05

4)    Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ dla preparatu otrzymanego według opisanej procedury powinien wynosić 1,87-2,0.

5)    Otrzymany tą metodą RNA powinien nadawać się do analizy RT-PCR (reverse transcriptase polimerase chain reaction), patrz podrozdz. 10.3.5.

Ćwiczenie 10.13. Izolowanie mRNA ssaków (J. Sambrook i wsp. 1989: Molecular cloning. A laboratory manuał. Book 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 7.26-7.29)

Zasada: Większość mRNA komórek ssaków, w przeciwieństwie do tRNA i rRNA, zawiera na swym końcu 3' odcinek poliadenylowy, poly(A). Cząsteczki mRNA można więc wydzielić z całkowitej puli RNA przez chromatografię powinowactwa z użyciem celulozy oligo(dT).

Materiał: RNA otrzymany np. metodą opisaną w ćw. 10.11 lub 10.12.

Odczynniki:

1)    Celuloza oligo(dT).

2)    0,1 M roztwór NaOH.

3)    1 x bufor kolumnowy: 20 mM Tris/HCI (pH 7,6) - 0,5 M NaCl - 1 mM EDTA (pH 8,0) - 0,1% sarkozynian dodecylu sodu. Odpowiednie ilości roztworów 1 M Tris/HCI (pH 7,6), 5 M NaCl i 0,5 M EDTA autoklawować, następnie ochłodzić do temp. 65°C i dodać odpowiednią ilość roztworu 10% sarkozynianu dodecylu sodu ogrzewanego uprzednio w temp. 65°C przez 30 min.

4)    2 x bufor kolumnowy (tj. 2 x stężony): 40 mM Tris/HCI (pH 7,6) - 1 M NaCl - 2 mM EDTA (pH 8,0) - 0,2% sarkozynian dodecylu sodu. Przygotować tak jak odcz. 3).

5)    Bufor do elucji o pH 7,6: 10 mM Tris/HCI - 1 mM EDTA (pH 8,0) - 0,05% SDS. Zmieszać stężone roztwory Tris/HCI i EDTA, sterylizować przez autoklawowanie i dodać stężony (10 lub 20%) SDS.

6)    3 M roztwór CH₃COONa (pH 5,2).

7)    96% roztwór etanolu.

8)    70% roztwór etanolu.

Ważniejsze urządzenia: Łaźnia wodna obejmująca zakresem temperatur 65°C, spektrofotometr UV-VIS. Wykonanie:

1.    Zawiesić 0,5-1,0 g celulozy oligo(dT) (odcz. 1) w NaOH (odcz. 2). Nanieść na kolumnę 0,5-1,0 ml upakowanej celulozy oligo(dT) i przemyć ją 3 objętościami H₂0. Przemywać kolumnę 1 x buforem kolumnowym (odcz. 3) aż do uzyskania wartości pH eluatu mniejszej od 8,0.

2.    Rozpuścić RNA w H₂0 i ogrzewać w temp. 65°C przez 5 min, następnie szybko ochłodzić do temperatury pokojowej. Dodać równą objętość 2 x buforu kolumnowego (odcz. 4), nanieść otrzymany roztwór na kolumnę i natychmiast rozpocząć zbieranie eluatu do probówek. Po wprowadzeniu całości RNA dodać 1 x buforu kolumnowego (odcz. 3; 1 pojemność kolumny) i kontynuować elucję. Po wyeluowa-niu całości roztworu ogrzewać go w temp. 65°C przez 5 min i ponownie wprowadzić do kolumny.

3.    Przemywać kolumnę 1 x buforem kolumnowym (odcz. 3; 5-10 pojemności kolumny) i zbierać 1-ml frakcje odczytując dla nich wartości absorbancji przy /. = 260 nm. Początkowo wartości te będą znaczne, ponieważ będzie spływał RNA bez odcinków poliadenylowych, wartości A₂₆₀ w następnych frakcjach będą ulegać zmniejszeniu.

385