dr hab. Jarosław Bystroń

Badanie mikrobiologiczne pasz

Wymagania mikrobiologiczne

- wg PN 64 791:1994 dla pasz roślinnych (nie są obligatoryjne, ale zalecane)

1. Bakterie

• ogólna liczba drobnoustrojów tlenowych mezofilnych

- nie więcej niż 3,0 x10⁶/1g

- beztlenowe laseczki przetrwalnikujące (Clostridium sp.)

- niedopuszczalne w 0,0001 g

- tlenowe laseczki przetrwalnikujące (laseczki wąglika)

- niedopuszczalne w 0,1 g

• gronkowce chorobotwórcze - niedopuszczalne pow. 10⁴/1g

- Salmonella spp. - nieobecna w 25 g

2. Drożdże i pleśnie

pasza/surowiec	dopuszczalna liczba drożdży i pleśni w 1 g
mieszanki paszowe	2 x 10^5
premiksy	1 x 10^5
poekstrakcyjne śruty z roślin oleistych	7 x 10^5
inne surowce pochodzenia roślinnego	2 x 10^5

Wymagania mikrobiologiczne dla pasz pochodzenia zwierzęcego (obligatoryjne)

Rozporządzenie Komisji nr 142/2011 z dnia 25 lutego 2011r. - (załącznik XIII, rozdział II) 

I. gryzaki dla psów oraz przetworzona karma

Salmonella

- nieobecna w 25 g,

n = 5, c = 0, m = 0, M = 0;

pałeczki jelitowe (Enterobacteriaceae):

n = 5 c = 2 m = 10

M = 300 jtk/1 g

II. Karma surowa

• Salmonella - nieobecna w 25 g

n = 5, c = 0, m = 0, M = 0;

• Pałeczki jelitowe (Enterobacteriaceae)

n = 5 c = 2 m = 10 jtk/g M = 5 000 jtk/g

n - ilość próbek,

c - liczba próbek, w których liczba bakterii zawiera się między m i M, próbka jest w dalszym ciągu uznawana za zadowalającą, jeżeli liczba bakterii pozostałych próbek jest równa m lub mniej.

m - wartość graniczna liczby bakterii (jeśli wszystkie próbki poniżej m - wynik zadowalający)

M - maksymalna wartość dla liczby bakterii (jeżeli choć jedna próbka = M - wynik niezadowalający)

Metodyka badań mikrobiologicznych

1. Przygotowanie próbek do badań mikrobiologicznych

zgodnie z

• PN-EN ISO 6887-4 - Mikrobiologia żywności i pasz.

Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych.

Część 4: Specyficzne zasady przygotowania produktów innych niż mleko i przetwory mleczne, mięso i przetwory mięsne oraz ryby i przetwory rybne.

Pasze sypkie, twarde

20 g próbki + 180 ml roztworu fizjologicznego soli z peptonem,

Wymieszać, odstawić w temp. pokojowej na 30 min

(jeśli zawiesina jest zbyt gęsta dodać roztwór soli z peptonem,

aż do uzyskania rozcieńczenia 1 : 20), następnie homogenizacja przez 1 min

2. Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów żywych oraz pałeczek jelitowych

zgodnie z

• PN-EN ISO 4833 - Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów. Metoda płytkowa w temp. 30 ⁰C.

• PN-ISO 21528-2 - Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae. Metoda płytkowa.

Schemat oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów żywych oraz pałeczek jelitowych

Wyliczanie liczby drobnoustrojów w 1 g paszy:

Σc

a = ------------- x d

(n1 + 0,1 n2)

Σc - suma liczonych kolonii

n1 - liczba płytek z niższego rozcieńczenia

n2 - liczba płytek z wyższego rozcieńczenia

d - wskaźnik rozcieńczenia (stosujemy z mniejszego).

3. Oznaczanie ogólnej liczby drożdży i pleśni

zgodnie z

• PN-ISO 21527-1 - Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni. Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej wyższej niż 0,95.

• PN-ISO 21527-2 - Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni. Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej niższej niż 0,95.

Jeśli a_w ≥ 0,95

płyn do rozcieńczeń

- 0,1% roztwór wody peptonowej

podłoże DRBC:

agar z dichloranem,

różem bengalskim

i chloramfenikolem

- inkubacja 5 dni, 25 ⁰C

Jeśli a_w < 0,95

płyn do rozcieńczeń

- 0,1% roztwór wody peptonowej

z dodatkiem 20 - 35% glukozy

lub glicerolu

(minimalizacja szoku osmofilnego dla

pleśni kserofilnych i drożdży osmofilnych)

podłoże DG18:

agar z dichloranem,

18% dodatkiem glicerolu

i chloramfenikolem

- inkubacja 5-7 dni, 25 ⁰C

4. Oznaczanie pałeczek Salmonella

zgodnie z

• PN-EN ISO 6579 - Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp.

Oznaczanie obecności pałeczek Salmonella sp. w próbkach żywności obejmuje kilka etapów:

I. Przednamnżanie na wodzie peptonowej

II. Namnażanie selektywne na płynnych pożywkach selektywnych

III. Różnicowanie na podłożach agarowych

IV. Identyfikacja w oparciu o testy biochemiczne i serologiczne

5. Oznaczanie gronkowców koagulazo-dodatnich

• PN-A-82055-9:1994 Mięso i przetwory mięsne. Badania mikrobiologiczne. Wykrywanie obecności liczby Staphylococcus aureus.

• PN-EN ISO 6888-1:2001/A1:2004 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus i innych gatunków). Część 1: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej Baird-Parkera.

• PN-EN ISO 6888-2:2001/A1:2004 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus i innych gatunków). Część 2: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem.

• PN-EN ISO 6888-3:2004/AC:2005 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (S. aureus i innych gatunków). Część 3: Wykrywanie obecności i oznaczanie małych liczb metodą NPL.

Schemat badania (PN-A-820055-9:1994):

1. 20 g próbki + 180 ml wody peptonowej, mieszamy i rozdrabniamy w stomacherze,

(uzyskujemy rozcieńczenie badanego materiału 1:10)

2. Wykonujemy kolejne dziesiętne rozcieńczenia

3. Przesiewamy po 1ml próbki z danego rozcieńczenia do podłoża płynnego namnażającego Giolitti i Cantoni.

4. Posiewamy na podłoże stałe selektywne Baird-Parkera

5. Przesiew podejrzanych kolonii na podłoże płynne BHI (Brain Heart Infusion)

lub agar z krwią (w celu uzyskania czystego szczepu do dalszych badań)

6. Wykonujemy próbę na: a. zdolność wytwarzania koagulazy

b. Clumping factor (CF)

(tzw. czynnik zlepiający)

- przy wykorzystaniu plazmy krwi króliczej

6. Oznaczanie liczby Clostridium perfringens

zgodnie z

PN-EN ISO 7937 - Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby Clostridium perfringens. Metoda liczenia koloni.

Wykonanie:

1. 20 g próbki + 180 ml wody peptonowej, mieszamy i rozdrabniamy w stomacherze,

(uzyskujemy rozcieńczenie badanego materiału 1:10)

2. Wykonujemy kolejne dziesiętne rozcieńczenia

3. Przesiewamy (posiew zalewowy) po 1ml próbki z danego rozcieńczenia do płytek Petriego i zalewamy dwukrotnie pożywką agarową z siarczanem (IV) i cykloseryną (SC)

ink. 37 ⁰C przez 20-22 h, w warunkach beztlenowych.

4. Liczymy podejrzane kolonie

Bakterie C. perfringens otoczone są czarną strefą precypitatu, spowodowanego redukcją siarczanów (IV) do siarczków, co powoduje także zaczernienie kolonii.

5. Potwierdzenie obecności podejrzanych kolonii jako C. perfringens

przy zastosowaniu pożywki:

laktozowo-siarczanowej(IV) lub laktozowo-żelatynowej

lub

poprzez badanie zdolności ruchu i redukcji azotanów

Potwierdzenie obecności C. perfringens
- pożywka laktozowo-siarczanowa(IV)

Schemat badania:

1. podejrzane kolonie przesiewamy do płynnej pożywki z

tioglikolanem - ink. 24 h, 37 ⁰C, warunki beztlenowe,

2. po inkubacji przenosimy 5 kropli hodowli do płynnej pożywki laktozowo-siarczanowej - ink. w łaźni wodnej w temp. 46 ⁰C, 24 h,

Interpretacja:

wynik dodatni: wypełnienie gazem probówek Durhama w więcej niż ¼

i obecność czarnego precypitatu.

7. Oznaczanie Bacillus sp.

zgodnie z

PN-EN ISO 7932 - Mikrobiologia żywności i pasz.

Horyzontalna metoda oznaczania liczby przypuszczalnych Bacillus cereus.

Metoda liczenia kolonii w temperaturze 30 ⁰C.

Schemat badania:

1. 20 g próbki + 180 ml wody peptonowej, mieszamy i rozdrabniamy w stomacherze,

(uzyskujemy rozcieńczenie badanego materiału 1:10)

2. Wykonujemy kolejne dziesiętne rozcieńczenia

3. Przesiewamy po 0,1 ml (posiew powierzchniowy) próbki z danego rozcieńczenia do płytek Petriego z pożywką MYP

(ekstrakt mięsny, mannitol, żółtko jaja, polimyksyna B

- Mannitol, Yolk, Polymyxin)

ink. 30 ⁰C przez 24-48 h, w warunkach tlenowych.

4. Liczymy podejrzane (przypuszczalne) kolonie B. cereus

Kolonie B. cereus są:

- duże,

- różowe - co wskazuje na fermentację mannitolu,

- otoczone strefą zmętnienia - co wskazuje na wytworzenie lecytynazy,

5. Potwierdzenie obecności B. cereus

- test na hemolizę na pożywce agarowej z krwią

- podejrzane kolonie przesiewamy na podłoże agarowe z krwią baranią, ink. 30 ⁰C przez 24h.

Szczepy B. cereus powodują hemolizę.

---