Zasady pobierania, transportu, przechowywania próbek żywności

pobranych do badań mikrobiologicznych

1. Mikrobiologiczna ocena żywności:

- pozwala na:

ocenę surowców i gotowych produktów

sprawdzenie prawidłowości procesów technologicznych

- nadmierna ilość drobnoustrojów lub obecność pewnych grup może wskazywać na:

brak higieny

niewłaściwą obróbkę termiczną

niewłaściwe magazynowanie

- metody stosowane w mikrobiologicznej analizie żywności - cel:

oznaczenie ogólnej liczby drobnoustrojów

oznaczenie drobnoustrojów wskaźnikowych

oznaczenie obecności i liczby drobnoustrojów wywołujących psucie i zatrucia

wykrywanie toksyn drobnoustrojów.

2. Próbki żywności:

- partia żywności - ilość środka spożywczego wytworzonego w tym samym czasie, jednolitego pod względem pochodzenia, producenta, rodzaju, sposobu i rodzaju pakowania

- próbka pierwotna - jednostki pochodzące z tego samego miejsca partii (materiał pobrany w jednym punkcie partii)

- próbka zbiorcza (ogólna) - połączony i wymieszany zbiór próbek pierwotnych, pobranych z partii (w przypadku mięsa i drobiu każda próbka pierwotna jest próbką zbiorczą)

- próbka laboratoryjna - próbka wysłana do laboratorium lub otrzymana w laboratorium; obejmuje reprezentatywną ilość materiału pobranego z próbki zbiorczej; uzyskuje się ją w wyniku uśrednienia i pomieszania próbki zbiorczej

- próbka analityczna - materiał przygotowany do analizy z próbki laboratoryjnej poprzez oddzielenie części produktu przeznaczonego do badania, a następnie wymieszanie, zmielenie, rozdrobnienie itp. w celu wyodrębnienia porcji analitycznej w sposób minimalizujący wielkość błędu; reprezentatywna część próbki laboratoryjnej, wymagana do jednej analizy

- wielkość próbki - liczba jednostek lub ilość materiału, na który składa się próbka

- jednostka - najmniejsza część partii, jaka może być z niej pobrana, stanowiąca całość lub część próbki pierwotnej; przykłady:

świeże owoce/warzywa - cały owoc/warzywo lub postać w jakiej występuje w sposób naturalny (np. kiście winogron)

małe zwierzęta, ich części, narządy - całe zwierzę lub cała część/narząd

duże zwierzęta, ich części i narządy - część lub całość narządu

materiały opakowane - najmniejsze oddzielne opakowanie jednostkowe

duże opakowania (beczki, sery) - materiał pobrany za pomocą przyrządu do pobierania próbek.

3. Pobieranie próbek do badania mikrobiologicznego:

- pobieranie musi być prowadzone w sposób wykluczający dodatkowe zanieczyszczenie ich drobnoustrojami

- wszystkie operacje podczas otwierania opakowań należy przeprowadzić aseptycznie, np.:

kiełbasy parzone lub surowe, w naturalnych/syntetycznych osłonkach - zdezynfekować w połowie długości batona na całym obwodzie, zwilżając osłonkę etanolem i opalając; następnie nacinając jałowym nożykiem zdjąć osłonkę

puszki po zdezynfekowaniu otwierać jałowym nożem

konserwy o konsystencji zestalonej - puszkę otworzyć z obu stron i wypchnąć zawartość na jałową tacę

mięso i przetwory mięsne nie opakowane - umieścić na sterylnej tacy i opalić, następnie jałowym nożem usunąć opaloną część (w przypadku oceny stanu mikrobiologicznego powierzchni produktu próbek nie należy opalać)

produkty w małych opakowaniach, konserwy pasteryzowane i sterylizowane - pobieranie w oryginalnych opakowaniach

produkty z dużych opakowań - pobieranie do jałowych naczyń z hermetycznym zamknięciem lub toreb plastikowych

- próbki do badań należy pobierać losowo

- cechy idealnego pojemnika do przechowywania próbek żywności:

sterylny

czysty i suchy

czytelnie oznakowany

szczelny

nie powinien stwarzać zagrożenia z powodu np. obecności szkła w żywności

- podczas pobierania próbek należy spisać protokół pobrania:

numer próby

rodzaj i ilość pobranego produktu

oznakowanie producenta

wielkość partii, którą próba reprezentuje

data i nazwisko pobierającego.

4. Transport i przechowywanie próbek żywności do analizy mikrobiologicznej:

produkt	temperatura transportu [^oC]	wykonanie analizy
świeży i schłodzony	0-4	- 24h od przyjęcia próbki do badań - >24h to konieczne jest obniżenie temperatury do -18^oC
mrożony i niskomrożony	≤-18	przed upływem terminu przydatności do spożycia
w uszkodzonym opakowaniu	0-4	<48h
trwały i pasteryzowany	pokojowa	przed upływem terminu przydatności do spożycia

5. Liczba próbek pobranych do badań (n):

- o liczbie próbek decyduje:

częstość występowania drobnoustrojów niebezpiecznych dla zdrowia

grupa konsumentów, dla której żywność jest przeznaczona

- liczba próbek:

ocena partii większości środków spożywczych n = 5

bakterie szczególnie niebezpieczne (np. Salmonella spp.) n = 10

grupa „wysokiego ryzyka” n = 60

w Polsce n zależy od wielkości badanej partii żywności

- wielkość próbki produktu do badań mikrobiologicznych nie powinna być mniejsza niż 250g (dla niektórych produktów jednorodnych dopuszcza się 100g)

- kontrola procesu produkcji - pobranie próbek minimum 2 razy (na początku i końcu procesu produkcyjnego).

6. Plan dwu- lub trzyklasowy pobierania i oceny próbek żywności (stosowany w zależności od stopnia ważności oznaczanych drobnoustrojów):

- plan dwuklasowy:

gdy zachodzi podejrzenie występowania w żywności drobnoustrojów niebezpiecznych

jeden limit mikrobiologiczny „m” (wartość, która pozwala na akceptację próbki); umożliwia podział próbek na dwie klasy:

- wadliwe >m

- akceptowane ≤m

„c” - maksymalna dopuszczalna liczba próbek nie odpowiadająca wymaganiom; dla niektórych drobnoustrojów wynosi 0 (np. Salmonella spp.)

środek spożywczy	rodzaj drobnoustroju	n	c	limit w 1g
								m	M
	wędliny surowe i surowo wędzone	bakterie z grupy coli	5	1	0	-
		Salmonella	5	0	0	-
		S. aureus	5	1	10^2	5 x 10^2
		wszystkie próbki <„m”			akceptacja partii
		≤„c” próbek z „n”>„m”
		>„c” próbek z „n”>„m”			odrzucenie partii

- plan trzyklasowy:

stosowany jeżeli w ilości jednostkowej dopuszczalna jest pewna liczba drobnoustrojów (np. mogących powodować szybsze psucie produktu)

2 limity mikrobiologiczne:

- „m” - górny limit dobrej praktyki produkcyjnej; wysoka jakość, gdy próbki o wartości ≤m (pełna dopuszczalność do obrotu)

- „M” - granica, poza którą poziom skażenia jest niebezpieczny lub niedopuszczalny; przekroczenie M zawsze powoduje odrzucenie partii

próbki o wartościach pomiędzy m i M mogą być warunkowo uznane, jeśli „c” nie jest większa od ustalonej

środek spożywczy	rodzaj drobnoustroju	n	c	limit w 1g
								m	M
	wędliny surowe i surowo wędzone	bakterie z grupy coli	5	1	0	-
		Salmonella	5	0	0	-
		S. aureus	5	1	10^2	5 x 10^2
		wszystkie próbki <„m”			akceptacja partii
		≤„c” próbek z „n”>„m” oraz ≤„M”
		>„c” próbek z „n”>„m” oraz ≤„M”					odrzucenie partii
		jakakolwiek próbka >M

7. Przygotowanie laboratoryjne próbek żywności do badań mikrobiologicznych:

- wstępne przygotowanie próbek konserw i produktów zamrożonych:

mrożone mięso i jego przetwory rozmrażać w temperaturze 0-2^oC do całkowitego rozmrożenia (nie dłużej niż przez 24h)

próbki konserw poddać próbie szczelności - badanie szczelności konserw metalowych zamkniętych hermetycznie:

- I metoda - umieszczenie konserwy w eksykatorze próżniowym, wypompowanie powietrza pod ciśnieniem 135 hPa na 2-3 min; po wyjęciu dokładnie obejrzeć złącza

- II metoda - zanurzenie konserwy w szklanym naczyniu z wodą o temperaturze 90-95^oC; nieszczelność - pęcherzyki gazu spod szwów lub wieczka

konserwy w nieuszkodzonych opakowaniach oraz o utwierdzonej szczelności poddać próbie termostatowej - badanie trwałości metodą termostatową:

- do produktów sterylizowanych i pasteryzowanych, zamkniętych hermetycznie, o długim okresie przydatności do spożycia

- konserwy inkubuje się w cieplarce wyposażonej w termograf lub termometr w temperaturze 37^oC:

dla konserw o masie <1 kg czas inkubacji wynosi 7 dób

dla konserw o masie >1 kg czas inkubacji wynosi 10 dób

- po inkubacji konserwy schładza się pod bieżącą wodą do temperatury 18-20^oC i poddaje badaniom

- wynik uznaje się za dodatni, jeżeli konserwa wykazała chociaż jedną z następujących cech:

bombaż (odkształcenie wieczka/denka)

niezestalenie się (jeśli norma przewiduje zestalenie)

wyciek

- przygotowanie rozcieńczeń próbek żywności:

minimum 10g/10cm³ próbki odważamy i przenosimy do homogenizatora

do naważki dodajemy 9-krotnie większą objętość określonego rozpuszczalnika (np. woda peptonowa, płyn Ringera) i homogenizujemy (na tym etapie rozcieńczenie wynosi 1:10)

stopień dalszego rozcieńczenia próbki należy ustalić na podstawie przewidywanego stopnia mikrobiologicznego zanieczyszczenia produktu; podstawowe zasady prawidłowego wykonania rozcieńczenia próbek żywności:

- każde rozcieńczenie wykonywać inną pipetą

- pipetę zanurzać maksymalnie na 2,5 cm

- woda użyta do przygotowania rozpuszczalnika powinna być destylowana, dejonizowana i wolna od substancji hamujących wzrost bakterii

w przypadku produktów płynnych mieszamy rozpuszczalnik z produktem.

TECHNIKI MIKROSKOPOWANIA

1. Mikroskop:

- optyczny:

świetlny (zwykły)

ultramikroskop:

- oglądanie drobnoustrojów w tzw. ciemnym polu widzenia (obiekty są jasne)

- specjalny kondensor nie przepuszcza promieni centralnych, a jedynie boczne (odbite od oglądanych obiektów i padające pod pewnym kątem)

- zastosowanie w obserwacji mikroorganizmów w płynach ustrojowych oraz elementów przezroczystych, których nie można zauważyć w jasnym polu widzenia

- preparaty świeże, niebarwione

fluorescencyjny (luminescencyjny):

- wykorzystuje zjawisko fluorescencji (własnej lub wtórnej fluorochromów - auramina, rodamina, fluoresceina) obiektów oświetlonych niewidzialnym światłem UV

- część optyczna (kryształ górski) przepuszcza promieniowanie UV

- zastosowanie - wykrywanie prątków, diagnostyka kiły, identyfikacja grzybów, badania serologiczne (immunofluorescencja)

kontrastowo-fazowy:

- obserwacje w świetle przechodzącym bezbarwnych obiektów przezroczystych dzięki specjalnej optyce, która uwzględnia różnice w gęstości materiału biologicznego i ich współczynniki załamania światła

- obserwacja żywych, niebarwionych komórek w kropli wody, niezabarwionych tkankach

- ocena ruchliwości i ilości niektórych bakterii, odróżnienie struktur komórkowych bez barwienia

UV:

- źródło światła - lampa kwarcowo-rtęciowa

- soczewki kwarcowo-fluorytowe przepuszczają tylko promieniowanie UV

- większa rozdzielczość

• obrazy rejestrowane na kliszy fotograficznej

- nieoptyczny (elektronowy) - wykonanie bardzo cienkich skrawków materiałów biologicznych za pomocą ultramikrokonu, wyposażonego w noże szklane lub diamentowe; skrawki impregnowane solami metali ciężkich (cieniowane), co pozwala uzyskać obraz 3D; obraz oglądany na ekranie fluoryzującym lub rejestrowany na kliszy; powiększenie do kilku milionów razy; rodzaje:

skaningowy:

- strumień elektronów nie przenika przez preparat, a jedynie go „omiata”

- obraz przestrzennej budowy drobnoustrojów

- zastosowanie - obserwacja morfologii bakterii i ich wnikania do komórek makroorganizmów

transmisyjny:

- umożliwia obserwację struktury, zależności krystalograficznych (tworzenie obrazu dyfrakcyjnego z wybranego obszaru próbki), obserwację próbki „na wskroś”

- rejestruje elektrony przechodzące przez próbkę.

2. Mikroskop świetlny zwykły:

- budowa:

układ mechaniczny - rewolwer, statyw, tubus, śruba makrometryczna (szukanie obrazu), śruba mikrometryczna (ustawienie ostrości obrazu), podstawa, śruba przesuwu preparatu

układ optyczny:

- obiektyw - zbiera światło wychodzące z przedmiotu; tworzy jego powiększony obraz; rodzaje obiektywów:

suche (powietrzne) - powiększają do 60x; przestrzeń robocza wypełniona jest powietrzem i promienie świetlne po przejściu przez preparat wchodzą do ośrodka optycznie rzadszego, w którym ulegają załamaniu i rozproszeniu → część z nich nie trafia więc do soczewki obiektywu, co powoduje, że obraz mikroskopowy nie jest wyraźny

immersyjne (zanurzeniowe) - przestrzeń roboczą wypełnia ciecz immersyjna (współczynnik załamania światła zbliżony do szkła), a promienie świetlne po wyjściu z preparatu trafiają do ośrodka o współczynniku załamania światła zbliżonym do szkła → nie następuje rozproszenie promieni świetlnych (wszystkie promienie trafiają do soczewki), a powstały obraz jest jasny i wyraźny

- okular - powiększa obraz z obiektywu

- kondensor z przesłoną - skupia wiązki promieni świetlnych

- układ oświetleniowy

- powiększenie:

obliczanie powiększenia: powiększenie = powiększenie okularu x powiększenie obiektywu

maksymalne możliwe powiększenie - 2500x (obiektyw 100x, okular 25x)

- umożliwia obserwację drobnoustrojów głównie w postaci zabitej i barwionej

- barwienie proste pozwala na ocenę kształtu, wielkości i ułożenia drobnoustrojów

- korzystając ze specjalnych technik barwienia można zaobserwować dodatkowe struktury:

rzęski - przy pomocy kwasu taninowego, który osadza się na powierzchni rzęsek i czyni je bardziej widocznymi

otoczki

przetrwalniki

ziarna wolutynowe.

3. Ocena morfologii drobnoustrojów:

- ocena morfologii komórki (przy użyciu mikroskopu):

wynik barwienia (metoda Grama - Gram+ [fioletowe] i Gram- [różowe])

kształt komórki:

- kulisty (ziarniaki; Coccus) - np. Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus

- spiralny:

• krętki (Spirochetae; kształt skręcony, ściśle zwinięte sprężynki; od śrubowców różnią się tym, że mają giętką ścianę komórkową; posiadają ciasne, spiralne owinięcie rzęsek dookoła „cylindra protoplazmatycznego”; cylinder i rzęski otoczone są osłonką zewnętrzną) - np. Treponema pallidum, Borrelia spp.

• śrubowce (Spirilla; kształt falisty, spiralny, litery S) - np. Spirillum minus

• przecinkowce - np. Vibrio cholerae

- cylindryczny:

pałeczki (Coccobacillus; pojedyncze, pary, skupiska) - np. Salmonella typhi, Escherichia coli, Yersinia pestis (pałeczka dżumy)

laseczki (długość ich komórki jest dużo większa niż szerokość) - np. Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Corynebacterium diphteriae (maczugowiec błonicy), Lacdobacillus acidophilus

- pleomorficzny

wielkość komórek - wirusy < bakterie (zwykle 0,4-1 μm szerokości i 0,5-10 μm długości; widoczne przy powiększeniu 100x; występują w jednym, określonym kształcie) < grzyby (widoczne przy powiększeniu 40x; mogą przybierać różne kształty)

układ komórek:

- jedna płaszczyzna podziału - dwoinki (pary), łańcuszek (paciorkowce, np. Streptococcus pyogenes; niektóre laseczki)

- dwie płaszczyzny podziału - tetrada (czworaczki; np. Micrococcus spp.)

- trzy płaszczyzny podziału - pakietowiec (sześcianka; Sarcina)

- nieregularne ugrupowania - np. Staphylococcus aureus

układ, obecność i ułożenie rzęsek; typy urzęsienia:

- jednorzęse - monotricha (V. cholerae)

- dwurzęse - ditricha (C. jejuni)

- czuborzęse - lofotricha (H. pylori)

- dwubiegunowe - amfitricha (Spirillum spp.)

- wkołorzęse - peritricha (Salmonella spp.)

- nietypowe (Mobiluncus spp.)

- bezrzęse - atricha (większość ziarnikaów)

obecność otoczki - wykrywanie przy pomocy barwienia pozytywnego/negatywnego

obecność ciał zapasowych

obecność, kształt, wielkość i ułożenie przetrwalników (endospor):

- centralne (środkowo)

- paracentralne (przyśrodkowo)

- subterminalne (podbiegunowo)

- terminalne (biegunowo)

- ocena morfologii kolonii (bez użycia mikroskopu).

BARWIENIE KOMÓREK DROBNOUSTROJÓW

1. Typy preparatów:

- świeże (przyżyciowe) i utrwalone

- barwione i niebarwione

- bezpośrednie (np. z materiału klinicznego; oprócz drobnoustrojów widoczne jest też tło) i pośrednie (z hodowli; widoczne są jedynie drobnoustroje).

2. Barwienie:

- bakterie prawie nie załamują światła, dlatego aby je uwidocznić należy użyć barwnych związków chemicznych

- jest procesem drastycznym i prowadzi do śmierci komórki (z wyjątkiem preparatów przyży6ciowych, gdzie stosuje się duże rozcieńczenie barwnika, aby delikatnie zabarwić komórki bez ich zabijania)

- cel barwienia:

wykazanie obecności bakterii w preparacie

ocena morfologii, układu przestrzennego i sposobu barwienia drobnoustrojów

przy zastosowaniu specjalnych technik barwienia można dodatkowo wykazać obecność rzęsek, otoczek, przetrwalników, ciał wolutynowych

3. Preparaty przyżyciowe:

- barwi się żywe drobnoustroje

- rzadko stosowane ze względu na powolne wnikanie barwników

- zastosowanie - obserwacja ruchliwości, żywotności (odróżnienie komórek żywych od martwych), sposobu rozmnażania, czasami do wykrywania substancji zapasowych; najczęściej stosowane do obserwacji drożdży i pleśni (ze względu na ich budowę i rozmiar), natomiast u bakterii służy jedynie do oceny ruchliwości

- barwienie przyżyciowe:

polega na wprowadzeniu do żywych komórek nietoksycznego barwnika o dużej kontrastowości i w dużym rozcieńczeniu

wykonywane na szkiełku podstawowym (w kropli spłaszczonej) lub na szkiełku z wgłębieniem (tzw. komora Lindnera, w kropli wiszącej; obserwacja w ciemnym polu widzenia)

barwienie w kropli spłaszczonej:

- przygotowanie szkiełka podstawowego - odtłuszczenie (chemiczne, np. przy użyciu alkoholu; fizyczne - poprzez opalenie)

- nałożenie bakterii (wykonanie rozmazu) - kropla 0,85% NaCl + 1 kolonia bakteryjna (w przypadku podłoża płynnego - jedno oczko ezy)

- umieszczenie (obok kropli zawiesiny drobnoustrojów) kropli barwnika, zmieszanie obu kropli ezą

- przykrycie szkiełkiem nakrywkowym.

4. Przygotowanie i barwienie preparatu utrwalonego:

- przygotowanie szkiełka podstawowego (odtłuszczenie)

- nałożenie bakterii i wykonanie rozmazu

- wysuszenie rozmazu (na „powietrzu”, preparat musi wyschnąć samoistnie)

- utrwalenie (poprzez przeciągnięcie preparatu 3x w płomieniu palnika); cel:

zabicie drobnoustrojów

przygotowanie do barwienia (denaturacja białek)

przyklejenie drobnoustrojów do szkiełka

- typy barwienia:

negatywne:

- barwienie tła

- preparaty nie utrwalone

- zastosowanie barwników grubodyspersyjnych, które nie przenikają do komórek (nigrozyna, tusz chiński, czerwień kongo)

- ciemne tło, jasne drobnoustroje

pozytywne - barwienie komórek, tło pozostaje bezbarwne:

- proste - zastosowanie jednego barwnika

- złożone - kilka barwników, odbarwiacze (np. alkohol), bejce (ułatwiają zatrzymanie barwnika w komórce)

negatywno-pozytywne:

- barwienie elementów komórki bakteryjnej i tła

- zastosowanie - obserwacja otoczek, przetrwalników (przetrwalniki i tło ulegają zabarwieniu, natomiast komórka pozostaje bezbarwna)

• metody barwienia:

Nazwa metody	Wynik
barwienie proste pozytywne
metoda Löfflera	jednolite niebieskie zabarwienie (wyjątek - Corynebacterium; zabarwione nierównomiernie)
barwienie safraniną	jednolite czerwone zabarwienie
barwienie proste negatywne
barwienie nigrozyną	tło ciemne drobnoustroje niezabarwione
barwienie złożone pozytywno-negatywne
metoda Burri-Ginsa	ciemne tło jasne otoczki (uwidocznienie otoczek) czerwone komórki bakteryjne
metoda Dornera	ciemne tło czerwone przetrwalniki
barwienie złożone pozytywne
metoda Grama	Gram(+) - fioletowe Gram(-) - czerwone/różowe Gram-chwiejne - czerwono-fioletowe (np. Corynebacterium)
metoda Neissera	komórki bakterii żółto-zielone ziarna metachromatyczne (Babesa-Ernst'a) granatowe
metoda Waysona (barwienie preparatów bezpośrednich)	komórki bakterii ciemnogranatowe inne komórki (nabłonki, leukocyty) jasnofioletowo-granatowe
metoda Wirtza-Conklina	komórki bakterii czerwone przetrwalniki zielone (metoda barwienia przetrwalników)
barwienie złożone pozytywne - metody barwienia bakterii kwasoopornych
metoda Ziehl-Neelsena	bakterie kwasooporne (np. prątki) czerwone tło i pozostałe bakterie niebieskie
metoda Kinyoun-Gabett'a	efekt barwienia j.w.
metoda Kinyoun	bakterie kwasooporne czerwone tło i pozostałe bakterie zielone

- barwienie metodą Grama:

różna barwliwość zależy od składu chemicznego komórek bakteryjnych

bakterie Gram(+) zawierają kwasy tejchojowe oraz rybonukleinian magnezu połączony z białkiem; fiolet krystaliczny, po połączeniu z rybonukleinianem magnezu i jodem z płynu Lugola tworzy nierozpuszczalny w alkoholu związek - p-jodorozanilinę; jod wiąże się ze ścianą komórkową i nie jest wypłukiwany odbarwiaczem

bakterie Gram(-) mają inną budowę chemiczną i dlatego barwniki wypłukiwane są alkoholem z komórek; w dalszym etapie komórki przyjmują barwnik dodatkowy - fuksynę (w celu wybarwienia bakterii Gram(-))

etapy:

- przygotowanie i utrwalenie preparatu

- fiolet krystaliczny (2-3 minuty)

- płyn Lugola (1-2 minuty)

- odbarwienie roztworem alkoholu (30-60 sekund)

- fuksyna zasadowa (30-60 sekund)

właściwości grup w reakcji na barwienie metodą Grama:

- większość ziarenkowców to bakterie Gram(+)

- większość pałeczek to bakterie Gram(-)

- wszystkie laseczki i grzyby to są Gram(+)

- przecinkowce i Spirillum spp. są w większości Gram(-)

- krętki - nie barwią się przy pomocy metody Grama

METODY HODOWLI DROBNOUSTROJÓW

1. Pożywki (podłoża) - płynne, półpłynne lub stałe mieszaniny związków chemicznych, w których (na których) namnażają się drobnoustroje.

Cechy charakterystyczne pożywki:

- odpowiednia zawartość substancji odżywczych:

źródło węgla - najczęściej glukoza

źródło azotu - np. związki organiczne

sole mineralne

- odpowiednie pH:

acidofile (pH ≤ 5,4) - Lactobacillus spp., grzyby

neutrofile (pH 5,4-8,5) - większość bakterii ma optimum pH w granicach 7

alkalofile (pH > 8,5-11,5) - Vibrio cholerae

- klarowna i jednorodna - wszystkie substancje powinny być rozpuszczalne

- jałowa.

2. Podział:

- ze względu na konsystencję:

płynne

półpłynne (0,5-1% agaru)

stałe (1,5-3% agaru lub 12-15% żelatyny)

pożywki zestalać można nie tylko agarem, ale również żelatyną, lecz jest ona rzadko wykorzystywana w diagnostyce mikrobiologicznej ze względu na temperaturę zestalenia (w standardowej temperaturze hodowli drobnoustrojów pożywka z żelatyną jest płynna)

- ze względu na zawarte substancje (skład):

syntetyczne - wyłącznie związki chemiczne, całkowicie znany skład chemiczny pożywki

półsyntetyczne - na bazie substancji chemicznych + dodatek składników naturalnych; znany skład tylko związków nieorganicznych

naturalne - owoce i warzywa oraz ich wyciągi, krew, wyciągi mięsne; nieznany skład ilościowy i jakościowy (lub znany w przybliżeniu)

- ze względu na ilość i jakość składników odżywczych:

proste (podstawowe) - dla organizmów o niskich wymaganiach odżywczych; np. woda peptonowa, agar zwykły

złożone (wzbogacone) - dla organizmów o zwiększonych wymaganiach odżywczych; np. bulion mózgowo-sercowy (BMI), agar z krwią baranią

wybiórczo-namnażające (wybiórcze) - zawierające składniki hamujące wzrost niektórych gatunków drobnoustrojów i stwarzające korzystne warunki rozwoju innym gatunkom; np. bulion z żółcią (hamowanie większości drobnoustrojów, poza Salmonella spp.)

wybiórczo-różnicujące (różnicujące) - rosną na nich wybrane bakterie, które dodatkowo są różnicowane na drodze właściwości biochemicznych (np. podłoże Chapmana, MacConkey'a MCA) - umożliwiają określenie swoistych cech biochemicznych gatunku drobnoustrojów; składają się z podłoża odżywczego, substratu dla bakterii, wskaźnika, czasem zbiornika na gaz (w podłożach płynnych)

specjalne - hodowla drobnoustrojów „wybrednych”, o specjalnych wymaganiach wzrostowych; często zawierają węglowodany, witaminy, antybiotyki, krew poddaną lizie, surowicę końską; np. agar czekoladowy, podłoże Löfflera, podłoże Löwensteina-Jensena, bulion z tioglikolanem sodu

transportowe - umożliwiają przeżycie drobnoustrojów w czasie transportu (zawierają odpowiednie sole mineralne i bufory zapewniające żywotność drobnoustrojów obecnych w materiale)

transportowo-namnażające - ich skład chemiczny umożliwia namnażanie się bakterii w czasie transportu.

3. Charakterystyka wybranych podłoży:

- podłoże Chapmana:

wybiórczo-różnicujące dla gronkowców

czynnik wybiórczy - 7,5% NaCl (hamuje wzrost większości drobnoustrojów; poza gronkowcami na podłożu tym czasami rosną Bacillus i inne)

czynnik różnicujący - mannitol

gronkowce rozkładające mannitol powodują zmianę zabarwienia pożywki (różowy żółty), ponieważ środowisko ulega zakwaszeniu

mannitolo(+) - S. aureus; mannitolo(-) - S. Epidermidis

- podłoże MacConkey'a (MCA):

wybiórcz-różnicujące podłoże dla pałeczek Gram(-)

czynniki wybiórcze - dezoksycholan sodu, fiolet krystaliczny (hamują wzrost bakterii Gram(+) oraz szczególnie wymagających Gram(-))

czynnik różnicujący - laktoza (bakterie rozkładające laktozę tworzą różowo zabarwione kolonie; czasem obserwuje się dodatkowo rozkład dezoksycholanu sodu - wytrąca się kwas dezoksycholowy, co obserwuje się w postaci „mgiełki”, zmętnienia)

laktozo(+) - E. coli; laktozo(-) - Proteus vulgaris, Salmonella (bakterie laktozo(-) rosną w postaci przezroczystych kolonii)

- DCA (podłoże z azydkiem sodu):

wybiórczo-różnicujące podłoże dla paciorkowców kałowych Enterococcus spp.

czynniki wybiórcze - azydek sodu (pozwala na wzrost paciorkowców kałowych), 6,5% NaCl, żółć (hamują wzrost pozostałych drobnoustrojów)

czynnik różnicujący - eskulina; Enterococcus rozkładają eskulinę do eskuletyny (widoczne jest to w postaci zaczernienia podłoża); na podłożu tym rośnie także Staphylococcus, ale nie powoduje rozkładu eskuliny

- PYA (podłoże z cetrymidem):

wybiórczo-namnażające podłoże dla Pseudomonas

czynnik wybiórczy - cetrymid (hamuje wzrost bakterii Gram(+) i większości Gram(-), a nie hamuje wzrostu i wytwarzania barwników przez Pseudomonas spp.)

charakterystyczny zapach (kredki świecowe, jaśminowiec) spowodowany wytwarzaniem trimetyloaminy

różne gatunki Pseudomonas mogą wytwarzać różne barwniki (od żółtozielonego do brązowego)

- podłoże Sabouranda:

wybiórcze podłoże dla grzybów

obniżone pH, dodatek antybiotyków (cykloheksymid, gentamycyna, chloramfenikol)

- agar czekoladowy:

zawiera łagodnie zhemolizowaną krew (zagotowanie agaru z krwią; następuje uwolnienie czynników wzrostowych z krwinek - X (hemina) i V (NAD))

podłoże dla Haemophilus spp., Neisseria spp.

- podłoże Löfflera:

specjalne podłoże dla Corynebacterium diphteriae

zawiera świeżą surowicę końską

- podłoże Löwensteina-Jensena:

podłoże dla M. tuberculosis

zawiera zieleń malachitową, która hamuje wzrost innych drobnoustrojów

- podłoże z tioglikolanem sodu:

dla hodowli bakterii beztlenowych

tioglikolan sodu i cysteina obniżają potencjał oksydacyjno-redukcyjny i utrzymują warunki beztlenowe

zawiera także heminę i witaminę K (niezbędna do wzrostu niektórych niesporujących bakterii beztlenowych).

4. Hodowla (kultura):

- pożywka wraz z rozwijającymi się w niej (na niej) drobnoustrojami

- podział:

monokultura (czysta hodowla) - zawiera drobnoustroje jednego gatunku

mieszana - zawiera drobnoustroje z różnych gatunków

- odróżnienie hodowli czystej od mieszanej - na podstawie morfologii kolonii

- warunki hodowli:

odpowiednia atmosfera:

- bezwzględne tlenowce - atmosfera tlenowa (normalne warunki hodowli)

- mikroaerofilne - pojemniki z generatorami chemicznymi (najczęściej w formie woreczków z substancją pochłaniającą nadmiar O₂), cieplarki z CO₂

- beztlenowce - anaerostaty z pompą próżniową, pojemniki z generatorami chemicznymi (np. GasPak), bulion z tioglikolanem sodu

temperatura inkubacji:

- termormofile - hipertermofile, termofile właściwe; w gnijących resztkach, sianie, gorących źródłach; np. Thermococcus spp.

- mezofile - np. E. coli

- psychrofile - bakterie z dna oceanów itp.; np. Flavibacterium spp.

5. Wzrost drobnoustrojów na podłożach płynnych ma postać:

- jednolitej zawiesiny (wzrost dyfuzyjny) - względne beztlenowce (np. E. coli)

- kożuszka lub błonki - bezwzględne tlenowce (np. Micrococcus spp., Pseudomonas spp.)

- osadu - bezwzględne beztlenowce; przy ich hodowli probówkę należy dodatkowo zalepić parafiną (np. Clostridium spp.)

- w pewnym oddaleniu od powierzchni - mikroaerofile (do 5% tlenu; np. Helicobacter pylori).

6. Wzrost drobnoustrojów na podłożach stałych (płytki, skosy, słupki)

- na podłożach stałych na płytkach drobnoustroje tworzą kolonie:

kolonia - widoczne gołym okiem skupiska komórek, rozwijające się najczęściej z pojedynczej komórki; na agarze skośnym i w słupkach drobnoustroje nie tworzą kolonii ze względu na zbyt małą powierzchnię

ocena morfologii kolonii - wymiar, kształt, barwa, wyniosłość, powierzchnia, struktura, brzegi, przezroczystość, zawieszalność w płynach (ocena czy dana kolonia daje się zawiesić, czy nie), zapach, inne (np. typ hemolizy na agarze z krwią)

CFU (Colony Forming Unit) = tkj (tworzące kolonie jednostki (jednostka wzrostowa (komórki bakteryjne pochodzące z jednej komórki wyjściowej - jednostka taka, mnożąc się na podłożu stałym, wytworzy pojedynczą kolonię)

- agar skośny - drobnoustroje mogą rosnąć:

wzdłuż linii posiewu

na całej powierzchni skosu (bakterie ruchliwe lub wydzielające dużo śluzu)

brak pojedynczych kolonii

- hodowle słupkowe - ocena:

ruchliwości (drobnoustroje nieruchliwe - wzrost tylko w miejscu wkłucia; drobnoustroje ruchliwe - zmętnienie wokół wkłucia)

upłynnienia żelatyny (enzym - żelatynaza)

...................................

7. Hemoliza - zależy od stopnia lizy komórek:

- typ α - częściowa liza wokół kolonii - liza błony erytrocytów (zielone zabarwienie wokół kolonii); hemoglobina przekształca się w metHb; np. S. pneumoniae

- typ β - całkowita liza komórek wokół kolonii (widoczne przejaśnienie wokół kolonii); np. S. pyogenes

- typ γ - brak hemolizy; np. S. epidermidis.

8. Posiew - przeniesienie drobnoustrojów z hodowli lub badanego materiału do jałowej pożywki.

Posiew redukcyjny - posiew z izolacją w celu uzyskania pojedynczej kolonii.

9. Identyfikacja biochemiczna - badanie metabolizmu drobnoustrojów:

- metody biochemiczne umożliwiają zidentyfikowanie gatunków drobnoustrojów na podstawie znajomości wybranych komórkowych produktów przemian metabolicznych (katabolity - produkty rozpadu; anabolity - produkty syntezy)

- ocena cech biochemicznych:

odpowiednie podłoże odżywcze - zawiera określony substrat i wskaźnik wykazujący rozkład/brak rozkładu (np. Chapman, MCA); nie wystarcza do identyfikacji drobnoustrojów

szeregi biochemiczne - kilka/kilkanaście pożywek w probówkach, służących do wykrywania pojedynczych cech badanego szczepu (np. test IMVC [wytwarzanie indolu, reakcja z czerwienią metylową, reakcja Voges-Proskauera, test z cytrynianem sodu] - obecnie stosowany tylko dla Salmonella i Shigella w Sanepidzie); zasada - rozkład/brak rozkładu konkretnego związku (np. test z wytwarzaniem indolu)

gotowe testy chromogenne - w formie plastikowych szablonów z rzędem zagłębień, na dnie których znajdują się wysuszone/odwodnione preparaty; w wyniku rozkładu substratu powstaje barwny produkt; odczyt wizualny lub komputerowy

chromatografia gazowo-cieczowa - najczęściej wykorzystywana wyłącznie do badań naukowych ze względu na koszty; pozwala wykrywać śladowe ilości produktów metabolicznych; do identyfikacji beztlenowców

inne metody - np. VITEK2 Compact:

- identyfikacja i oznaczanie lekowrażliwości

- wyniki uzyskiwane w ciągu 5-10h (pałeczki Gram(-), ziarniaki Gram(+), Neisseria, Haemophilus, Corynebacterium, bakterie beztlenowe) lub 18h (drożdżaki)

- pełna automatyzacja.

METODY HODOWLI I IDENTYFIKACJI GRZYBÓW.

WYKRYWANIE I ILOŚCIOWE OZNACZANIE

W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH PLEŚNI I DROŻDŻY

1. Diagnostyka mykologiczna:

- mikroskopia:

obserwacja komórek i zarodników

preparat mokry, w kropli NaCl, najczęściej niezabarwiony

barwienie metodą Grama - głównie w diagnostyce drożdży (formy nieregularne); grzyby nie są Gram(+), ponieważ ich ściana komórkowa nie posiada peptydoglikanu, ale barwią się tak, jak bakterie Gram(+), czyli na kolor fioletowy

preparat barwiony metodą negatywną - głównie w celu wykrywania otoczki

preparaty bezpośrednie:

- blastospory - spory wytwarzane przez grzyby w drodze pączkowania

- postać inwazyjna - z niektórych blastospor wystają wypustki cytoplazmatyczne (ich obecność zawsze świadczy o zakażeniu)

- hodowla:

izolacja prowadząca do powstania monokultury

ocena makroskopowa morfologii kolonii na podłożu stałym

podłoże klasyczne - podłoże Sabourauda:

- podstawowe podłoże do hodowli grzybów

- niskie (kwaśne) pH

- antybiotyki - chloramfenikol, gentamycyna

podłoża różnicujące:

- do wykrywania chlamydosporów (grubościenne zarodniki przetrwalnikowe powstające ze strzępek grzybni, w wyniku wytworzenia się grubych ścian komórkowych) - podłoże Nickersona

- do wykrywania chlamydosporów i pseudogrzybni - podłoże PCB (ziemniaczano-marchwiowo-żółciowe)

mikrohodowle szkiełkowe:

- w bloczku agaru Sabourauda na szkiełku podstawowym

- głównie w diagnostyce grzybów pleśniowych i nitkowatych, niektórych drożdży

- identyfikacja drożdży:

kryteria:

- cechy morfologiczne kolonii - barwa, czas wzrostu, kształt blastospor, tworzenie artrospor (komórki o charakterze zarodników przetrwalnikowych występujące u nitkowatych form sinic i u niektórych glonów)

- cechy biochemiczne:

+ podłoża selektywne - ChromAgar Candida, Candi Selected 4

+ testy biochemiczne

test filamentacji:

- zdolność wytwarzania charakterystycznych wypustek w surowicy lub innych płynach ustrojowych

- wytwarzane po 1-3 h inkubacji w temperaturze 37^oC badanej kolonii z surowicą króliczą lub ludzką

- wynik dodatni - szczepy C. albicans i C. dubliniensis (te ostatnie bardzo rzadko powodują zakażenia)

chlamydospory:

- podłoża zubożałe - agar ryżowy z Tween80 lub podłoże kukurydziane (corn meal agar)

- inkubacja w 25 lub 30^oC; po 24-48h mikrohodowlę ogląda się w mikroskopie świetlnym pod małym powiększeniem

- podłoże RAT-medium

- antymikrogram.

2. Pleśnie - grzyby nitkowate:

- wytwarzają grzybnię (mycelium) złożoną z rozgałęzionych komórek (strzępek - hyphae); u grzybów niższych strzępki są jednokomórkowe, zwykle wielojądrowe, natomiast u grzybów wyższych są podzielone poprzecznymi przegrodami (septami), a każda oddzielna komórka ma jedno jądro

- typy grzybni:

powietrzna - rozwija się na powierzchni podłoża, często w formie puchu lub pleśni

substratowa (pożywkowa) - grzybnia wnikająca w podłoże

- dla większości optymalna temperatura mieści się w zakresie 18-22^oC (mała odporność na podwyższoną temperaturę - giną >60-70^oC; przeżywają tylko zarodniki), pH 5-6

- rosnąc powierzchniowo na podłożach mogą korzystać z dużych ilości tlenu " szybsze przyswajanie substancji odżywczych z podłoża.

3. Pleśnie w żywności:

- pleśnie wykorzystywane w produkcji żywności - niektóre gatunki grzybów są stosowane do produkcji enzymów proteolitycznych, amylolitycznych, celulolitycznych i innych, a także do produkcji kwasów organicznych (np. cytrynowego, glukonowego) i serów pleśniowych:

kwas cytrynowy - Aspergillus niger

enzymy - Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma i inne

żywność orientalna (sosy sojowe) - Aspergillus flavus-oryzae

sery pleśniowe - Penicillium roqueforti, P. camemberti.

- pleśnie niepożądane w żywności:

wzrost pleśni na produktach żywnościowych wywołuje niekorzystne zmiany (barwne naloty na powierzchni, mięknięcie, powstawanie śluzów, upłynnienie produktu)

rozwijają się na produktach suchych przechowywanych w wilgotnych warunkach oraz na produktach o bardzo dużym stężeniu cukru lub soli

w psuciu żywności biorą udział przedstawiciele różnych klas:

- Zygomycetes:

rodzaj Rhizopus i Mucor - szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, powodują psucie różnego rodzaju produktów żywnościowych (np. miękką zgniliznę owoców i warzyw, psucie mięsa przechowywanego w chłodni)

Rhizopus rozwija się często na chlebie (pleśń chlebowa)

najczęściej występują M. mucedo i R. nigricans

- Ascomycetes:

rodzaj Aspergillus:

- najważniejsze znaczenie ma A. glaucus o szarozielonej barwie kolonii - powoduje psucie produktów suchych, a także o wysokiej zawartości cukru lub soli

- A. niger - tworzy czarne kolonie, jest przyczyną ciemnych plam na chlebie, warzywach, owocach

rodzaj Penicillium:

- kolonie o barwie niebieskiej, niebieskoszarej lub szarozielonej

- powoduje miękką zgniliznę owoców cytrusowych, psucie mięsa i jaj przechowywanych w chłodniach, pleśnienie serów, chleba i innych artykułów

Penicillium spp. i Aspergillus spp. zalicza się do tzw. pleśni magazynowych (rozwijają się na ziarnie zbożowym podczas przechowywania, powodując jego psucie oraz obniżenie wartości technologicznej i siewnej)

wiele szczepów wytwarza związki toksyczne - mykotoksyny:

- aflatoksyny - wytwarzane głównie przez A. flavus

- ochratoksyny - wytwarzane głównie przez A. ochraceus

- Deuteromycetes:

rodzaj Geotrichum:

- należy tu pleśń mleczna (Geotrichum lactis) będąca szkodnikiem produktów mleczarskich (rośnie na nich w postaci białego meszku; wykorzystując kwas mlekowy podwyższa pH, umożliwiając rozwój niepożądanych bakterii)

- przyczyna psucia chleba, owoców cytrusowych i mięsa przechowywanego w chłodni

rodzaj Monilia (Neurospora) - tworzy luźną, różowo zabarwioną grzybnię i często rozwija się na chlebie

rodzaje Cladosporium, Alternaria, Stemphylium - przyczyna ciemnienia lub powstawania czarnych plam na ziarnie, owocach, warzywach, mięsie, jajach

rodzaj Fusarium (czerwona pleśń) - powoduje psucie różnych produktów; gatunki tego rodzaju mogą wytwarzać mykotoksyny (np. zearalenon, grupa trichotecenów).

4. Wykrywanie pleśni:

- preparat mikroskopowy - najczęściej przyżyciowy w kropli spłaszczonej

- hodowla:

podłoża płynne

agar z brzeczką (półprodukt stosowany przy produkcji piwa lub miodu pitnego)

agar ziemniaczany

podłoże Chapka (brak wzrostu Rhizopus)

cechy morfologiczne kolonii obserwuje się zwykle do 2-3 tygodni

- oznaczanie liczby pleśni:

metoda zalewowa - nanoszenie płynnego rozcieńczenia na płytkę, a następnie zalanie jej płynnym podłożem

oznaczenie liczby pleśni należy wykonać tylko z jednego rozcieńczenia, z którego wyrosło ≤100 kolonii.

5. Drożdże:

- ok. 1500 gatunków, z czego kilkanaście wykorzystuje się w procesach biotechnologicznych

- jednokomórkowce; rozmnażają się głównie przez pączkowanie

- optymalna temperatura wzrostu 20-30^oC przy pH 5-6

- tlenowce; w warunkach beztlenowych przeprowadzają fermentację alkoholową, która polega na beztlenowym rozkładzie cukrów prostych oraz niektórych dwu- i trójcukrów na alkohol etylowy i CO₂:

C₆H₁₂O₆ 2CH₃CH₂OH + 2CO₂ + 117 kJ (28 kcal)

- specyficzny składnik cytoplazmy - wolutyna (ziarnistości metachromatyczne, zapasowe źródło fosforanów; gromadzą się w komórkach podczas fermentacji, często brakuje ich w szybko rozmnażających się drożdżach

- w środowisku zasobnym w cukier mogą gromadzić glikogen (zużywany po wyczerpaniu węglowodanów

- wytwarzają także tłuszcze

- podział:

drożdże szlachetne - stosowane w przemyśle fermentacyjnym:

- piekarskie - Saccharomyces cerevisiae

- paszowe - S. cerevisiae, Candida utilis, C. tropicalis, C. plucherrima, Rhodotorula

- gorzelnicze - S. cerevisiae

- winiarskie - S. cerevisiae, S. ellipsoideus

- browarnicze - S. cerevisiae, S. carlsbergensis

drożdże dzikie - szkodniki w przemyśle fermentacyjnym i przetwórstwie żywności; zanieczyszczenia:

- przemysł winiarski:

najczęściej drożdże są oporne na wysokie stężenia SO₂ (używany często do konserwacji moszczów owocowych - sulfitacja moszczów)

przy dostępie tlenu rozwijają się Candida spp. i Pichia spp., które przeprowadzają przemianę etanol kwas octowy ester etylooctowy (zjełczały zapach wina)

mogą być przyczyną śluzowacenia i drożdżowego posmaku win

Pichia spp. i Kloeckera spp. biorą udział w przemianach związków siarki w winach, co w obecności etanolu sprzyja tworzeniu merkaptanów (nadają winom ostry, nieprzyjemny zapach)

- browarnictwo:

Torulopsis, Pichia, Hansenula, Candida, Saccharomyces, Kloeckera

jedna z przyczyn mętnienia i drożdżowego posmaku piwa

zakażenie ograniczone dużym stężeniem alkoholu etylowego

w zacierach fermentacyjnych spotyka się głównie C. mycoderma (ma zdolność rozkładu etanolu do CO₂ i H₂O zmniejszenie stężenia alkoholu w piwie)

• przemysł piekarniczy - C. mycoderma (walka z nimi jest trudna, gdyż przyrost ich masy w trakcie produkcji następuje równocześnie z rozwojem drożdży piekarniczych; powodują obniżenie siły pędnej drożdży piekarniczych)

- drożdże killerowe - produkują toksyny białkowe lub glikoproteinowe, które zabijają wrażliwe komórki drożdży tego samego lub innego gatunku

- drożdże osmofilne:

zdolność do wzrostu przy dużych stężeniach glukozy (60%)

rozwijają się na produktach o niskiej A_w (aktywność wody; minimum wody niezbędne dla rozwoju drobnoustrojów - czysta chemicznie woda ma wartość A_w = 1)

powodują psucie miodu, dżemu, syropów owocowych, soków

rozwijają się w marynatach i solankach (np. S. rouxi, S. mellis)

- inne drożdże niepożądane w żywności:

na osłonkach wędlin przechowywanych w lodówce - kredowe naloty

drożdże kożuchujące - psucie kiszonek

gatunki o właściwościach lipolitycznych - plamy na maśle i margarynie.

6. Wykrywanie drożdży:

- badanie mikroskopowe:

preparat bezpośredni - jeżeli badany materiał jest suchy (np. nalot na wędlinie) przed wykonaniem preparatu należy go rozetrzeć w 0,9% NaCl

preparat pośredni - np. połączony z barwieniem metodą Grama (drożdże są Gram(+))

preparat przyżyciowy niezabarwiony - najczęściej

barwienie przyżyciowe - oznaczenie żywotności ,wykrywanie substancji zapasowych

- hodowla:

podłoże płynne

agar z brzeczką

agar ziemniaczany

specjalne podłoża ubogie w składniki odżywcze (np. McClavy).

7. Ocena właściwości drożdży:

- ocena żywotności drożdży:

oznaczanie % zawartości martwych komórek:

X = b · 100 / (a+b)

normy w drożdżach piekarskich:

- drożdże prasowane ≤5% martwych komórek

- drożdże suszone ≤25% martwych komórek

- badanie na obecność glikogenu:

z wykorzystaniem płynu Lugola

czerwonobrunatne ziarnistości glikogenu widoczne na tle jasnożółtej cytoplazmy

- badanie na obecność tłuszczu - zabarwienie komórek roztworem Sudanu krople tłuszczu barwią się na granatowo.

8. Cechy morfologiczne i fizjologiczne ważne w identyfikacji drożdży:

- kształt komórek - 6 podstawowych kształtów, często charakterystycznych dla poszczególnych rodzajów (kulisty, elipsoidalny, cytrynkowaty, butelkowaty, cylindryczny, nitkowaty)

- wielkość komórek - pomiar minimum 20 komórek; zwykle 1-8 μm długości i 1-6 μm szerokości

- zdolność do tworzenia:

pseudogrzybni (pseudomycelium) - nitkowate struktury, często rozgałęziające się, złożone wyłącznie z komórek pączkujących lub pojedyncza, nitkowata komórka, mogąca rozgałęziać się, nieposiadająca przegród poprzecznych

grzybni

- zdolność do wytwarzania zarodników:

następuje w warunkach głodowych populacji i jest sposobem na przerwanie niekorzystnych warunków środowiska

najlepiej tworzą się przy małej ilości węglowodanów w podłożu oraz przy dobrym dostępie tlenu

- fermentacja cukrów - posiew na podłoże z dodatkiem 2% badanego cukru

- wykorzystanie azotanu jako źródła azotu - posiew na podłoże zawierające witaminy, ale bez innych źródeł azotu

- wykorzystanie etanolu jako źródła węgla - posiew na podłoże z dodatkiem etanolu

- rozkład tłuszczów.

WIRUSY

1. Wirusy (łac. virus - jad):

- nie posiadają struktury komórkowej

- bezwzględne pasożyty wewnątrzkomórkowe

- DNA lub RNA

- posiadają białka wiążące receptor znajdujący się na powierzchni komórki

- wirion - pojedyncza cząsteczka wirusa

- wirusy powodujące choroby rozprzestrzeniane z żywnością:

Hepatitis A Virus (HAV)

rotawirusy

adenowirusy

kaliciwirusy

astrowirusy.

2. Cechy odróżniające wirusowe choroby pokarmowe od bakteryjnych:

- zatrucie może wywołać obecność kilku cząsteczek wirusowych w żywności; w przypadku bakterii z reguły musi to być wysoka dawka

- duża liczba cząsteczek wirusa jest wydzielana z kałem przez osobę zakażoną; w przypadku bakterii zależy to od rodzaju i gatunku (np. Salmonella nie jest zakaźna dla otoczenia przez człowieka)

- nie mogą namnażać się w produktach żywnościowych i wodzie (muszą mieć gospodarza)

- wirusy pokarmowe są stosunkowo stabilne i kwasooporne poza komórkami żywiciela

- ich obecność w żywności jest trudna do stwierdzenia - zakażone produkty zachowują normalny zapach, wygląd i smak.

3. HAV:

- rodzina Picornaviridae, rodzaj Hepatovirus

- enterowirus typu 72

- właściwości:

oporny na eter, chloroform, kwaśne pH (do 3)

ulega częściowej inaktywacji w temperaturze 60^oC (10 min), całkowitej w 85^oC (5 min) lub 90^oC (90 sek)

inaktywacja także pod wpływem chloraminy

- RNA

- niezróżnicowany antygenowo jeden serotyp (po zachorowaniu odporność trwała)

- droga zakażenia - fekalno-oralna, rzadziej kontakt bezpośredni

- źródło zakażenia - zanieczyszczona woda i żywność:

owoce morza (z wyjątkiem krewetek)

mleko i produkty mleczne (zwłaszcza śmietana)

surowe owoce i warzywa

- wysoce inwazyjny - penetruje przez śluzówkę jelita do wątroby (komórkami docelowymi są hepatocyty), gdzie ulega replikacji:

okres inkubacji 15-50 dni (średnio 28 dni)

objawy penetracji - gorączka, bóle brzucha, nudności, później żółtaczka (możliwe też przypadki bezżółtaczkowe), wzrost aktywności aminotransferaz, powiększenie wątroby

krótkotrwała wiremia

większość zakażeń u dzieci poniżej 6 r.ż. przebiega bezobjawowo lub skąpoobjawowo, natomiast u starszych dzieci i dorosłych 70-80% ma przebieg objawowy

- wydalanie wirusa - zwykle 14-21 dni przed i 7 dni po wystąpieniu żółtaczki; mogą wystąpić nawroty choroby i wtedy wydalanie cząsteczek wirusa może trwać do 90 dni

- prawdopodobnie wiek pacjenta i dawka wirusa są wprost proporcjonalne do nasilenia objawów choroby

- profilaktyka:

przestrzeganie higieny osobistej i sanitarnej

obróbka termiczna półproduktów żywnościowych

unikanie wtórnych zanieczyszczeń gotowych produktów

stosowanie w produkcji tylko wody zdatnej do picia

szczepionka (zawiera inaktywowany formaldehydem wirus HAV) - zalecana u osób narażonych na kontakt z zakażeniem (ryzyko zawodowe, kontakt z osobą zakażoną, częste przyjmowanie zastrzyków, duża liczba partnerów seksualnych)

- diagnostyka zakażeń HAV:

obraz kliniczny - duże znaczenie

metody bezpośrednie - wykrywanie obecności i identyfikacja wirusa, jego antygenów lub kwasu nukleinowego w materiale klinicznym

metody pośrednie - ocena odpowiedzi immunologicznej organizmu na zakażenie (oznaczenie w surowicy przeciwciał anty-HAV w klasie IgM i IgG):

- przeciwciała IgM:

pojawiają się w okresie wylęgania choroby

najwyższe stężenie między 2 a 3 tygodniem ostrego okresu choroby

mogą utrzymywać się do 3-6 miesięcy w typowo przebiegających przypadkach

wykrywanie swoistych IgM - obecne lub niedawno przebyte zakażenie

- przeciwciała IgG:

pojawiają się w ostrym okresie choroby

utrzymują się do końca życia

mają charakter przeciwciał odpornościowych

wykrywanie swoistych IgG (bez IgM) - wskazuje na przebyte zakażenie, lecz bez możliwości określenia czasu

metody biologii molekularnej - RT-PCR (wykrywanie HAV-RNA we krwi lub kale); nie są stosowane w rutynowej diagnostyce.

4. Wirusy wywołujące zapalenie żołądka i jelit (gastroenteritis):

- namnażają się w przewodzie pokarmowym zakażonej osoby, wydalane są z kałem

- źródło zakażenia:

zanieczyszczona żywność i woda

materiały opakowaniowe - papier, wata, aluminium, porcelana, lateks, polistyren

- rotawirusy:

rodzina Reoviridae

RNA

najczęstszy czynnik etiologiczny ostrych biegunek u niemowląt i małych dzieci do 2 r.ż. (grypy żołądkowe)

droga zakażenia - fekalno-oralna, możliwa także kropelkowa

okres inkubacji 1-3 dni; wydalany z kałem przez 4-8 dni

wysoce zakaźne (10-100 wirusów) i wysoce oporne na środki dezynfekcyjne

objawy - wymioty, biegunka, gorączka, bóle brzucha, osłabienie, złe samopoczucie, jadłowstręt; zdarzają się zakażenia bezobjawowe

serotypy - co najmniej 5 (G1-G4, G9)

prawie każde dziecko ulega zakażeniu przed ukończeniem 5 r.ż.

ochronne działanie ma świeże krowie mleko - zawiera zwykle przeciwciała neutralizujące wirusy

leczenie - wyrównanie odwodnienia

profilaktyka:

- przestrzeganie higieny osobistej i sanitarnej

- obróbka termiczna półproduktów żywnościowych

- unikanie zanieczyszczeń wtórnych gotowych produktów

- dostępne szczepionki doustne (poniżej 5 miesiąca życia) - nie na wszystkie serotypy, nieobowiązkowe, niefinansowane

- adenowirusy:

rodzina Adenoviridae

DNA

6 podrodzajów (A-F)

najczęściej zakażenia dróg oddechowych i oczu

serotypy 40 i 41 podrodzaju F wywołują ostre zapalenie żołądka i jelit (głównie u dzieci)

droga zakażenia fekalno-oralna

objawy - wodnista biegunka, wymioty

powikłania - wgłębienie jelit (wsunięcie się jednego odcinka jelita do drugiego, np. końcowego odcinka jelita cienkiego do jelita grubego; może powodować ostrą niewydolność jelit)

czas inkubacji 7-14 dni

właściwości:

- stabilny w pH 6-9

- oporny na niskie stężenia chloru

- łatwo przeżywa w stanie zamrożenia

- ulega inaktywacji w temperaturze 56^oC (10 min)

- diagnostyka rotawirusów i adenowirusów:

wykrycie wirusów w materiale klinicznym nie oznacza zakażenia

mikroskopia elektronowa - nie stosowana rutynowo

w hodowlach komórkowych namnażają się trudno lub wcale (permidywność - nie wszystkie wirusy namnażają się we wszystkich liniach komórkowych; wirus zakaża i replikuje się tylko w takiej linii komórkowej, które zawiera odpowiednie dla niego receptory):

- adenowirusy - np. hodowla komórek z nerki małpy, HeLa

- rotawirusy - np. pierwotna hodowla z małpiej nerki

immunochromatograficzny test do jednorazowego wykrywania w kale rotawirusów i adenowirusów - test jakościowy, którego zasada działania opiera się na wiązaniu specyficznych przeciwciał monoklonalnych (znakowanych substancją barwną) z odpowiednimi wirusami.

---