01

lub fluorecencyjnym barwnikiem kwinakryną (ąuinacrine, prążki Q). Odpowiadają one regionom nici nukleoproteinowej o dużej zawartości par zasad A • T, regionom jednocześnie późno replikującym i charakteryzującym się małą zawartością genów aktywnych transkrypcyjnie. Prążki jasne wykazują przeciwstawne właściwości re-plikacyjno-transkrypcyjne, a nadto skład białek w tych obszarach jest zdecydowanie inny niż w prążkach ciemnych. Wzory prążkowe pozwalają identyfikować chromosomy, umożliwiają wykrywanie i lokalizację określonych genów lub odcinków znacznikowych w strukturze chromosomów, a także w precyzyjny sposób ujawniają ich zmiany translokacyjne i aberracyjne.

Wykonanie: Do 1 ml 0,1% roztworu RNA lub DNA dodać 0,1 M roztwór CHjCOOH aż do wystąpienia lekkiego zmętnienia. Następnie wprowadzić 2-3 krople 0,1% roztworu błękitu metylenowego i intensywnie wytrząsać. Wytrąca się niebieski osad.

Ćwiczenie 10.19. Oddziaływanie ze specyficznymi białkami. Test opóźnionej ruchliwości elektroforetycznej DNA (W. Hendrickson 1985: Biotechniąues, 3:198-207)

Zasada: Kwasy nukleinowe mogą in vivo pełnić swe funkcje jedynie w kompleksach z białkami, które albo uczestniczą w formowaniu chromatyny i chromosomów, albo pełnią rolę czynników regulacyjnych w procesach replikacji i transkrypcji, kiedy to precyzyjnie rozpoznają specyficzne sekwencje polinukleotydowe w DNA i RNA. Kwasy nukleinowe ze względu na charakter polianionowy mogą także tworzyć in vitro niespecyficzne, kompleksowe połączenia z białkami zasadowymi (histony, protaminy) lub obojętnymi. Te sztuczne nukleoproteiny, aczkolwiek wykorzystywane niekiedy do celów metodycznych (np. frakcjonowania fragmentów DNA — różniących się względną zawartością par zasad A T i G C — poprzez oddziaływania z histonami), nie mają jednak większego znaczenia poznawczego. Wykrywanie i analizę natywnych oddziaływań kwasów nukleinowych z sekwencyjnie specyficznymi białkami umożliwił rozwój w ostatnich latach nowych technik badawczych. Jedną z nich jest test, który polega na tym, że rozdziela się elektroforetycznie szereg kompleksów DNA z białkiem i oddziela się od nich wolne, pozbawione białek homologicznych fragmenty kwasu nukleinowego. Metoda ta nosi nazwę testu spowolnienia migracji elektroforetycznej w żelu (gel band shift lub gel retardation assay). Aczkolwiek w omawianej technice tworzenie kompleksów kwas nukleinowy-białko odbywa się in vitro, warunki ich formowania i późniejszej analizy elektroforetycznej zapewniają jednak wysoki stopień trwałości połączeń oraz specyficzność rozpoznawania unikatowych sekwencji nukleotydowych w łańcuchu DNA przez przyłączone białko.

Materia):

1)    Świeżo przygotowany białkowy ekstrakt jąder komórkowych limfocytów ludzkich. 2-3-10⁶ wyizolowanych jąder komórkowych (podrozdz. 16.1) poddać ekstrakcji w 5 ml odczynnika 1, zawierającego inhibitory proteinaz — PMSF i antypainę. Mieszać intensywnie (w temp. 0°C przez 30 min), a następnie zawiesinę odwirować (15000x3 w temp. 4°C przez 15 min). Otrzymany supernatant rozcieńczyć odczynnikiem 1, aby końcowe stężenie białka w ekstrakcie wynosiło 1 pg/pl.

2)    Fragment mikrosatelitarnego DNA namnożony przed ćwiczeniem w reakcji PCR (podrozdz. 10.3.5). W procesie amplifikacji PCR namnożyć fragment mikrosatelitarnego DNA o długości 150-160 pz,

391