora, dm³) = F/V (h^-1)

τ = (objętość reaktora, dm³) / (szybkość przepływu, dm³/h) = V/F (h)

Szybkość przepływu:

• objętościowa

F = V/t

• masowa (szybkość przepływu masy)

m = (ρ · F)/t

Produkcja biomasy oraz produktu reakcji:

• tworzenie tych składników

• usuwanie tych składników

dX/dt = μX - DX

dP/dt = Y_P/S/Y_X/S · μX - DP

Wyrażenia określające akumulację substratu zawierają trzy składniki:

• wykorzystanie substratu przez mikroorganizmy

• dopływ substratu (zasilanie)

• usuwanie substratu w odpływie

dS/dt = -1/Y_X/S · μX + DS₀ - DS

Model matematyczny chemostatu:

• dla biomasy:

dX/dt = [(μ_max · S)/(K_S + S)] · X - DX

• dla substratu limitującego:

dS/dt = -1/Y_X/S · [(μ_max · S)/(K_S + S)] · X + D(S₀ - S)

• dla produktu:

dP/dt = Y_P/X · [(μ_max · S)/(K_S + S)] · X - DP

WYKŁAD 10, 19/04/2012

W stanie równowagi:

dX/dt = 0

dS/dt = 0

dP/dt = 0

Zatem:

μX = DX → μ = D

W chemostacie, w stanie równowagi, szybkość właściwa wzrostu może być kontrolowana przez szybkość rozcieńczania.

Relacje pomiaru szybkości rozcieńczania (D) i stężenia substratu (S): jeżeli μ = D, równanie Monoda przyjmie postać:

S = (DK_S)/(μ_max - D)

Stan równowagi w chemostacie a stężenie biomasy:

dS/dt = -1/Y_X/S · μX + D(S₀ - S) = 0

X = Y_X/S (S₀ - S)

X = Y_X/S [S₀ - (DK_S)/(μ_max - D)]

Stan równowagi w chemostacie a stężenie produktu:

dP/dt = 0 = Y_P/X · μX - DP

P = Y_P/S (S₀ - S)

P = Y_P/S [S₀ - (DK_S)/(μ_max - D)]

Wszystkie przedstawione równania stosuje się tylko do sytuacji, gdy powstawanie produktu powiązane jest ze wzrostem.

Powstawanie produktu jest związane ze wzrostem

Powstawanie produktu nie jest związane ze wzrostem

Wpływ szybkości rozcieńczania:

• wymywanie komórek mikroorganizmów

dX/dt = μX - DX

μX - przyrost biomasy

DX - ubytek biomasy

Równanie równowagowe mas biomasy posiada dwa składniki:

• składnik tworzenia (wzrostu) biomasy: μX

• składnik usuwania biomasy: DX

Jeżeli szybkość usuwania biomasy przewyższa szybkość jej powstawania (D>μ):

Przy zwiększaniu szybkości rozcieńczania (D) wzrost biomasy spada, przez co wykorzystywane jest mniej substratu (będzie go więcej w reaktorze). Jeżeli D>μ, nastąpi wymycie mikroorganizmów. Hodowle ciągłe rozpatrywane były w stanie osiągniętej równowagi dynamicznej, w której D = μ.

Komórki nie mogą rosnąć szybciej niż wynosi ich maksymalna szybkość wzrostu (lub nie może być ona określana jako maksymalna). Rozważając równanie dla chemostatu, nie można mieć ani nieograniczonego, ani ujemnego stężenia substratu.

μ_max - D ≠ 0 ^ μ_max - D > 0

Gdy szybkość rozcieńczania jest wyższa niż szybkość właściwa wzrostu, stężenie biomasy w reaktorze będzie spadać, aż do całkowitego wymycia mikroorganizmów. Szybkość rozcieńczania, przy której następuje wymywanie mikroorganizmów określamy jako szybkość krytyczną rozcieńczania (D_kryt), równą μ_max.

WNIOSKI:

1. Szybkość rozcieńczania w chemostacie musi być mniejsza od krytycznej wartości rozcieńczania (D < D_kryt).

2. Równania stosowane do obliczenia stężeń w stanie równowagi dynamicznej nie mają zastosowania w przypadku warunków wymywania.

3. W przypadku wymywania komórek z bioreaktora, zmienne przyjmą wartości:

S = S₀ X = 0 P=0

Produktywność w hodowlach ciągłych

Produktywność definiowana jest jako ilość wytworzonego danego składnika na jednostkę czasu. W przypadku reaktora przepływowego, produktywność (Pr) będzie równa szybkości przepływu masy składnika.

Dla biomasy:

Pr_X = m_X = F · X

Dla produktu:

Pr_P = m_P = F · P

W oparciu o model Monoda, produktywność tworzenia biomasy można wyliczyć z równania:

Pr_X = FY_X/S [S₀ - (DK_S)/(μ_max - D)]

Wybór optymalnej szybkości rozcieńczania

Jeśli wydajność produkcji biomasy jest stała przy różnych szybkościach rozcieńczenia, to produktywność (Pr) biomasy będzie rosła wraz ze zwiększaniem szybkości rozcieńczania aż do osiągnięcia wartości D_kryt, to jest aż do momentu wymycia mikroorganizmów.

W rzeczywistości ani wydajność produkcji biomasy, ani produktu nie jest stała. Stwierdzono ponadto, że często wydajność tworzenia szeregu ważnych komercyjnie produktów jest największa wtedy, gdy wzrost jest najwolniejszy. Zatem stosowanie wysokim wartości szybkości rozcieńczania nie zawsze jest najkorzystniejszą opcją dla tworzenia produktu (często jest to opcja najmniej korzystna). Należy również wziąć pod uwagę, że zwiększenie szybkości rozcieńczania (D) prowadzi do zwiększenia stężenia substratu w wypływie.

Zależność produktywności od szybkości rozcieńczania w hodowlach ciągłych:

Równania modelu Monoda można przekształcić tak, aby otrzymać współczynniki wydajności. Wyznaczanie stałych kinetycznych dla modelu Monoda (transformacja Lineweavera-Burka dla modelu Monoda):

Szybkość rozcieńczania, dla której produktywność wynosi swoją maksymalną wartość, nazywamy D_max. D_max można obliczyć ze wzoru:

Przy D_max (lub D_m) następuje częściowa utrata substratu. D_max jest bardzo blisko D_kryt.

Współzawodnictwo mikroorganizmów w chemostacie

Jeśli dwa mikroorganizmy współzawodniczą o ten sam substrat limitujący wzrost w chemostacie, przeżyje ten, mikroorganizm, który będzie utrzymywał niższe stężenie substratu w mieszaninie fermentacyjnej.

Jest tak, ponieważ w reaktorze nie może być dwóch różnych stężeń tego samego substratu. W przypadku współzawodnictwa dwóch mikroorganizmów utrzymywane jest niższe stężenie substratu (tzn. wygrywa ten mikroorganizm utrzymujący to niższe stężenie). Można obliczyć właściwą szybkość wzrostu obu mikroorganizmów przy niższym stężeniu substratu.

WYKŁAD 11 → nie mam, bardzo mi przykro…

WYKŁAD 12, 10/05/2012

METABOLIZM
PIERWOTNY	WTÓRNY
TROPOFAZA podczas zrównoważonego wzrostu (w sytuacji nadmiaru pożywienia)	IDIOFAZA przy braku dostatecznej ilości pożywienia

Metabolity wytwarzane podczas idiofazy z acetylo-CoA:

• cytrynian

• kwasy tłuszczowe

• chinony

• terpeny

• poliketydy (makrolidy)

• sterole (steroidy) i inne

Kolorem czarnym zaznaczona biomasa, kolorem czerwonym - metabolit pierwotny, zaś kolorem zielonym metabolit wtórny.

Tworzenie biomasy i produktu - zależności metaboliczne:

• wytwarzanie energii w postaci ATP

• wytwarzanie materiału budulcowego

Produkcja biomasy jest efektem skierowania części ATP do syntezy materiału komórkowego. ATP jest również niezbędny do zapewnienia innych funkcji: homeostazy i ruchu.

Homeostaza jest utrzymywaniem wewnątrzkomórkowej integralności. Obejmuje m.in. aktywny transport na zewnątrz komórki końcowych produktów metabolizmu, jonów wodoru, toksycznych składników.

Przełączanie szlaków katabolicznych organizmu powoduje również zmiany wydajności produkcji biomasy. Szereg organizmów (komórek) ma zdolność fermentacji (proces beztlenowy), jak i potrafi oddychać (proces tlenowy):

• fermentacja (glikoliza beztlenowa):

GLUKOZA → 2 ATP

• oddychanie (glikoliza, cykl kwasów trójkarboksylowych, łańcuch oddechowy):

GLUKOZA → CO₂ + H₂O + 30-38 ATP

Z równań tych wynika, że fermentacja prowadzi do niższej wydajności produkcji biomasy, niż oddychanie.

Dwa główne czynniki mogą wymuszać na fakultatywnych beztlenowcach fermentację:

• ograniczony dostęp tlenu (efekt Pasteura)

• wysokie stężenie rzeczywiście degradowanych substratów (efekt Crabtree lub efekt glukozy)

W warunkach braku tlenu lub innych związków nieorganicznych podlegających redukcji, fakultatywne beztlenowce przełączają się na fermentację.

Z porównania schematów fermentacji i oddychania widać, że odtwarzanie NAD⁺ w przypadku fermentacji jest prostsze i szybsze niż w przypadku oddychania. Zdolność przełączania się z oddychania na fermentację daje przewagę fakultatywnym beztlenowcom nad bezwzględnymi tlenowcami w kulturach mieszanych, np. w ekosystemach.

Efekt Crabtree:

• wiele bakterii prowadzących procesy beztlenowe podlega temu efektowi bardzo wyraźnie

• przy wysokim stężeniu substratu organizmy te produkują mleczan z dużą wydajnością; bakterie fermentacji homomleczanowej przekształcają glukozę w mleczan prawie stechiometrycznie w warunkach glikolizy beztlenowej

• pierwszorzędnym celem komórek jest wykorzystanie substratu możliwie jak najszybciej; jeżeli komórka oddycha, szybkość utlenienia NADH może być niższa niż aktualnie potrzebna - następują wówczas zaburzenia szlaku glikolizy, zaczynają gromadzić się metabolity, zwłaszcza fruktozo-1,6-bisfosforan i pirogronian

• metabolity te są równocześnie aktywatorami kluczowych enzymów uczestniczących w glikolizie beztlenowej, jak również inhibitorami enzymów odpowiadających za przekształcenie pirogronianu w acetylo-CoA (inhibitory kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej)

Metabolity wtórne:

• szereg enzymów (najczęściej rekombinowanych)

• przeciwciała monoklonalne

• pigmenty

• toksyny

• alkaloidy

• antybiotyki (wiele spośród nich produkowanych jest tylko w fazie stacjonarnego wzrostu)

Końcowe produkty fermentacji - mleczan, etanol, cytrynian, octan.

Rozprzężenia metaboliczne

Nagromadzenie się końcowych produktów metabolizmu prowadzi do tzw. rozprzężenia metabolizmu. Zwiększa się gradient stężeń i komórka jest zmuszona do usuwania produktów metabolizmu na zewnątrz. W tej sytuacji znacznie więcej ATP jest potrzebne do utrzymania homeostazy - tym samym mniej może być zużyte do syntez. W tym czasie komórka będzie produkowała więcej końcowych metabolitów w procesie syntezy ATP. Na koniec produkcja biomasy ustanie całkowicie, a będą powstawać tylko końcowe metabolity.

Przenoszenie masy - wpływ na wzrost

Dotychczasowe rozważania dotyczące wzrostu mikroorganizmów w różnych systemach fermentacyjnych (hodowle okresowe, półokresowe, ciągłe) charakteryzowały się szeregiem uproszczeń. Generalnie założono, że:

• szybkość wzrostu komórek w reaktorze jest zależna od charakterystyki kinetycznej

• wymieszanie jest idealne (zakłada się, że w takim modelu chemostatu skład odpływu jest identyczny, jak skład zawartości reaktora; składniki w dopływie, wchodzące do reaktora są natychmiast równomiernie rozpraszane w całej objętości cieczy w reaktorze)

• wszystkie składniki są roztworami wodnymi

Przedstawione uproszczenia pomijają jeden ważny fakt - przenoszenie masy pomiędzy oraz wewnątrz faz nie jest natychmiastowe!!! W praktyce wykazano wielokrotnie, że:

• kinetyka charakteryzująca biokatalizator nie zawsze jest czynnikiem ograniczającym całkowitą szybkość reakcji

• mieszanie nie zawsze jest bliskie wymieszaniu idealnemu, jak również substrat lub biokatalizator nie zawsze są w postaci wodnej

• transfer cząsteczek zachodzi pomiędzy różnymi fazami

Dobrym przykładem jest transfer tlenu. Tlen atmosferyczny jest dostarczany w postaci gazowej - w pęcherzykach powietrza. Gazowy tlen musi zostać przetransportowany do fazy ciekłej, w której ulega rozpuszczeniu - i tylko w takiej postaci jest dostarczany do komórek.

Całkowita szybkość reakcji jest często determinowana nie przez kinetykę katalizy, lecz przez szybkość przenoszenia mas. W każdej reakcji musi występować ruch mas - jeśli ruch ten będzie wolny, to i szybkość reakcji będzie niska. Każda reakcja katalizowana obejmuje:

• etap przenoszenia mas

• etap katalizy

Etap przenoszenia mas może być wolny, jeśli ruch cząsteczek katalizatora/substratu jest ograniczony lub jeśli stężenie katalizatora/substratu jest niskie. Etap katalizy zależy w dużym stopniu od czynników środowiska: temperatury, pH i innych.

Rozważając oba etapy:

• jeśli szybkość przenoszenia mas jest tak niska, że ogranicza szybkość całkowitą reakcji - mówimy, że reakcja jest ograniczana przenoszeniem mas

• jeśli szybkość przenoszenia mas jest wyższa od szybkości katalizy - reakcja jest ograniczana katalitycznie

Przenoszenie mas w roztworach

Bez mieszania wymuszonego ruch rozpuszczonych związków w roztworze zachodzi dzięki spontanicznej dyfuzji lub naturalnej konwekcji. Procesy te są zbyt wolne, aby osiągnąć wystarczającą szybkość przenoszenia mas dla większości reakcji. Wymuszona konwekcja (mieszanie) jest zatem powszechnym sposobem na zwiększenie szybkości przenoszenia mas, przy zastosowaniu różnego typu mieszadeł, pomp lub kompresorów.

Szybkość przenoszenie mas w roztworze zależy od:

• intensywności mieszania

• lepkości (μ) i gęstości (ρ) cieczy

Z kolei intensywność mieszania zależy od:

• kształtu mieszadeł i reaktora

• mocy mieszadła

Lepkość i gęstość cieczy zależą od składu roztworu i jego temperatury.

Wraz ze wzrostem intensywności mieszania rosną koszty spowodowane rosnącym zużyciem energii oraz pojawiają się problemy z destrukcją komórek, enzymów, a niekiedy produktów. Zatem te czynniki mogą ograniczać stosowanie optymalnych szybkości mieszania.

Odpowiednie zaprojektowanie systemu mieszania oraz reaktora może przyczynić się do sukcesu lub niepowodzenia całego bioprocesu. Należy pamiętać, że w dużych bioreaktorach mogą występować martwe strefy, które znacząco wpłyną na obniżenie wydajności.

Szybkość reakcji rośnie wraz ze wzrostem stężenia substratu. W przypadku, gdy substrat dostarczany jest w postaci niewodnej, musi najpierw ulec rozpuszczeniu. W tym przypadku stężenie rozpuszczonego w wodzie substratu (a nie jego stężenie całkowite) będzie określało kinetykę katalizy.

Przenoszenie mas gaz-ciecz jest ważne w procesach biotechnologicznych i dotyczy głównie transportu tlenu. Obejmuje również procesy usuwania CO₂ oraz procesy destylacji produktów lotnych.

Przenoszenie mas ciecz-ciecz ma znaczenie w przypadku reakcji w układach dwufazowych, konwersji związków hydrofobowych (oleje, alkany) oraz w procesach ekstrakcji.

Przenoszenie mas ciało stałe-ciecz ma miejsce w przypadku stosowania osadu komórek bakterii, komórek immobilizowanych i immobilizowanych enzymów. Transfer taki jest istotnym czynnikiem w procesach adsorpcji, wymiany jonowej czy też krystalizacji.

Ponieważ ruch cieczy w warstwie granicznej jest wolny, ruch rozpuszczonych związków poprzez tę warstwę będzie determinowany raczej przez siły dyfuzji, a nie konwekcji, zatem szybkość tej dyfuzji będzie czynnikiem limitującym.

Etapy transferu rozpuszczonego związku między fazami:

1. rozpuszczony związek wędruje przez pęcherzyk i osiąga granicę faz

2. rozpuszczony związek wędruje przez granicę faz

3. związek wędruje przez warstwę międzyfazową do cieczy otaczającej

Ponieważ szybkość ruchu rozpuszczonego związku przez warstwę międzyfazową jest określana tylko przez dyfuzję, etap trzeci uważany jest powszechnie za etap ograniczający szybkość reakcji.

Czynniki wpływające na proces przenoszenia mas między fazami

Ruch cząsteczek poprzez warstwę międzyfazową jest determinowany przez dyfuzję i zachodzi od wysokiego do niskiego stężenia. Szybkość dyfuzji jest determinowana gradientem stężeń w warstwie międzyfazowej.

Szybkość można zwiększyć poprzez:

• zwiększenie powierzchni międzyfazowej

• zwiększenie gradientu stężeń w poprzek warstwy międzyfazowej

• obniżenie grubości warstwy międzyfazowej

• zwiększenie szybkości ruchu cząsteczek w poprzek warstwy międzyfazowej

Mieszanie a przenoszenie mas między fazami:

• intensywne mieszanie wytwarza silne siły ścinające, które rozdrabniają pęcherzyki gazu i krople

• następuje szybsze usuwanie rozpuszczonego związku z warstwy międzyfazowej i utrzymanie gradientu stężeń

• następuje spadek grubości warstwy międzyfazowej

WYKŁAD 13, 17/05/2012

Szybkość przenoszenia mas jest determinowana przez dwa czynniki:

• mieszanie

• dyfuzję

Opisy matematyczne, dotyczące tego procesu w bioreaktorach z wymuszonym mechanizmem muszą zatem uwzględniać:

• szybkość mieszania

• sposób zaprojektowania reaktora

• średnicę turbiny

• gęstość i lepkość medium

• gęstość pęcherzyków

• szybkość dyfuzji

W obliczeniach inżynierskich korelacje te charakteryzują różna wartości bezwymiarowe, np. liczba Reynoldsa, liczba mocy (Newtona).

Wychodząc z założenia, że etapem ograniczającym przenoszenie mas między fazami jest szybkość dyfuzji związku przez warstwę międzyfazową, możemy opisać to równaniem:

dC_S/dt = kA(C_S^* - C_S)

C_S - stężenie rozpuszczonego związku w medium otaczającym

C_S^* - stężenie tego związku w warstwie międzyfazowej

A - całkowita powierzchnia międzyfazowa

k - współczynnik przenoszenia mas

Zwiększenie wartości współczynników k i A będzie prowadziło do zwiększenia szybkości przenoszenia mas. Współczynniki te są zależne od:

• k → temperatury, lepkości medium, wielkości rozpuszczonego związku, intensywności mieszania, obecności związków interferujących

• A → intensywności mieszania, działania sił ścinających, obecności czynników powodujących zlepianie

Napowietrzanie

Fermentacje tlenowe są podstawowymi procesami biotechnologicznymi, prowadzącymi do otrzymania ważnych komercyjnie produktów. Dostarczanie tlenu, niezbędnego w tych procesach, jest dla technologów jednym z największych problemów do rozwiązania. Wynika to z wspomnianego już faktu, że tlen jest słabo rozpuszczalny w wodzie. Tak więc dostępność tlenu jest bardzo często czynnikiem limitującym szybkość procesu fermentacji tlenowej. Często koszty związane z napowietrzaniem hodowli w skali przemysłowej są bardzo poważnym składnikiem kosztów całkowitych hodowli.

Jeśli mamy do czynienia z prostym układem - zawiesiną pojedynczych komórek, to etapem limitującym przenoszenie tlenu będzie przenikanie cząsteczek tlenu poprzez warstwę międzyfazową.

W przypadku dobrego mieszania zawartości bioreaktora, etapem limitującym przenoszenie tlenu będzie szybkość jego dyfuzji poprzez warstwę międzyfazową.

OTR = dC_O/dt = k_La(C_O^* - C_O)

Ponieważ nie jest możliwe dokładne zmierzenie całkowitej powierzchni międzyfazowej, w praktyce stosuje się łączny termin k_La, określający szybkość transferu tlenu na jednostkę objętości.

Ponieważ nie ma również możliwości technicznej pomiaru stężenia tlenu w warstwie międzyfazowej, dane te uzyskuje się metodą pośrednią: napowietrzając sterylną zawartość fermentora, osiągniemy stan równowagi przy maksymalnym (w danej temperaturze) stężeniu tlenu w roztworze. W tym przypadku stężenie tlenu zarówno w warstwie międzyfazowej, jak i w roztworze będzie równe, co wynika z równania:

dC_O/dt = k_La(C_O^* - C_O)

dC_O/dt = 0 → C_O^* = C_O

Maksymalna rozpuszczalność tlenu w cieczy może być wyznaczona w oparciu o równanie Henry'ego:

C_O^* = P_O/H_O

Czynniki wpływające na współczynnik transferu tlenu (k_L) przez warstwę międzyfazową:

• wartość k_L możemy zwiększyć poprzez zmniejszenie warstwy międzyfazowej

• zwiększenie szybkości przenikania tlenu przez tę warstwę

Grubość warstwy międzyfazowej zależy od intensywności mieszania. Szybkość dyfuzji tlenu przez tę warstwę zależy od lepkości środowiska i temperatury. Wzrost temperatury powoduje spadek lepkości, ale równocześnie zmniejsza się rozpuszczalność tlenu w roztworze. Jeśli mieszanie jest zbyt wolne lub przepływ powietrza zbyt duży, zbiera się ono pod turbiną, pęcherzyki łączą się w duże bąble i spada wydajność natleniania.

Na stopień wykorzystania tlenu zawartego w powietrzu wprowadzanym do ścieków mają wpływ:

• wielkość pęcherzyków powietrza, zależna od konstrukcji elementów napowietrzających

• głębokość założenia elementów napowietrzających

• kształt napowietrzanej komory

• sposób ułożenia elementów napowietrzających w stosunku do rzuty poziomego komory

Zatrzymanie gazu (G_H) określa objętość gazu w stosunku do objętości cieczy w reaktorze.

Wartość G_H podnosi się wraz ze wzrostem przepływu powietrza, a wartości G_H i czasu przebywania (τ) rosną wraz z:

• wzrostem lepkości cieczy

• spadkiem wielkości pęcherzyków

• wysokością reaktora

Należy pamiętać, że dłuższy czas przebywania czy też wyższa wartość współczynnika G_H nie zawsze muszą zwiększać wymianę tlenu - ponieważ im dłużej pęcherzyk przebywa w reaktorze, tym mniej tlenu może zawierać. Małe pęcherzyki szybciej oddają tlen; w praktyce tak dobiera się warunki napowietrzania, aby pęcherzyki miały średnicę około 3mm.

Stała Henry'ego (H_O) zależy od temperatury i zawartości soli w roztworze. Przy ciśnieniu
1 atm. ciśnienie parcjalne tlenu wynosi 0,21 atm. Dla czystego tlenu ciśnienie parcjalne w normalnych warunkach ciśnienia atmosferycznego wynosiłoby 1 atm. A zatem, teoretycznie, zwiększenie wymiany tlenu można osiągnąć przez natlenianie reaktora czystym tlenem, zamiast powietrzem.

OUR - szybkość pobieranego tlenu

Stężenie rozpuszczonego tlenu w medium w bioreaktorze jest określane równowagą pomiędzy szybkością przenoszenia tlenu (OTR) i jego pobieraniem (OUR).

dC_O/dt = OTR - OUR

W ruchu laminarnym tory cząsteczek mało różnią się od siebie. Pozostające w ruchu medium można traktować jako zbiór oddzielnych warstw, poruszających się względem siebie z różną prędkością i nie mieszających się ze sobą. W ruchu turbulentnym ruch cząsteczek płynu powoduje mieszanie się różnych warstw.

Lepkość cieczy

Lepkość (μ) najogólniej jest definiowana jako miara tarcia wewnętrznego cieczy (siły międzycząsteczkowego przyciągania cieczy). Na charakterystykę lepkościową cieczy
składają się:

• lepkość w zależności od temperatury

• wskaźnik lepkości

W technice wyróżnia się:

• lepkość dynamiczną - μ

• lepkość kinematyczną - ν

Lepkość dynamiczną wyrażamy w jednostkach układu SI:

1 Pa · s = 1 N · s/m² = 1 kg/m · s

Lepkość dynamiczna jest często wyrażana w systemie CGS w puazach:

1 P = 1 dyna · s/cm² = g/cm · s = ¹/₁₀ Pa · s

Lepkość kinematyczna to stosunek lepkości dynamicznej danej cieczy do jej gęstości. Zarówno lepkość kinematyczna, jak i lepkość dynamiczna muszą być wyznaczane w tej samej temperaturze.

WYKŁAD 14, WYKŁAD 15 → również nie było mnie na nich, więc nie mam notatek…

---