Cel ćwiczenia:

Zapoznanie się z podstawowymi wiadomościami z zakresu budowy i zasady działania spektrometru mas oraz zastosowania spektroskopii mas we współczesnej nauce.

Zad.1 Dlaczego technika jonizacji typu electrospray jest stosowana jako główne źródło jonów podczas łączenia spektrometrów masowych z chromatografami cieczowymi?

Elektrospray (elektrorozpylanie, ESI)- to jedna z dosyć często stosowanych technik jonizacji próbek w spektroskopii masowej. Jest to technika jonizacji dodatniej, polega na wprowadzeniu cieczy o niewielkim przepływie w silne pole elektryczne (wykorzystuje się tu napięcia rzędu 2000-5000V ) pod ciśnieniem atmosferycznym. Na skutek czego ciecz zostaje wyrzucona z kapilary w postaci zawiesiny kropelek, obdarzonych ładunkiem (dodatnim lub ujemnym w zależności od polaryzacji kapilary). Kolejnym etapem jest odparowanie rozpuszczalnika z kropli i jej rozerwanie pod wpływem odpychających sił kulombowskim powoduje to tzw. „eksplozję kulombowska”. Proces ten trwa do momentu, kiedy jest możliwa desorpcja jonów z kropli pod wpływem działania pola elektrycznego. Na skutek dalszego odparowywania rozpuszczalnika powstają częściowo solwatowane jony naładowane.

Technika jonizacji typu ESI jest stosowana jako główne źródło jonów podczas łączenia spektrometrów gazowych z chromatografami cieczowymi ponieważ :

• Minimalna fragmentacja próbki podczas jonizacji, co pozwala na oznaczanie masy cząsteczkowej substancji w zakresie 50 - 100 000 Da. Jest to bardzo ważne przy połączeniu obu tych technik, ponieważ masy cząsteczkowe rozdzielanych i badanych substancji metodą HPLC mogą zawierać się w dużym przedziale. Pozwala na oznaczanie mas cząsteczkowych takich związków jak: białka, peptydy, polimery, kwasy nukleinowe.

• Jonizacja próbek omawianą metodą odbywa się pod ciśnieniem atmosferycznym, co czyni ją łatwiejszą w zastosowaniu od metod, które do swojego zastosowania wymagają podwyższonego ciśnienia.

• Daje możliwość analizy substancji w roztworach wodnych i organicznych. Daje to większą swobodę co do wyboru fazy ruchomej w wykonywanej analizie.

• Wysoka czułość oznaczeń (piko/femtomole) - jonizacja przez rozpraszanie służy do precyzyjnego określania masy cząsteczkowej i do strukturalnej charakteryzacji cząsteczek obecnych w śladowych ilościach w próbkach o złożonym składzie.

• Dokładność oznaczeń, brak interferencji od matrycy;

• Niewielkie zużycie próbki.

Jakie przewagi posiada detektor w postaci spektrometru mas od detektora typu UV - VIS w chromatografii cieczowej?

Detektor w postaci spektrometru mas ma przewagę nad detektorem typu UV - VIS w chromatografii cieczowej ponieważ:

• Spektrometry dostarczają wielokrotnie więcej informacji o wymywanych z kolumny substancjach w porównaniu z innymi detektorami;

• Możliwa jest jednoznaczna identyfikacja rozdzielanych substancji natomiast detektor UV - VIS nie pozwala na jednoznaczną identyfikację badanych substancji ponieważ, dostarcza za mało informacji o rozdzielanych substancjach. W celu dokładnej identyfikacji niezbędne jest wykonanie dodatkowych analiz

• Charakteryzuje się większą czułością (próbka zagęszczona na kolumnie chromatograficznej, unikanie strat związanych z przenoszeniem próbki)

• Nie ma ograniczenia tego typu, że oznaczany związek musi posiadać ugrupowanie chromoforowe a eluent nie może go posiadać tak jak to jest wymagane w przypadku detektora UV-VIS.

• Niewielkie zużycie analizowanego materiału.

• Przeprowadzana analiza staje się prostsza i znacznie szybsza

Jakie są wady lub niedogodności związane z tego rodzaju połączeniem?

Problemy z tego typu połączeniem mogą być związane z tym, że:

• Nie wszystkie źródła jonów mogą być wykorzystane przy połączeniu tych technik.

W systemie HPLC przepływ fazy ruchomej musi być dostosowany do źródła jonów.

• Konieczna jest zatem regulacja przepływu, co prowadzi do tego, że tylko część próbki trafia do źródła jonów. Pociąga to za sobą spadek czułości analizy MS.

• Fazy ruchome stosowane w analizie muszą być pozbawione składników nielotnych oraz wysokich stężeń soli, ponieważ utrudniają one analizę. Z tego powodu pewne rodzaje chromatografii trudno jest wykorzystać w połączeniu ze spektroskopią masową.

Szczegółowa dyskusja możliwości połączeń techniki HPLC i MS w przypadku zbyt dużego przepływu eluenta w porównaniu do zakresu akceptowanych prędkości przepływu spektrometru.

W przypadku zbyt dużego przepływu eluenta w porównaniu do zakresu akceptowanych prędkości przepływu spektrometru w celu rozwiązania tego problemu możemy postępować w dwojaki sposób:

1. Zastosowanie systemu podziału przepływu (split). Polega to na przyłączeniu do wylotu kolumny chromatograficznej rozgałęzień z dwiema kapilarami o tak dobranych oporach, aby uzyskać zamierzony podział przepływu. Ceną jaką musimy zapłacić za tego typu rozwiązanie jest duży spadek czułości analizy MS ponieważ jedynie niewielka część próbki trafia do źródła jonów. Ma to jednak swoje dobre strony ponieważ pozwala na zachowanie większości próbki do dalszych analiz.

2. Redukcja średnicy kolumn chromatograficznych. Zaletą tego rozwiązania jest możliwość analizy bardzo niewielkich ilości próbki.

Zad. 2 Obliczenie masy rzeczywistej substancji zjonizowanej przy pomocy źródła jonów typu ESI, na widmie obserwujemy następujące m/z:

a) 2429,1²⁺

b) 1619,7³⁺

c) 1215,1⁴⁺

d) 972,2⁵⁺

Rzeczywistą masę substancji zjonizowanej obliczono korzystając ze wzoru:

m_zw = (m/z)*z - m_cz

gdzie:

• m_zw - rzeczywista masa wyjściowej cząsteczki, która uległa jonizacji bez fragmentowania;

• m/z - wartość odczytana z widma dla niepofragmentowanego jonu, odpowiadająca stosunkowi masy analizowanej cząsteczki (w Daltonach) do liczby ładunków elementarnych (z) które niósł ze sobą jon od którego pochodzi dany sygnał;

• m_cz - suma mas cząsteczek lub jonów, które nadały ładunek poprzez przyłączenie się do wyjściowej cząsteczki ( w Daltonach). m_cz = z*m_{cząsteczki nadającej ładunek}

• masa protonu = 1,00727646688 Da ~ 1,007 Da

• w przypadku przyłączenia lub oderwania elektronu jego masę pomijamy

Ad a)

m/z = 2429,1

z = 2+

m_cz = 2*1,007 Da = 2,014 Da

m_zw = 2429,1*2 - 2,014 Da = 4856,186 Da

Ad b)

m/z = 1619,7

z = 3+

m_cz = 3*1,007 Da = 3,021 Da

m_zw = 1619,7*3 - 3,021 Da = 4856,079 Da

Ad c)

m/z = 1215,1

z = 4+

m_cz = 4*1,007 Da = 4,028 Da

m_zw = 1215,1*4 - 4,028 Da = 4856,372 Da

Ad d)

m/z = 972,2

z = 5+

m_cz = 5*1,007 Da = 5,035 Da

m_zw = 972,2*5 - 5,035Da = 4855,965 Da

Rzeczywista masa substancji zjonizowanej:

1. 4856,186 Da;

2. 4856,079 Da;

3. 4856,372 Da;

4. 4855,965 Da;

Zad. 3 W jaki sposób wykorzystując fragmentację w czasie analizy M, można określić sekwencję (kolejność) reszt aminokwasowych w analizowanym peptydzie?

Spektrometria mas jest techniką zaliczaną do metod spektroskopowych, która jednak różni się od nich. Różnica polega na tym, że w większości rodzajów spektroskopii bada się, obserwuję się efekty przejść pomiędzy poziomami energetycznymi, natomiast w spektrometrii MS podstawową zasadą jest wytworzenie, seperacja jonów zgodnie z ich stosunkiem masy do ładunku oraz określenie względnej ilości każdego jonu. Dokładniej: podstawowym zadaniem spektrometru masowego jest jonizacja cząsteczek badanej próbki, strumień jonów jaki otrzymuje się w tym procesie jest analizowany i rozdzielany w analizatorze zgodnie z wartością m/z. Sygnał biegnie do detektora gdzie przekształcany jest w impulsy elektryczne, rejestrowane przez komputer i następnie analizowane jako widmo masowe.

Spektrometria masowa znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach chemicznych, biologicznych, najnowszych naukach, przykładem może być proteomika- nauka zajmująca się badaniem białek i peptydów ( sekwencjonowaniem ).

Do niedawna duże cząsteczki takie jak białka nie można było badać metodą MS, ponieważ są one nielotne i trudne do przeprowadzenia w jony molekularne w stanie gazowym. Dzięki rozwojowi nowych technik takich jak: jonizacja przez laserową desorpcję próbki umieszczonej w matrycy (MALDI) oraz jonizacja spowodowana elektrorozpyleniem (ESI) problem ten został rozwiązany.

Analizując białka przy użyciu spektrometru masowego przechodzi się przez następujące etapy:

• przygotowanie próbki,

• trawienie próbki,

• jonizacja peptydów,

• analiza masy,

• analiza danych.

Powody dla których proces trawienia białek jest wymagany:

• czułość spektrometru masowego jest znacznie mniejsza dla białek niż dla peptydów;

• masy całych białek nie podają tak dokładniej informacji o ich tożsamości, jak masy wychodzących się z nich peptydów;

• wiele białek jest nierozpuszczalnych w formie natywnej, czyli takiej konformacji w jakiej występują i funkcjonują w organizmie.

Analizę spektrometryczną peptydów można podzielić na trzy następujące etapy:

• jonizację;

• analizę masy;

• detekcję;

• określenie wartości m/z, przy odpowiednio wysokiej rozdzielczości analizatora masy umożliwiającej ustalenie ładunku cząsteczek, pozwala na wyznaczenie ich masy.

Obecnie najczęściej wykorzystywane techniki jonizacji próbki to „wspomagana przez matrycę laserowa desorpcja / jonizacja”( MALDI ) oraz jonizacja przez elektrorozpylani (ESI).

W metodzie MALDI materiał umieszczany jest na chemicznie obojętnym podłożu, gdzie poddaje się krystalizacji wraz z związkiem absorbującym, który, po naświetleniu laserem o odpowiedniej długości fali pomaga przeprowadzić peptydy do fazy gazowej i zjonizować. Modyfikacją tej techniki jest „powierzchniowo wzmocniona laserowa desorpcja/jonizacja”, tutaj badana próbka jest wstępnie frakcjonowana, na specjalnie ku temu przygotowanych podłożach, na zasadzie chromatografii hydrofobowej, jonowymiennej lub tym podobnym. Oczyszczona frakcja jest następnie na tym samym podłożu traktowana, podobnie jak w MALDI, odpowiednim związkiem stanowiącym matrycę i naświetlana laserem w celu jonizacji peptydów.

Analizatory masy odgrywają główną rolę przy rozdzielaniu jonów otrzymanych w czasie jonizacji próbki, kluczowymi cechami tych urządzeń są: czułość, rozdzielczość, dokładność, przepuszczalność oraz możliwość tworzenia tandemowego widma mas. Głównymi analizatorami stosowanymi w dzisiejszych czasach są: analizatory kwadrupolowe, pułapki jonowe, analizatory czasu przelotu, analizator magnetyczny i analizator cyklotronowy.

Zajmując się analizą danego związku, w tym przypadku białek i peptydów, należy wspomnieć o metodzie MS/MS, czyli tandemowej spektrometrii mas. Metoda ta umożliwia wgląd w strukturę badanej cząsteczki, polega na rozbiciu wiązań i wyznaczeniu mas powstałych fragmentów.

Typowy eksperyment MS/MS składa się z trzech etapów:

1. Selekcja określonych peptydów po trawieniu białka.

2. Fragmentacja wyselekcjonowanych peptydów.

3. Analiza mas powstałych fragmentów.

Uzyskany w ten sposób zestaw fragmentów stanowi populację peptydów o kolejnych masach, które różnią się między sobą o masę odpowiedniego aminokwasu obecnego w sekwencji peptydu rodzicielskiego. Pozwala to na utworzenie tandemowego widma mas, o którym wcześniej wspomniano, zawierającego informację na temat sekwencji analizowanych peptydów.

Dzięki analizie przeprowadzanej metodą spektrometrii masowej można przede wszystkim ustalić masę badanej cząsteczki oraz jej fragmentów, ale również oznaczyć strukturę cząsteczek organicznych, a także ustalić sekwencję peptydów i białek.

Analiza widma standardu peptydowego :

W technice typu MALDI stosuje się analizator czasu przelotu, w którym jony rozdzielane są w zależności od stosunku m/z na podstawie ich różnych prędkości uzyskanych po przyspieszeniu w polu elektrycznym na tym samym dystansie. Jony o większej masie uzyskują mniejsze prędkości i docierają do detektora później niż jony o mniejszej masie, które poruszają się szybciej.

Analizatory służą do rozdzielania jonów uzyskanych w czasie jonizacji próbki, w zależności od stosunku ich masy do ładunku (m/z). parametry analizatorów:

• zakres mas;

• rozdzielczość

• przepuszczalność

• dokładność

W spektroskopii mas bardzo ważny jest parametr rozdzielczości.

Analizator czasu przelotu może pracować w dwóch trybach:

- trybie liniowym

- trybie z odbiciem

Tryb liniowy charakteryzuje się niska zdolnością rozdzielczą (jony o tych samych m/z mogą różnić się nieznacznie E_k i wysoką czułością.

Natomiast tryb z odbiciem charakteryzuje się dużo lepszą rozdzielczością lecz niższą czułością. Znacznie wyższa rozdzielczość uzyskujemy dzięki zastosowaniu reflektora, który koryguje różnice w energii kinetycznej jonów wychodzących ze źródła podczas pokonywania przez nie drogi przez analizator.

Wykonanie ćwiczenia:

Przygotowano nasycony roztwór matrycy przez rozpuszczenie kwasu a-cyjano-4-hydroksycynamonowego w roztworze zawierającym 50% acetonitrylu(ACN) i 0,17% kwasu tetrafluorooctowego(TFA). Tak przygotowaną matrycę poddano wirowaniu i włożono do łaźni ultradźwiękowej w celu dobrego wymieszania. Następnie badaniu metodą MALDI poddano próbkę standardu peptydowego. Próbkę wraz z matrycą umieszczono na stalowej płytce, po wykrystalizowaniu płytkę z naniesioną próbką wprowadzono do źródła jonów. Jonizacja polega na uderzeniu w wykrystalizowaną próbkę promieniem lasera, w tym czasie zachodzą trzy procesy jednocześnie: odparowanie próbki wraz z matrycą, zjonizowanie matrycy oraz wtórna jonizacja próbki pod wpływem oddziaływania ze wzbudzoną matrycą. W tych warunkach jonizacji badane próbki przyjmują ładunek, najczęściej dodatni, w wyniku przyłączenia protonu (rzadziej dwóch czy trzech). Wykonano pomiar w trybie liniowym i w trybie z odbiciem (załączone widma). Porównując oba te widma można zauważyć, że w widmie masowym otrzymanym w wyniku pomiaru w trybie z odbiciem zwiększyła się odległość pomiędzy pikami (prawie o 1 Da). Rozdział jonów, w zależności ich masy do ładunku, następuje na podstawie różnicy prędkości przepływu od analizatora do detektora. Jony posiadają pewną energię kinetyczną i po dotarciu do detektora ich energia zostaje przekształcona w mierzalny sygnał obserwowany na widmie masowym. Czas trwania tych procesów jest bardzo krótki, kilka nanosekund. Wykonując pomiary w trybie liniowym dostajemy złożone piki, o małej rozdzielczości. Wzrost rozdzielczości można osiągnąć stosując tryb z odbiciem (odbijające pole elektryczne). Jony o tej samej wartości m/z mające pewną energię i prędkość wnikają w obszar hamującego pola elektrycznego i przebywają tam dłuższy czas niż te jony, które mają mniejszą energię i są zaraz zawracane. Dzięki temu wszystkie jony o stałej wartości m/z docierają do detektora w tym samym czasie co się obrazuje większą rozdzielczością.

Rysunek 1 Widmo standardu peptydowego

---