05

^'mo!    ^ max / ^'max

gdzie: c_mo, — stężenie molowe oznaczanej substancji, /ł_max — absorbancja w A_max, zmierzona w 1-cm kuwecie (grubość warstwy 1 cm), e_max — molowy współczynnik absorpcji danej substancji w A_max.

Charakterystyki spektralne kwasów RNA i DNA są podobne. Maksima pochłaniania występują przy ok. 260 nm, a minima — przy ok. 230 i 290 nm. Pozwalają one tylko zorientować się co do czystości preparatów kwasów nukleinowych. Jednorodny, wolny od obcych domieszek preparat kwasu nukleinowego charakteryzuje się wartością 1,7-2,0 stosunku A₂₆₀:A₂₈₀ oraz 1,4-1,7 stosunku A₁₆₀:A_2S0- Najczęściej preparaty kwasów nukleinowych zanieczyszczone są białkiem, które maksymalnie pochłania w paśmie 280 nm. Obecność białka powoduje zatem zmniejszenie wartości A₂₆₀:A₂₈₀.

Ćwiczenie 10.20. Oznaczanie molowego współczynnika absorpcji e_(P) RNA i DNA

Zasada: Molowym współczynnikiem absorpcji kwasu nukleinowego e_(F) przyjęto nazywać pochłanianie promieni nadfioletowych (A_max, 1-cm warstwa) przez roztwór kwasu nukleinowego, zawierający 1 mol fosforu w 1000 ml:

s₍p) = A/(c-l)

gdzie: A — absorbancja w A_max, c — ilość moli fosforu w 1000 ml roztworu RNA lub DNA, l — grubość warstwy roztworu.

Wartości e_(P) dla preparatów kwasów nukleinowych różnego pochodzenia wahają się w granicach: 6000-8000 dla DNA oraz 7000-10000 dla RNA (patrz efekt hiperchromowy).

Materiał:

1)    Wyjściowy roztwór wodny wysoko spolimeryzowanego RNA. Dokładną odważkę 5 mg RNA rozpuścić w H₂0 w kolbce miarowej na 10 ml.

2)    Wyjściowy roztwór wodny DNA z grasicy. Dokładną odważkę ok. 5 mg DNA rozpuścić w H₂0 w kolbce miarowej na 10 ml.

Odczynniki:

1) Zestaw odczynników do mineralizacji i oznaczania fosforu metodą Horeckera (patrz ćw. 9.9) Wykonanie:

1.    Przenieść 2 ml roztworu wyjściowego RNA (lub DNA) do kolbki miarowej (20 ml), uzupełnić wodą do 20 ml i zawartość starannie wymieszać (roztwór roboczy). Z otrzymanego roztworu pobrać po 1 ml do 3 skalowanych na 10 ml probówek do spalań. Próbki zmineralizować i oznaczyć w nich fosfor metodą Horeckera (ćw. 9.9). Obliczyć liczbę moli fosforu w 1000 ml roboczego roztworu RNA (DNA).

2.    Równocześnie wykonać widma absorpcyjne roboczego roztworu RNA (DNA). Pomiary przeprowadzić na spektrofotometrze z ciągłą rejestracją widma wobec próby zerowej (H_zO), w 1-cm kwarcowych kuwetach w zakresie 220-300 nm. Sporządzić wykres zależności absorbancji (A) od długości fali (A). Na wykresie zaznaczyć maksimum i minimum. Obliczyć wartości e_(P)max i £_(/>_)rain.

Uwaga: Posługując się spektrofotometrem punktowym odczytywać wartości absorbancji co 5 jednostek długości fali.

395