08

3.    Rozwinięcie chromatogramu. Chromatogram rozwinąć w komorze nasyconej parami rozpuszczalnika w temp. 22°C przez 36 godz. Jako rozpuszczalnik zastosować 75% roztwór etanolu. Chromatogram wysuszyć w temperaturze pokojowej, a następnie w temp. 80°C w ciągu 20 min.

4.    Identyfikacja nukleotydów. Położenie nukleotydów na bibule określić pod lampą UV zaopatrzoną w filtr przepuszczający fale o długości 250-270 nm. Ujawniające się plamy obrysować delikatnie ołówkiem grafitowym, zrobić jednocześnie zdjęcie stykowe chromatogramu, które może posłużyć jako dokumentacja. Nukleotydy zidentyfikować według załączonego schematu rozdziału nukleotydów (rys. 10.12).

START

i

WWAWV

CMP

GMP

AMP

UMP

Rys. 10.12. Schemat chromatogramu wzorcowych nuklco-tydów rozdzielonych w 75% roztworze etanolu

5.    Eluowanie nukleotydów. Prostokąty o jednakowej powierzchni, zawierające poszczególne nukleotydy oraz fragment bibuły nie zawierającej nukleotydów (próba odczynnikowa), wyciąć, pociąć na paski i zalać 5 ml 0,01 M roztworu HC1. Eluowanie przeprowadzić w temperaturze pokojowej w ciągu 6 godz. Następnie eluat przenieść do probówek wirówkowych i odwirować kłaczki bibuły.

6.    Spektrofotometryczne oznaczenie absorbancji eluatów i wyliczenie składu procentowego nukleotydów w preparacie RNA. Absorbancję eluatów w stosunku do próby odczynnikowej oznaczyć w spektrofotometrze w 1-cm kuwetach kwarcowych przy długości fali maksymalnej (dla danego nuklcotydu) oraz przy ). = 290 nm (dla CMP i UMP przy 300 nm).

Liczbę mikromoli nuklcotydu w 5 ml eluatu wyliczyć ze wzoru:

a = A/4 • 10⁴/fi‘ 2

418