RÓŻNE TECHNIKI CZYLI TRZY ŁYKI PRAKTYKI.

• TECHNIKA SOUTHERN

• TECHNIKA NORTHERN

• TECHNIKA WESTERN BLOT

• ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

• ELEKTROFOREZA - WĘDRÓWKA W ŻELU

• IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA

• SEKWENCJONOWANIE - SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY

• PCR

• WSZYSTKO CO BIOTECHNOLOG MUSI MIEĆ W LABORATORIUM I NIE TYLKO

TECHNIKA SOUTHERN

(DNA-DNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji określonego fragmentu DNA.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.
Jeżeli musimy wyizolować DNA z tkanki lub organizmu pierwszym etapem będzie homogenizacja czyli roztarcie na jednolitą masę. Nie jest to konieczne gdy materiałem są komórki w roztworze np. bakterie w pożywce czy krew. Następne etapy są na ogół dość podobne. Obejmują cykl dodawania różnych roztworów (np. lizozymu - enzymu niszczącego ściany komórkowe w przypadku bakterii , detergentów destabilizujących błony komórkowe itp.) , wielokrotnego wirowania a także jeśli zachodzi potrzeba podczyszczania preparatu z białek (np. denaturacja przy użyciu fenolu) i RNA (np. wytrącanie octanem amonu i trawienie RNazą).

2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ. Po rozdziale na żelu DNA zostaje zdenaturowany pod wpływem NaOH a następnie poddaje się go działaniu roztworu neutralizującego o pH 7,4.

4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z zachowaniem ich charakterystycznego rozmieszczenia. Umożliwia to siła ssąca bibuły przy transferze kapilarnym. Możliwy jest także elektrotransfer. Następnie DNA zostaje związany z filtrem przez zapiekanie w 80°C lub przez naświetlanie UV.

5. Hybrydyzacja z sondą.
a. Prehybrydyzacja - polega na moczeniu filtru w odpowiednim roztworze , którego składniki blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze. Nylon i nitroceluloza , z których produkuje się filtry mają wysokie powinowactwo do jednoniciowego DNA czy RNA. Po przeniesieniu badanego materiału jest to już cecha niekorzystna. W celu zminimalizowania tła wynikającego z hybrydyzacji sondy do losowych cząsteczek DNA lub RNA dodaje się również niehomologiczne DNA nośnikowe. Od tego etapu uzależniona jest czułość i specyficzność eksperymentu. Eliminuje niespecyficzne tło. Warunki prehybrydyzacji - stężenie soli , temperatura - są takie same jak właściwej hybrydyzacji.
b. Właściwa hybrydyzacja - w tym właśnie etapie wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi. Dobranie odpowiednich warunków zapewnia specyficzność czyli wiązanie sondy tylko z określonymi fragmentami oraz czułość. W przypadku gdy mamy 100% lub dość wysoką homologię stosujemy ostrzejsze warunki : wyższą temperaturę (65°C) , mniejsze stężenie soli , czasami dodatek formamidu. Gdy homologia jest częściowa , wymagane są mniej ostre warunki : niższa temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli. Sondę przed dodaniem należy zawsze zdenaturować w wysokiej temperaturze ponieważ musi być ona w postaci jednoniciowej , co umożliwi jej związanie na filtrze.
c. Płukanie filtru - pozwala na usunięcie niezhybrydyzowanej sondy co jest warunkiem specyficznego obrazu hybrydyzacji.

6. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.

TECHNIKA NORTHERN

(DNA-RNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji

określonego fragmentu RNA.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie RNA z komórek i tkanek.

Typowa komórka eukariotyczna zawiera około 10^-5 mg RNA. 80-85% stanowią rybosomalne RNA (28S , 18S , 5S). Pozostałe 10-15% to różne rodzaje małocząsteczkowego RNA (tRNA , snRNA i in.). Poszczególne klasy RNA mają określoną wielkość i można je izolować w stosunkowo czystej formie za pomocą technik takich jak elektroforeza , wirowanie w gradiencie gęstości czy chromatografia jonowymienna. mRNA stanowi 1-5% całkowitej ilości RNA w komórce.

Komórki wszystkich organizmów zawierają rybonukleazy - enzymy biorące udział w różnych procesach związanych z metabolizmem RNA. Aby otrzymać niezdegradowany RNA wymagany jest czynnik inaktywujący RNazy np. DEPC (dietylopirowęglan). Dodaje się go do wszystkich odczynników. Ponadto szkło i sprzęt , który ma bezpośredni kontakt z preparatem musi być wysterylizowany w odpowiedni sposób ponieważ RNazy wytrzymują gotowanie i autoklawowanie. Jest to ochrona przed egzogennymi RNazami. Poprzez inkubację preparatu z proteinazą K , traktowanie tiocyjanianem guanidyny , który denaturuje białka czy merkaptoetanolem , który redukuje mostki dwusiarczkowe chroni się preparat przed RNazami endogennymi. Poza tym procedura izolacji RNA jest dość podobna do izolacji DNA.

Bardzo często interesuje nas tylko jeden rodzaj RNA , mianowicie mRNA. Od reszty oddziela się go metodą chromatografii powinowatwa (kolumnowej). Jak wiadomo mRNA ma 3` końcu ma ogon poliadenylowy. Wykorzystujemy tu komplementarność A=T. Wewnątrz kolumny znajduje się złoże (celuloza , sefaroza) z przyłączonymi na powierzchni odcinkami poli-T. Przez kolumnę przepuszczany jest roztwór całkowitego RNA. Adsorbcji ulegną tylko mRNA. Inne rodzaje RNA przepłyną przez kolumnę. Następnie po przeprowadzeniu przez kolumnę specjalnego buforu powodującego odłączenie mRNA od złoża , otrzymujemy u wylotu spływający roztwór oczyszczonego mRNA.

2. Elektroforeza RNA w żelach.

Z uwagi na silną tendencję RNA do tworzenia skomplikowanych struktur drugo- i trzeciorzędowych , które w znaczący sposób mogą wpływać na migrację cząsteczek w żelu , powodując tym samym rozdział uzależniony nie tylko od wielkości (czego chemy uniknąć) elektroforeza prowadzona jest w warunkach denaturujących. Najczęściej do tego celu stosuje się mocznik , formaldehyd , formamid lub środki , które powodują odwracalną chemicznie modyfikację znoszącą odziaływania prowadzące do wytwarzania struktur przestrzennych jak np. roztwór glioksalu. Elektroforeza może być przeprowadzana w żelach agarozowych lub akrylamidowych.

3. Przeniesienie RNA na filtr (Northern blot).

Technika nie różni się zasadniczo od Southern blot.

4. Hybrydyzacja z sondą i odpłukiwanie.

Aby nie narażać RNA na wysokie temperatury stosuje się w roztworze prehybrydyzacyjnym i hybrydyzacyjnym formamid co pozwala zredukować temperaturę do 42°C. Warunki te są odpowiednie dla hybrydyzacji kwasów o pełnej homologii. W samej procedurze nie ma znaczących różnic w porównaniu z poprzednią techniką.

5. Autoradiografia. Możliwa jest ilościowa analiza RNA , co znajduje zastosowanie np. przy porównywaniu ilości poszczególnych mRNA w komórce w różnych warunkach.

TECHNIKA WESTERN BLOT

(białko-przeciwciało) - wiązanie przeciwciała w celu identyfikacji określonego białka.

Etapy :

1. Przygotowanie ekstraktów komórkowych.

Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek są bardzo różnorodne a ich wybór zależy od właściwości danego białka.

2. Rozdział białek w żelach poliakrylamidowych. W zależności od zastosowanego układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości fizykochemicznych. Przyjmuje się , że elektroforeza w obecności SDS (dodecylosiarczan sodowy) - detergent - frakcjonuje białka zależnie od ich masy czyli zarazem długości łańcucha polipeptydowego. Eliminuje efekt różnicowania pod względem kształtu. SDS powoduje denaturację białka , dysocjację podjednostek (rozbija wiązania niekowalencyjne) i opłaszczenie. Około1,4 gr SDS wiąże się z 1 gr białka. Ten typ elektroforezy jest najczęściej stosowany i może być użyty jako metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych badań. Złożem , w którym następuje rozdział jest żel poliakrylamidowy. Z reguły do rozdziału białek używana jest szczególna wersja elektroforezy tzw. elektroforeza nieciągła , która umożliwia maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce oznacza to , że zarówno żel składa się jakby z dwóch warstw (żel rozdzielający i zatężający różniące się składem procentowym) jak również bufor do elektroforezy inny jest w górnym inny w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki nakładane na żel mogą mieć stosunkowo dużą objętość ponieważ w czasie przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma aby w dolnym żelu ulec rozdzieleniu na pojedyncze , ostre prążki. Dzięki temu , że frakcjonowanie zachodzi w zależności od długości łańcucha polipeptydowego jesteśmy w stanie ustalić masę cząsteczkową danego białka przez porównywanie z odpowiednimi standardami o znanych masach , z dokładnością do 5-10%.

3. Renaturacja.

Inkubacja z odpowiednim buforem.

4. Transfer białek z żelu na membranę nitrocelulozową.

Z reguły elektrotransfer.

5. Immunoblotting.

Jednym z niebezpieczeństw jest to , że białka zaadsorbowane do nitrocelulozy mogą mieć nieco zmieniony układ przestrzenny aminokwasów a ponieważ rozdzielane są w żelu w formie zdenaturowanej a następnie muszą ulec renaturacji , mogą w ogóle nie przyjmować swojej natywnej postaci.
a. Zablokowanie miejsc niespecyficznych.
b. Inkubacja ze specyficznymi dla poszukiwanego białka przeciwciałami.
c. Inkubacja z odczynnikiem używanym do detekcji.

Najczęściej są to II (drugorzędowe) przeciwciała czyli przeciwciała , dla których antygenem jest przeciwciało specyficzne. II przeciwciała związane są z barwnikami fluorescencyjnymi , cząstkami złota lub enzymami. Systemy detekcyjne muszą być proste i czułe. Można wykryć za ich pomocą nawet 10^-9 do 10^-12 gr białka. II przeciwciała mogą być skoniugowane z enzymem , który zmienia kolor substratu podczas reakcji np. z AP - alkaliczną fosfatazą (w zależności od użytego substratu utworzony związek jest ciemno niebieski lub purpurowy) lub z HRP - peroksydazą szczurzą (utlenienie odpowiednich substratów prowadzi do powstawania ciemnego strątu w miejscu reakcji). Innym systemem detekcji jest awidyna lub streptawidyna skoniugowana z enzymem (AP lub HRP). Awidyna i streptawidyna silnie wiążą się z biotyną. I przeciwciała znakuje się biotyną a zamiast II przeciwciał do detekcji używa się awidyny lub streptawidyny skoniugowanej z enzymem. Ponieważ jedna cząsteczka awidyny lub streptawidyny związana jest z kilkoma cząsteczkami enzymu system detekcji jest bardziej czuły niż w przypadku użycia przeciwciał.

Następny system to tzw. system NIP. Stworzony aby ograniczyć ilość niespecyficznych reakcji II przeciwciał. I przeciwciała znakuje się nitrojodofenolem (NIP) , II przeciwciała skoniugowane z enzymem są skierowane przeciwko NIP. Ponieważ NIP jest związkiem drobnocząsteczkowym reakcja przeciwciał jest bardzo specyficzna. Kolejny rodzaj to systemy nieenzymatyczne. Na przykład II przeciwciała wyznakowane koloidalnym złotem lub radioaktywnie (¹²⁵I). W pierwszym przypadku uzyskuje się bezpośrednie uwidocznienie reakcji , w drugim detekcja wymaga autoradiografii.

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

Wiele metod biologii molekularnej opiera się na wykorzystaniu wyznakowanych cząsteczek kwasów nukleinowych. Dobra sonda powinna mieć wysoką aktywność , odpowiednią czystość i specyficzność. Najpowszechniej wykorzystywane do znakowania są cząsteczki nukleotydów, w których jeden z atomów zastąpiony został izotopem radioaktywnym. Aktywność specyficzna zależy od proporcji włączonych nukleotydów radioaktywnych do normalnych. Krótszy okres półtrwania izotopu również powoduje zwiększenie aktywności specyficznej. Najczęściej stosowane są dwa izotopy : fosfor ³²P (włączany w pozycji a lub g cząsteczki trifosforanu nukleotydu) oraz siarka ³⁵S (włączana w miejsce atomu tlenu odpowiedniej reszty fosforanowej - a lub g). Fosforu radioaktywnego używa się gdy wymagane jest uzyskanie sondy o wysokiej aktywności co zapewnia dużą czułość i krótki czas detekcji. Podstawowym zastosowaniem siarki jest sekwencjonowanie DNA a także badanie metabolizmu białek.

Najczęściej używane radioizotopy.
Radioizotop	Czas półtrwania	Energia emitowanych cząstek (MeV)	Specyficzna aktywność wyznakowanych składników (mCi/mmol)
Tryt	12,35 lat	0,0186	10^2-10^5
Węgiel - 14	5730 lat	0,156	1 - 10^2
Siarka - 35	87,5 dnia	0,167	1 - 10^6
Fosfor - 33	25,5 dnia	0,248	10 - 10^4
Fosfor - 32	14,3 dnia	1,709	10 - 10^5
* MeV = 10^6 elektronowoltów. Powyżej podana maksymalna energia.
^# mCi (miliCurie) - miara liczby rozpadów na jednostkę czasu. 1 mCi = 2,2^.10^9 rozpadów na minutę.

W zależności od konkretnego zastosowania stosuje się różne metody znakowania DNA :

• Nick translation

- DNaza I wprowadza do cząsteczki jednoniciowe pęknięcia (nick). Polimeraza I dzięki swojej aktywności 5`-3` egzonukleazy usuwa nukleotydy przed sobą a za sobą dobudowywuje nowe włączając między innymi również nukleotydy radioaktywne. W ten sposób przesuwa niejako miejsce pęknięcia. Wydajność inkorporacji wynosi około 50%. Metoda ta daje najlepsze wyniki przy znakowaniu całych plazmidów a nie jest raczej zalecana do fragmentów liniowych.

• Random priming

- najczęstsza , oparta jest na hybrydyzacji oligonukleotydów (6 do 9 nukleotydów) o przypadkowej sekwencji do DNA , który ma być wyznakowany. Następnie polimeraza Klenowa (fragment polimerazy DNA I nie posiadający aktywności egzonukleolitycznej 5`-3`) dosyntetyzowuje komplementarną nić DNA poczynając od 3` OH końca przyłączonego startera. W mieszaninie reakcyjnej znajdują się także radioaktywne nukleotydy włączane stopniowo do nowo syntetyzowanej nici. Długość znakowanych fragmentów nie wpływa na wydajność reakcji. Można w ten sposób uzyskać sondę o wysokiej aktywności. Metoda jest doskonała zarówno do znakowania całych plazmidów jak i liniowych fragmentów.

• Znakowanie DNA na końcach.

- Znakowanie 5` końca.

W tej metodzie używa się kinazy polinukleotydowej faga T4 , która przenosi grupę fosforanową z pozycji g ATP na DNA lub RNA zawierające grupę hydroksylową na 5` końcu.


Ponieważ normalnie cząsteczki DNA zawierają grupę fosforanową na 5` końcu należy przed znakowaniem poddać je działaniu alkalicznej fosfatazy , która spowoduje jej usunięcie. Metoda najczęściej stosowana do znakowania syntetycznych oligonukleotydów.

- Znakowanie 3` końca.

Terminalna transferaza dołącza deoksyrybonukleotydy na 3` końcu. Nie wymaga matrycy. Substratem dla tego enzymu może być zarówno jednoniciowe jak i dwuniciowe DNA.

- Wypełnianie lepkich końców. W tej metodzie używa się fragmentu Klenowa , który dobudowuje brakujące na 3` końcu nukleotydy w cząsteczkach strawionych enzymami restrykcyjnymi tworzącymi lepkie końce 5`. Wydajność inkorporacji sięga niekiedy nawet 90%.

Po znakowaniu niezbędne jest oddzielenie niewłączonych radioaktywnych dNTP , które mogłyby ujemnie wpływać na jakość hybrydyzacji dając zbyt wysokie tło czyli zmniejszając specyficzność reakcji. Rozdzielenie uzyskuje się przez sączenie na kolumienkach ze specjalnym złożem , które zatrzymuje związki drobnocząsteczkowe przepuszczając makrocząsteczki.

Ilościowe oznaczenie wyznakowania osiąga się przez pomiar aktywności sondy. Jest on możliwy za pomocą dwóch urządzeń : licznika Geigera i licznika scyntylacyjnego . Zliczają one zarejestrowane rozpady promieniotwórcze w jednostce czasu. Jednostką podstawową jest cps - (counts per second) zliczenie na sekundę lub dpm - (disintegrations per minute) liczba rozpadów promieniotwórczych na minutę.

Wykrywanie wizualne wyznakowanych cząsteczek w celu zlokalizowania prążka , który z sondą zhybrydyzował jest możliwe dzięki autoradiografii. Starszą metodą jest poddanie naświetlaniu kliszy pokrytej emulsją fotograficzną czułą na napromieniowanie w specjalnych kasetach. Klisza położona na filtr ulega zaczernieniu w miejscu hybrydyzacji z sondą. Kasetę taką przechowuje się przez pewnien czas , odwrotnie proporcjonalny do aktywności sondy , w temperaturze - 70°C. Niska temperatura sprzyja ostrości prążków. Następnie klisza jest wywoływana. Nowszą metodą jest ekspozycja filtru w innych kasetach. Jest tu niezbędne specjalne urządzenie tzw. phosphoimager sprzężony z komputerem , który umożliwia zeskanowanie powierzchni kasety i obróbkę uzyskanych w ten sposób danych. Przy pomocy programu komputerowego Image Quant jesteśmy w stanie oszacować nawet intensywność zaczernienia.

ELEKTROFOREZA - WĘDRÓWKA W ŻELU.

Elektroforeza - technika stosowana przy rozdziale , analizie i oczyszczaniu kwasów nukleinowych i białek.

DNA i RNA mają ładunek ujemny i zgodnie z tym ładunkiem , nadawanym przez grupy fosforanowe , migrują w polu elektrycznym w kierunku anody. Szybkość migracji zależy od wielkości i kształtu cząsteczki.

Schemat postępowania jest następujący : żel ulega zestaleniu w formie cienkiej płytki na podstawce tzw. saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem , który następnie wyciąga się.
W zastygłym żelu znajduje się szereg dołków , do których wprowadzane są próbki DNA oraz z reguły tzw. standard czyli mieszanina cząsteczek o znanych masach dzięki czemu możliwa będzie później kalibracja żelu. Przed naniesieniem na żel próbki muszą być odpowiednio przygotowane : dodawany jest barwnik , który informuje nas później jak daleko zaszły najszybsze cząsteczki (co jest niezbędne ponieważ DNA w żelu nie widać) oraz związek interkalujący - bromek etydyny , który fluoryzuje w świetle UV co pozwoli nam na zlokalizowanie prążków.

Minimalna ilość DNA , którą widać na żelu w postaci prążka to 20 ng. Ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 200 ng ponieważ obserwuje się przeładowanie kieszonki. Żel umieszczony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodzącym prąd. Podłączony zostaje do zasilacza generującego prąd o stałym i określonym napięciu i natężeniu. Jakość rozdziału fragmentów DNA zmniejsza się w miarę zwiększania napięcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jakości stosuje się napięcie nie większe niż 5V na 1cm długości żelu.

Kalibracja wielkości fragmentów cząsteczek w żelu opiera się na zasadzie , że liniowe cząsteczki DNA migrują w żelu agarozowym z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu dziesiętnego ich masy cząsteczkowej wyrażonej w Daltonach lub w tysiącach par zasad czyli kb. Kalibracja żelu polega na wykreśleniu krzywej zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy przez poszczególne fragmenty od logarytmu masy cząsteczkowej.

Elektroforezę można przeprowadzać w żelach natywnych lub denaturujących.

1. Żele agarozowe.

Metoda szybka , prosta , powszechnie stosowana. Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów w żelu , których rozmiary są zdeterminowane przez stężenie agarozy. Żeli bardziej stężonych tj. 1,4-2,0 % używa się do rozdziału cząsteczek mniejszych (0,5-2,0 kb). Żele mniej stężone 0,5-0,7 % stosuje się do rozdziału cząsteczek większych (10-20 kb i więcej).

Zaletą może być niekiedy fakt , że podczas elektroforezy możliwe jest rozdzielenie cząsteczek o tej samej wielkości ale zróżnicowanych pod względem kształtu. Doskonałym przykładem jest rozdział trzech różnych form plazmidu : CCC (ang. covalently closed circle) , liniowej i OC (ang. open circle). Pierwsza najszybciej wędruje w żelu , druga nieco wolniej , trzecia najwolniej.

2. Żele akrylamidowe.

Powstają przez polimeryzacje monomerów akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań poprzecznych przez bisakrylamid. Można regulować sieciowanie poprzez manipulację proporcjami stężeń akrylamidu do bisakrylamidu. Do zajścia reakcji niezbędna jest obecność odpowiedniego katalizatora (PERS - nadsiarczan potasowy) i związku inicjującego reakcję (TEMED). Żele te stosuje się przy rozdziale fragmentów o wielkości od kilku par zasad (20% poliakrylamid) do tysiąca par zasad (3% poliakrylamid) a także przy rozdziale jednoniciowych cząsteczek DNA np. do sekwencjonowania.

3. Żele denaturujące.

Ponieważ szybkość migracji w żelu jednoniciowych cząsteczek , zależy nie tylko od ich wielkości i ładunku ale także w dużym stopniu od ich struktury przestrzennej (w przypadku dwuniciowych cząsteczek DNA nie ma to większego znaczenia) aby dokładnie określić ich wielkość należy weliminować różnice w szybkości migracji wywołane różną konformacją cząsteczki. Jest to szczególnie ważne w przypadku jednoniciowego RNA , które tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. W tym właśnie celu stosuje się żele denaturujące agarozowe lub poliakrylamidowe. Najczęściej używanymi czynnikami denaturującymi są : formaldehyd i glioksal w żelach agarozowych (przy analizie preparatów RNA) lub mocznik w żelach poliakrylamidowych (przy analizie jednoniciowych fragmentów DNA).

4. Elektroforeza w polu pulsacyjnym.

Stosowana do rozdzielenia dużych cząsteczek DNA - od 2^.10⁴ do 10⁷ bp czyli od 20 kb do 10 Mb. Można w ten sposób rozdzielić całe chromosomy np. drożdżowe. Pole elektryczne jest włączane i wyłączane w krótkich odstępach czasu. Kiedy pole elektryczne jest włączone cząsteczki migrują zgodnie ze swoją wielkością a gdy zostaje wyłączone mają tendencję do relaksacji i zwijania w przypadkowe pętle. Czas wymagany do relaksacji jest wprost proporcjonalny do długości cząsteczki. Następnie kierunek pola elektrycznego jest zmieniany o 90 lub 180 stopni w stosunku do poprzedniego. Dłuższe cząsteczki zaczynają poruszać się wolniej niż krótsze. Powtarzające się zmiany kierunku pola stopniowo powodują rozdzielenie.

IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA.

Izolacja z żelu jest niezbędnym etapem w szeregu doświadczeń. Jest konieczna gdy po rozdziale pragniemy wykorzystać do dalszej pracy pewną określoną frakcję materiału lokującego się w odpowiednim prążku.

Istnieje wiele metod odzyskiwania DNA z żeli jednak żadna z nich nie jest pozbawiona wad.

Istotne problemy przy izolacji to :

- obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych np. obecne w agarozie zanieczyszczenia w postaci polisacharydów , które hamują aktywność enzymów używanych przy dalszej obróbce klonowanego DNA

- niezbyt duża skuteczność odzyskiwania dużych fragmentów DNA ponieważ wydajność izolowania jest funkcją ciężaru cząsteczkowego tych fragmentów , za wielkość graniczną dla dobrej izolacji przyjmuje się długość 5 kb

- im mniejsza ilość DNA na żelu tym mniejsza wydajność jego odzyskiwania , izolacja staje się nieskuteczna przy ilościach mniejszych niż 500 ng

- nie ma możliwości izolacji jednocześnie kilku fragmentów o różnej długości.

Metody :

1. Izolacja DNA z użyciem DEAE-celulozy.

Polega na przyczepieniu się migrującego DNA do umieszczonej w żelu membrany z DEAE-celulozą , którą następnie odpłukuje się z zanieczyszczeń buforem o niskiej sile jonowej a potem eluuje z niej DNA buforem o wysokiej sile jonowej. Należy pamiętać , że z membran nie podlega elucji jednoniciowe DNA oraz fragmenty powyżej 15 kb.

2. Elektroelucja do woreczków dializacyjnych.

Najefektywniejsza do izolacji dużych fragmentów DNA - powyżej 5 kb. Po odpowiednim rozdzieleniu wycina się konkretny prążek DNA , umieszcza w woreczku dializacyjnym , który wkłada się do aparatu do elektroforezy i prowadzi ją przez jakiś czas po czym na krótko odwraca się bieguny i prowadzi elektroforezę przez minutę co pozwala na uwolnienie DNA ze ścian woreczka. Woreczek dializacyjny zostaje przepłukany odpowiednim buforem i po dodaniu kilku specjalnych odczynników i wirowaniu otrzymujemy preparat DNA.

3. Metoda "freeze-sqeeze".

Jest to bardzo szybka metoda izolacji. Tak jak poprzednio po elektroforezie zostaje z żelu wycięty konkretny prążek. Fragment żelu umieszczony w probówce , na dnie której znajduje się niewielka ilość silikonowej szklanej waty , zamraża się w ciekłym azocie (freeze) a następnie wkłada się jedną probówkę w drugą po zrobieniu w tej pierwszej niewielkiego otworku na dnie. Kolejnym etapem jest wirowanie (sqeeze). Uzyskany w ten sposób bufor poddaje się jeszcze kilku zabiegom wytrącania i wirowania , po których otrzymujemy wyizolowane DNA.

SEKWENCJONOWANIE - SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY.

Sekwencjonowanie - metoda , dzięki której możliwe jest ustalenie sekwencji czyli określenie kolejności nukleotydów. Jeden z etapów analizy genu. Na podstawie sekwencji istnieje możliwość przewidzenia kolejności aminokwasów w białku , które jest kodowane przez dany gen.

Są dwie metody sekwencjonowania :

- Enzymatyczna - metoda Sangera

Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się in vitro DNA. Syteza przebiega od radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` końca matrycy. Reakcję wykonuje się równolegle w czterech probówkach , w których oprócz kompletu deoksytrifosforanów nukleotydów (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilość jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemożliwia kontynuowanie reakcji w momencie włączenia takiego nukleotydu w syntetyzowany łańcuch , ponieważ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` końcu.


Synteza zostaje zahamowana losowo - powstaje mieszanina fragmentów o różnej długości.

Produkty reakcji poddawane są elektroforezie w czterech równoległych ścieżkach na żelu poliakrylamidowym. Pozwala to na ustalenie sekwencji nici komplementarnej do badanej.

- Chemiczna - metoda Maxama-Gilberta

Jest to metoda praktycznie już nie stosowana.

Polega na degradacji wyznakowanych na 5` końcu cząsteczek DNA związkami chemicznymi przecinającymi specyficznie wiązania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym określonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbiór fragmentów DNA o różnej długości co spowodowane jest takim doborem warunków , że w poszczególnych cząsteczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wiązania. Fragmenty z czterech niezależnych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela się elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Prążki na autoradiogramie odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na końcu 5` znakowany fosfor a na końcu 3` określoną zasadę.

Obydwie metody pozwalają na odczytanie sekwencji około 400 do 700 nukleotydów w jednym doświadczeniu. Jeśli sekwencjonujemy dłuższy odcinek należy go pociąć enzymem restrykcyjnym i ustalać sekwencję każdego fragmentu osobno.

PCR - Z MAŁEJ ILOŚCI DUŻA ILOŚĆ W KRÓTKIM CZASIE.

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction) polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankujących określony odcinek DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów. Jest to metoda alternatywna do klonowania i może być używana w celu amplifikacji nawet bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie ale warunkiem jest znajomość sekwencji otaczającej powielany fragment. W praktyce wystarczy tylko jedna cząsteczka matrycy.

Typowa reakcja PCR polega na powtarzających się cyklach :

1. DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze około 90°C. Syntetyczne oligonukleotydy długości mniej więcej 20 nukleotydów komplementarne do 3` końców kawałka DNA , którego powieleniem jesteśmy zainteresowani , dodane są w dużym nadmiarze molowym do zdenaturowanego DNA.

2. Temperatura zostaje obniżona do 40-60°C. DNA pozostaje zdenaturowany ponieważ komplementarne łańcuchy są w zbyt niskiej koncentracji , w porównaniu z ilością starterów , aby zrenaturować. Specyficzne oligonukleotydy hybrydyzują z komplementarnymi sekwencjami w DNA (tzw. annealing) i służą jako startery do syntezy DNA , którą prowadzi termostabilna DNA polimeraza tzw. Taq polimeraza izolowana z bakterii Thermus aqaticus.

3. Synteza odbywa się w temperaturze 72°C.

Następnie cała mieszanina jest podgrzewana znowu do 95°C aby rozdysocjować nowo powstałe dupleksy DNA. Później temperatura jest obniżana i zachodzi następna runda syntezy. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane są odcinki DNA o różnej długości. Stopniowo zaczynają przeważać fragmenty ograniczone straterami a końcowy produkt jest praktycznie jednorodny. W każdym cyklu liczba kopii sekwencji pomiędzy primerami rośnie wykładniczo jak 2ⁿ gdzie n jest liczbą cykli.

Amplifikacja fragmentu DNA metodą PCR.
Numer cyklu	Liczba dwuniciowych , zamplifikowanych cząsteczek DNA
1	0
2	0
3	2
4	4
5	8
6	16
7	32
8	64
9	128
10	256
11	512
12	1024
13	2048
14	4096
15	8192
16	16 384
17	32 768
18	65 536
19	131 072
20	262 144
21	524 288
22	1 048 576
23	2 097 152
24	4 194 304
25	8 388 608
26	16 777 216
27	33 544 432
28	67 108 864
29	134 217 728
30	268 435 456
31	536 870 912
32	1 073 741 824

Po powieleniu DNA może być poddany analizie restrykcyjnej , hybrydyzacyjnej czy sekwencjonowaniu.

ZASTOSOWANIE :

PCR może być używany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy :

- analizowaniu mutacji związanych z szeregiem chorób genetycznych

- diagnostyce chorób dziedzicznych

- ustalaniu ojcostwa w sądownictwie

- ustalaniu pochodzenia śladów krwi , włosów itp. w kryminalistyce

- namnażaniu DNA z mumii egipskich czy szczątków wymarłych organizmów

- wykrywania we krwi obecności wirusów takich jak np. HIV.

RODZAJE PCR :

RAPD-PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragmentów genomu dzięki zastosowaniu krótkich starterów (około 10 nukleotydów) o losowo dobranej sekwencji.

Na pewno zwiążą się one z DNA w jakimś miejscu a ponieważ jednorazowo do każdej reakcji dodawany jest jeden rodzaj startera zakłada się występowanie sekwencji typu odwróconych powtórzeń w takiej odległości od siebie w genomie , która pozwoli na wydajną amplifikację czyli 300 do 1500 par zasad. Elektroforetyczny obraz prążków jest charakterystyczny dla osobnika. Ten rodzaj PCR znalazł zastosowanie w określaniu stopnia pokrewieństwa między organizmami a także m.in. w kryminalistyce w celach identyfikacji.

RT-PCR - PCR połączona z odwrotną transkrypcją czyli materiałem wyjściowym do namnażania jest mRNA a nie jak zazwyczaj DNA.

ZAZĘBIONA PCR - umożliwia zamplifikowanie odcinka DNA zawartego w większym uprzednio namnożonym fragmencie.

PCR in situ - nowa technika pozwalająca na przeprowadzenie reakcji w tkance bez naruszania jej struktury np. na preparacie mikroskopowym.

PCR ILOŚCIOWA - za pomocą pomiaru intensywności reakcji barwnych jesteśmy w stanie zmierzyć po określonej liczbie cykli ilość powstałego produktu. Jest to szczególnie istotne dla substancji występujących w bardzo niewielkich ilościach. Można w ten sposób szacować poziom ekspresji genu kodującego konkretne białko mierząc ilość mRNA.

WSZYSTKO CO BIOTECHNOLOG MUSI MIEĆ W LABORATORIUM I NIE TYLKO.

Odczynniki z jakimi pracuje biolog molekularny są nieraz bardzo niebezpieczne dla zdrowia jak chociażby izotopy radioaktywne czy substancje rakotwórcze. Dlatego też niezbędne są minimalne zabezpieczenia w postaci jednorazowych rękawiczek , fartuchów , okularów i ekranów ochronnych itp.

Substancje z jakimi się pracuje to poczynając od najprostszych związków chemicznych jak np. chlorek sodu przez enzymy , bufory , kończąc na całych zestawach przygotowywanych przez firmy i sprzedawanych w pakietach służących konkretnemu celowi np. znakowaniu.

Aparatura.

Podstawowe urządzenia laboratoryjne to :

- wirówki i ultrawirówki , które umożliwiają rozdział badanych próbek w probówkach na frakcje w wyniku wirowania z ogromną prędkością - od kilku tysięcy do kilkuset tysięcy obrotów na minutę

Otwarta wirówka

- urządzenia do mieszania i wytrząsania zawartości probówek tzw. worteksy

- lampa ultrafioletowa i aparat do robienia zdjęć żeli

- najróżniejsze w kształcie , rozmiarze i kwestii przeznaczenia probówki i statywy do nich

- pipety , standardowo odmierzające z dokładnością od dziesiętnych części mikrolitra do mililitra oraz jednorazowe końcówki do pipet tzw. tipsy

- aparaty do elektroforezy

Aparat do elektroforezy

- łaźnie wodne

- cieplarki

- chłodziarki , zamrażarki - niezbędna jest dość szeroka gama temperatur od minus kilkudziesięciu °C do plus kilku

- bloki grzejne

- bloki chłodzące

- wyciągi

- komora laminarna , w której jest ciągły przepływ sterylnego powietrza

- autoklaw do sterylizacji sprzętu w 120 °C

- suszarka

- masa szkła laboratoryjnego : szalki petriego , pipety szklane , kolby miarowe , cylindry , zlewki , lejki itd.

Bardziej wyrafinowane urządzenia to :

- termocykler do metody PCR

Aparat do przeprowadzania reakcji PCR

- armatka genowa

Armatka genowa

- spektrofotometr

- mikroskop fluorescencyjny

- urządzenia do automatycznego sekwencjonowania

Urządzenie do automatycznego sekwencjonowania

- phosphoimager.

W tej chwili także bez komputera obyć się nie sposób.

Reszta jest już mieszanką cierpliwości , talentu , szczęscia i rzetelnej wiedzy...

---